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Beschreibung
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Alkaloid, welches aus
Pflanzenzellkulturen von Picralima nitida erhalten wird.
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Picralima nitida ist ein Mitglied der Familie der Apocyna ceae, die
sehr viele Indolalkaloid produzierende Arten enthält (A.J.M.Leeuwenberg et al.,
in: Indol and biogenetically related alkaloides, Academic Press 1980, ZENKs M.H.
et al., Edit.). Picralima nitida ist ein Laubbaum, welcher bis zu 20 m Höhe erreicht
und in Afrika sein Hauptverbreitungsgebiet hat. Die Rinde, Wurzeln und Samen wurden
in der Volksmedizin bei Erkältungen, die Früchte bei Malaria (E.S.Ayensu, The medical
plants of west-africa, p. 49, St. Claire Drive 1978, Ref. Pub. Inc.) eingesetzt.
Die Samen zeigen ZNS-Aktivität (M.C.Appert-CollinSLevy et al., Therapie 23, 1087-98,
1968).
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Seit vielen Jahren ist es bekannt, daß Pflanzenzellen unabhängig von
der ganzen Pflanze, durch Züchtung des Zellmaterials unter ähnlichen Bedingungen
wie zur Züchtung von Mikroorganismen für die Produktion von Antibiotica, vermehrt
werden können. Solche Pflanzenzellkulturen sind potentielle Quellen für chemische
Pflanzenmetaboliten, die in der intakten Pflanze gar nicht oder nur in sehr geringen
Konzentrationen vorkommen.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Produktion von neuen Alkaloiden
mit interessanten pharmakologischen Eigenschaften, die als Pflaazenmetaboliten aus
der intakten Pflanze nicht gewonnen werden können.
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Es wurde nun überraschend gefunden, daß man aus Zellsuspensionskulturen
von Picralima nitida ein neues Alkaloid gewinnen kann, welches analgetische, antimikrobielle,
anticarcinogene und blutdrucksenkende Wirkung zeigt.
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Das neue Alkaloid (5-Ethyliden-1,4,5,6,7,8-hexahydro-7-met len-2H-3,6-ethanoazonino/5,4-b/indol)
(im folgenden Text als Alkaloid D 3 bezeichnet) hat die folgende Struktur:
Zur Gewinnung des Alkaloids B3 werden Teile und Explantate von Picralima-nitida-Keinilingen,
vorzugsweise etiolierte Keimlinge, auf Induktionsmedium unter aseptischen Kulturbedingungen
zur Erzeugung von Kalluskulturen aufgelegt.
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Das Induktionsmedium besteht aus Mineralsalzen wie Natriumdihydrogenphosphat
50-500 mg/11 -vorzugsweise 150 mg/l, Kaliumnitrat 400-1200 mg/l, vorzugsweise 800
mg/l, Magnesiumsulfat 100-400 mg/l, vorzugsweise 250mg/l, Kaliumchlorid 100-500
mg/l, vorzugsweise 200 mg/l, Kalziumchlorid 100-450 mg/l, vorzugsweise 200 mg/l,
Ammoniumsulfat 0-200 mg/l, vorzugsweise 100 mg/l, Dinatriumhydrogenphosphat 0-50
mg/l, vorzugsweise 25 mol, Borsäure 0-10 mg/l, vorzugsweise
5 mg/l,
Mangansulfat 0-10 mg/l, vorzugsweise 4 mg/l, Zinksulfat 0-4 mg/l, vorzugsweise 1,5
mg/l, Kupfersulfat O-lmg/l, vorzugsweise 0,25 mg/l, Natriummolybdat 0-0,5 mg/l,
vorzugsweise 0,25 mg/l, Kobaldchlorid 0-4 mg/l, vorzugsweise 0>25 mg/l, Kaliumjodid
0-0,1 mg/la vorzugsweise 0,05 mg/l; Komplexbildnern wie Ethylendinitrilotetraessigsäure
(Titriplex IIIR) 0-50 mgil, vorzugsweise 18,6mg/l und Eisensulfat 0-30 mg/l, vorzugsweise
13,9 mg/l; und Vitaminen und organischen Substanzen wie meso-Inosit 0-150 mg/l,
vorzugsweise 100 mg/l, Nikotinsäure 0-3 mg/l, vorzugsweise 1,25 mg/l, Panthotenat
0-4 mgl, vorzugsweise 1 mg/l, Vitamin Bi~Hydrochlorid 0-2 mg/l, vorzugsweise 0,5
mg/l, Vitamin B6-Hydrochlorid 0-2 mg/l, vorzugsweise 0,5 mg/l, NZ-Amine (Typ A)
0-5 g/l, vorzugsweise 2 g/l, und Phytohormonen wie Auxine, besonders 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure
O-5 mg/l, vorzugsweise 1,5 mg/l, Indolessigsäure 0-3 mg/l, vorzugsweise 1 mg/l,
Naphthylessigsäure 0-2 mg/l, vorzugsweise 0,1 mg/l und Cytokinine, besonders Kinetin
0-2 mg/l, vorzugsweise 1 mg/l und Kohlenhydraten, insbesