DE3243919C2

DE3243919C2 - Kolorimetrievorrichtung

Info

Publication number: DE3243919C2
Application number: DE3243919A
Authority: DE
Inventors: Takashi Hachoji Tokio/Tokyo Yamada
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1981-11-28
Filing date: 1982-11-26
Publication date: 1986-03-27
Also published as: US4558953A; DE3243919A1; JPS5892844A

Abstract

Bei der auf dem Gebiet der Biochemie anzuwendenden Kolorimetrie wird die durchgelassene Lichtmenge, die in eine Lichtempfangsvorrichtung einfällt, in Abhängigkeit von der Extinktion eines zu verwendenden Reagens gemindert, indem eine Lichtmengeneinstellvorrichtung im Lichtweg angeordnet wird. Die Menge des durch eine Leerküvette hindurchgelassenen Lichts wird im wesentlichen gleich der durch das Reagens hindurchgelassenen Lichtmenge eingestellt. Wenn dann ein Posten analysiert wird, für den ein Reagens mit hoher Extinktion verwendet wird, beeinflußt die Abweichung der durchgelassenen Lichtmenge die gemessenen Extinktionswerte nicht, so daß die Kolorimetrie unabhängig von der Extinktion des Reagens auf exakte Weise durchgeführt werden kann.

Description

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Lösung dieser Aufgabe ist im Patentanspruch 1 gekennzeichnet.

Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen beschrieben.

Nachfolgend sind Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung näher beschrieben. Es zeigt

F i g. 1 Färbungskurven der Kolorimetrie von Glucose und Magnesium;

F i g. 2 ein erstes Ausführungsbeispiel einer Kolorimetrievorrichtung;

F i g. 3 und 4 verschiedene Ausgestaltungen der Kolorimetrievorrichtung.

Unter verschiedenen Proben mit einer insgesamt steigenden Tendenz der Extinktion zeigt die Kurve A in Fig. 1 den zeitlichen Extinktionsverlauf für Glucose, welche als Prüfposten mit einem Reagens von sehr niedriger Extinktion gewählt wurde, während eine Kurve ßdie Extinktionsschwankung für Magnesium wiedergibt, eine typische Probe, für die ein Reagens von hoher Extinktion benutzt wird. Hier werden beide der Lichtmessung mit einem Lichtstrom der Wellenlänge 500 nm ausgesetzt. Aus der folgenden Tabelle 1 geht die Durchlässigkeit und der Absorptionsgrad für die Lichtmessung nur des Reagens und für die Lichtmessung nach der Reaktion zwischen Proben und Reagens hervor.

Tabelle 1

Reagens nach Reaktion

Glucose

Durchlässigkeit 89,1% 14,1%

Extinktion 0,05 0,85

Magnesium

Durchlässigkeit 8,96% 6,31%

Extinktion 1,05 1,20

Die Extinktion gemäß Tabelle 1 wird mit Hilfe einer Formel log I₀ZI errechnet, worin I₀ die Stärke des einfallenden Lichtstroms und / die des durchgelassenen Lichtstroms ist. Wenn dann nur das zum Messen der Glucose verwendete Reagens einer Lichimessung unterzogen wird, wird die Extinktion dieses Reagens, da das einfallende Licht 100% und das durchgelasser.c Licht 89.1 % ausmacht, wie folgt errechnet:

lon 100/89.1 =0,05.

Nach der Umsetzung zwischen der Glucose und dem Reagens nimmt die Durchlässigkeit auf 14,1% ab. während die Extinktion auf 0,85 ansteigt. Wenn hier atigenommen wird, daß die Durchlässigkeit um 0,1% schwankt, das heißt die Durchlässigkeit 14,2% wird, wird die Extinktion

log 100/14,2 = 0,847.

Damit ist das Ausmaß der Abweichung der Extinktion
0,85 - 0,847 = 0,003.

Im Gegensatz dazu schwankt bei der Magnesiummessung die Durchlässigkeit um das gleiche Ausmaß von 0,1% und ändert sich von 6,31 % zu 6,41 Vo, während die Extinktion

log 100/6,41 ==1,193

ist Das bedeutet, daß das Ausmaß der Extinktionsabweichung 0,007 ist. Es zeigt sich also, daß die Abweichung bei der Extinktion für die Magnesiummessung größer ist als für die Glucosemessung.

Wenn bei der Lichtmessung anhand des Reagens davon ausgegangen wird, daß die Durchlässigkeit um 0,1 % schwankt, wird das Ausmaß der Abweichung der Extinktion bei der Glucosemessung 0,0005 und bei der Magnesiummessung 0.005. In diesem FaU ist also der Grad der Abweichung der Extinktion bei des' Magnesiummessung 10 mal größer als bei der Glucosemessung. Wird die Lichtmessung unter Verwendung eines Reagens von hoher Extinktion vorgenommen, so wird durch eine geringfügige Abweichung und einen kleinen Fehler bei der durchgelassenen Lichtmenge die Extinktionsmessung im Vergleich zu der Verwendung eines Reagens n:it geringer Extinktion stark beeinflußt, selbst wenn die 100%-Einstellung unter Verwendung des Reagens vorgenommen wird. Die Genauigkeit des Ergebnisses der Lichtmessung hangt also von den Präfposten ab.

Im Gegensatz dazu wird bei der Ultraviolettlichtmessung von GOT oder GPT die Extinktion nach der Reaktion zwischen der GOT oder GPT enthaltenden Probe und dem Reagens von hoher Extinktion, beispielsweise 1,0—1,5 im Vergleich zu der für das Reagens allein um 0,2—03 gesenkt. Im Extremfall wird die verringerte Größe des Absorptionsgrades nach der Reaktion 0,7—0,8. Wenn die Extinktion mit a angenommen wird, leitet sich aus der Gleichung

log /0// = a

die Gleichung

35 /=

ab. Wenn also die Extinktion um 03 verringert wird, erhöht sich die Menge des durchgelassenen Lichtstroms um 1/10—°³ (= 1"T⁰-³), das heißt etwa zweimal. Wenn die Extinktion um 0,5 bzw. 0,7 verringert wird, steigt in gleicher Weise die durchgelassene Lichtmenge um das dreifache (=10°·^ bzw. das fünffache (=10°·⁷). Da das Rauschverhältnis umso besser wird, je größer die durchgelassene Lichtmenge ist, wird die Exaktheit der Photometric entsprechend verbessert. Wenn aber die Schwankung der durchgelassenen Lichtmenge groß ist, wLs oben erwähnt, ändert sich das Rauschverhältnis entsprechend, das heißt die Genauigkeit schwankt, so daß die Kolorimetrie nicht stabil mit großer Exaktheit durchgeführt werden kann.

Bei dem in F i g. 2 gezeigten Ausfübrungsbeispiel gehört zu der Kolorimetrievorrichtung eine Lichtquelle 1, ein Kollimationslinsensystem 2 A, ein optischer Filter 3, ein Graufilter 4, der wahlweise in den Lichtweg einsetzbar ist, um die Lichtmenge zu verändern, eine Kondensorlinse 2 B, eine Sammellinse 2 Q eine für die Lichtmessung benutzte Küvette 5, in der eine Probe und ein Reagens enthalten ist, sowie eine Lichtmeßvorrichtung 6. Ferner ist zwiscVssn der Küvette 5 und der Lichtmeßvorrichtung 6 ein Lichtmengenabschwächer 7 angeordnet.

F i g. 3 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel eines Lic'htmengen-Abschwächers. der eine Scheibe 10 aufweist, in welcher eine Vielzahl von Blendenöffnungen 10a, \0b, 10c, Wd, 1Oe und 10/mit unterschiedlichen Radien längs eines Kreises ausgebildet ist, wobei alle Öffnungen eine Irisblende darstellen. Diese Blendenöffnungen haben verschiedene Durchlässigkeit, die so bestimmt sind, daß die durchgelassene Licbtmenge so groß ist, wb in der folgenden Tabelle 2 aufgeführt. In Tabelle 2 ist das Verhältnis der durchgetassenen Lichtmenge und der Extinktion auf der Basis der durchgelassenen Lichtmenge und Extinktion der größten Öffnung 10a angegeben. Das bedeutet, daß durch wahlweises Einschieben der Blendenöffnungen 10a bis 10/die Extinktion von 0,0 über 0,2,0,4,0,6,0,8 bis zu 1,0 gewählt werden kann.

Tabelle 2 Blendenöffnung

10a 10i> 10c 1Od 1Oe 10/

durchgelassene Lichtmenge in % 100 63,1 39,8 25,1 15.8 10,0 b5

f.xtinklion 0,0 0,2 0.4 0,6 0,8 1,0

Es wird bei der Einstellung der Durchlässigkeit auf 100%, das heißt der Einstellung auf Nullextinktion unter

Verwendung einer Leerküvette in den Lichtweg eine beliebige der Blendenöffnungen 10a bis lOAunter Berücksichtigung der Extinktion des zu verwendenden Reagens eingesetzt. Mit anderen Worten, wenn aufgrund der Reaktion die Extinktion steigt, wird vorzugsweise die Blendenöffnung so gewählt, daß die durch die Leerküvette und die entsprechende öffnung hindurchgelassene Lichtmenge etwas geringer ist als die durch die das Reagens enthaltende Küvette und die Öffnung 10a hindurchgelassene Lichtmenge. Wenn im Gegensatz dazu aufgrund der Reaktion die Extinktion abnimmt, wird der gewünschte Filter so gewählt, daß die durch die Leerküvette und die entsprechende öffnung hindurchgelassene Lichtmenge etwas geringer ist als die durch die das Reagens enthaltende Küvette und die größte öffnung 10a hindurchgelassene Lichtmenge. Im allgemeinen kann die gewünschte Blendenöffnung im voraus für die jeweiligen Prüfposten bestimmt werden, während sich im Verlauf ίο der Reaktion die Extinktionen, die Richtung ihrer Änderung, das heißt Zunahme oder Abnahme und der Absorptionsgrad ändern.

Die Funktion der Vu'richtung soll anhand einiger Beispiele näher erläutert werden.

Beispiel 1

Wenn an einem Posten unter Verwendung eines Reagens von geringer Extinktion eine Analyse vorgenommen « werden soll, zum Beispiel Glucose gemäß Kurve A in Fig. 1, wird zunächst die größte öffnung 10a mit einem

Verhältnis vor !00% (Extinktion 0,0) in den Liehtweg eingesetzt und die Kolorimetrie (Messung der Extinktion) auf normale Weise vorgenommen. Da hierbei die Extinktion des Reagens gering ist, wird die Messung des Reagens durch eine geringfügige Abweichung und einen kleinen Fehler bei der durchgelassenen Lichimengc kaum beeinflußt. Nach dem Einstellen der Blendenöffnung 10a mit einer Extinktion von 0,0 wird die 100%-Einstellung für den druchgelassenen Lichtstrom anhand der Leerküvette durchgeführt, die Wasser oder nichts enthält. Dann wird das Reagens in die Küvette eingefüllt und die Messung des Absorptionsgrades des Reagens in einem Zeitpunkt fi vorgenommen, um den Extinktionswert Ar des Reagens zu erhalten. Als nächstes wird im Zeitpunkt ο die Probenlösung in die Küvette gefüllt und dann in einem Zeitpunkt i3. wenn die Probenlösung nach der Umsetzung mit dem Reagens einen stationären Zustand erreicht hat, die Extinktionsmessung der umgesetzten Lösung vorgenommen, um den Extinktionswert A ν für die umgesetzte Lösung zu erhalten. Schließlich wird der Extinktionswert At für den Prüfposten A von der Formel (Av-Ar) abgeleitet. Die vorstehend erwähnten Prozesse werden elektrisch mit Hilfe eines Prozessors durchgeführt, der die von der Lichtmeßvorrichtung 6 gelieferten elektrischen Ausgangssignale verarbeitet.

Beispiel 2

Wenn unter Verwendung eines Reagens mit hoher Extinktion eine Analyse vorgenommen werden soll, zum Beispiel für Magnesium gemäß Kurve θ in Fig. 1, wird zunächst die 100%-Einstellung an der Leerküvette vorgenommen, wobei die kleinste Blendenöffnung 10/in den Lichtweg eingesetzt wird. Hierbei ist die durch die Leerküvette und die Blendenöffnung 10/hindurchgelassene Lichtmenge etwas kleiner als die durch das Reagens zur Verwendung bei der Magnesiumanalyse und die größte Öffnung 10a hindurchgelassene Lichtmenge. Da bei der Magnesiumanalyse die Extinktion eine zunehmende Färbung im Verlauf der Reaktion zeigt, ist der Extinktionswert der Blendenöffnung 10/" etwas niedriger eingestellt als die Extinktion des Reagens. Auf diese Weise erfolgt die 100%-Einstellung. während die Blendenöffnung i0f (Extinktion 1,0) in den Lichtweg eingesetzt ist. Wenn also in diesem Fall die Einstellung auf 100% für die Leerküvette durchgeführt wird, fällt auf die Lichtempfangsvorrichtung 6 nur 10% des Lichtstroms im Verhältnis zu der durch die größte Blendenöffnung 10a hindurchgelassenen Standardüchtmenge.

Danach wird allein das Reagens in die Küvette gefüllt und im Zeitpunkt f| der Absorptionsgrad des Reagens einer Lichtmessung unterzogen, während die größte Blendenöffnung 10a mit der Extinktion 0,0 in den Lichtweg eingesetzt ist. Beim herkömmlichen Kolorimetrieverfahren für die Magnesiumanalyse ist der Extinktionswert des Reagens Br 1,05 und die durchgelassene Lichtmenge beträgt 8,91 %. Da jedoch die Kolorimetrievorrichtung unter Verwendung des 10%-Lichtstroms in bezug auf die voll geöffnete Blendenöffnung 10a von 100% geeicht

so wird, wird als dur:hgelassene Lichtmenge bzw. Extinktionswert des Reagens Bs 89,1 % bzw. 0,05 gemessen.

Als nächstes wird im Zeitpunkt ti die Probenlösung in die Küvette gefüllt und dann im Zeitpunkt ft, wenn die Probenlösung nach der Umsetzung mit dem Reagens einen stationären Zustand erreicht hat, die Extinktion der umgesetzten Lösung einer Lichtmessung unterzogen, wobei die größte Blendenöffnung 10a im Lichtweg bleibt. Beim herkömmlichen Kolorimetrieverfahren ergibt sich bei der Lichtmessung der durchgelassenen Lichtmenge und der Extinktion der Probenlösung nach der Reaktion 631% bzw. 1,20 (siehe Tabelle 1); aber es werden folgende Werte festgestellt: 63,1% bzw. 02 (Bv)- Dementsprechend wird der Extinktionswert or für Magnesium abgeleitet aus (Bv— Bs). Wenn die Lichtmessung der durchgelassenen Lichtmenge einen Wert von 63,1 % ergibt, ist die entsprechende Abweichung der Extinktion, selbst wenn die durchgelassene Lichtmenge um 0,1% schwankt, nur 0,001, und diese Abweichung von 0,001 ist außerordentlich klein im Vergleich zu der bei der herkömmlichen Kolorimetrie erhaltenen von 0,007. Gemäß der Erfindung wird also der Lichtmeßwert durch eine Abweichung und einen Fehler beim durchgelassenen Lichtstrom nicht wesentlich beeinflußt

Beispiel 3

Wenn für einen Posten wie GOT und GPT eine Lichtmessung vorgenommen werden soll, für die die Extinktion entsprechend der Umsetzung mit dem Reagens eine abnehmende Färbungscharakteristik zeigt, erfolgt die 100%-Einstellung des durchgelassenen Uchtstroms für die Leerküvette unter Berücksichtigung der Extinktion des Reagens und der Extinktionsabweichung der umgesetzten Probenlösung. Mit anderen Worten heißt das, daß

die gewünschte Blendenöffnung so gewählt wird, daß die durch die Lcerküvctte und die entsprechende Blendenöffnung hindurchgelassene Lichtmenge etwas kleiner ist ills die Lichtmenge, die durch die umgesetzte Lösung und die größte Blendenöffnung 10.7 hindurchgelassen wird. Anschließend wird die Lichtmessung in der gleichen Weise wie bei den Beispielen 1 und 2 fortgeführt.

In F i g. 4 ist ein weiteres Ausführungsbeispiel eines Lichtmengen-Abschwächers 7 gezeigt. In diesem Fall wird die durchgelassene Lichtmenge nicht von der Fläche der öffnungen sondern von der optischen Dichte oder Schwärzung bestimmt. Zu diesem Lichtmengen-Abschwächer gehört eine drehbare Scheibe 20 mit einer Vielzahl von längs eines Kreises angeordneten Graufiltern 20a bis 20/ Um die verschiedenen Extinktionswerte gemäß Tabelle 2 zu erhalten, haben in diesem Fall die Graufilter 20a bis 20/unterschiedliche Dichten.

Bei den Ausführungsbeispielen gemäß Fig.3 und 4 kann jede beliebige der Blendenöffnungen oder Filter wahlweise durch Drehen der Scheibe 10 bzw. 20 mittels einer herkömmlichen Antriebsvorrichtung, beispielsweise eines Motors in den Weg des Lichtes eingesetzt werden. Es sei noch erwähnt, daß es auch möglich ist. eine Irisblende zu verwenden, wie sie in herkömmlichen Kameras weit verbreitet ist. Um jedoch die durchgelassene Lichtmenge exakt steuern zu können, scheinen die in F i g. 3 und 4 gezeigten Scheiben 10 und 20 vorteilhafter zu sein als die Irisblende einer Kamera.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

10 20 Patentansprüche:

1. Kolorimetrievorrichtung für die quantitative Analyse von mit Reagenzien versehenen Proben in Küvetten, mit einer Lichtquelle zum Durchstrahlen der Küvette, einer Lichtmeßvorrichtung, die den durch die Küvette hindurchgelassenen Lichtstrahl empfängt, und mit einer Einrichtung zum Anpassen der Meßsignale an die Absorptionsbedingungen des Reagens, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zum Anpassen der Meßsignale als Lichtmengen-Abschwächer (7,10,20) ausgebildet und im Lichtweg zwischen der Küvette (5) und der Lichtmeßvorrichtung (6) angeordnet ist und daß der Lichtmengen-Abschwächer (7, 10,20) abstufbar ausgelegt ist, um die auf die Lichtmeßvorrichtung auftreffende Lichtmenge so zu variieren, daß die durch eine Leer-Küvette und den Lichtmengen-Abschwächer hindurchgelassene Lichtmenge angenähert gleich der durch die mit dem Reagens gefüllten Küvette hindurchgelassenen Lichtmenge ist

2. Kolorimetrievorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtmengen-Abschwächer als eine drehbare Scheibe (10) mit einer Vielzahl von Blendenöffnungen (10a—10/? mit unterschiedlichem Durchmesser ausgebildet ist.

3. Kolorimetrievorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtmengen-Abschwächer als drehbare Scheibe (20) mit einer Vielzahl von Graufiltern (20a—20$ mit unterschiedlichem Durchlässigkeitsgrad ausgebildet ist

4. Kolorimetrievorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtmengta-Abschwächer (7, 10, 20) Durchlässigkeitsgrade von 100%, 63,1%, 39,8%, 25,1%, 15,8% und 10,0% aufweist

30

40 45 50 55 eo b5

Die Erfindung betrifft eine Kolorimetrievorrichtung für die quantitative Analyse von mit Reagenzien versehenen Proben in Küvetten mit den Merkmalen des Oberbegriffes des Patentanspruches 1.

Eine derartige Kolorimetrievorrichtung ist aus der CH-PS 5 37 583 bekannt Aus dem Lehrbuch von Gustav Kortüm: »Kolorimetrie, Photometrie und Spektrometrie«, Springen Verlag, 4. AufL, 1962, S. 222—227, ist es bekannt, die Extinktion einer Lösung dadurch mit erhöhter Genauigkeit zu messen, daß nicht der Absolutwert der Gesamtextinktion der Lösung bestimmt wird, sondern eine Extinktionsaifferenz gegenüber einer Vergleichslösung bekannter Konzentration. Auf diese Weise brauchen nicht geringe Schwankungen von relativ großen Absolutwerten festgesteiit zu werden, bei denen nur ein kleiner Skalenbereich des Meßinstrumentes ausgenutzt wird, sondern es brauchen nur relative Verschiebungen gegenüber einem bekannten Extinktionswert bestimmt zu werden, wobei der gesamte Skalenbereich überstrichen wird.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine gattungsgemäße Koiorimetrievorrichtung zu schaffen, mit welcher eine hohe Meßgenauigkeit mit einfachen Mitteln erzielbar ist.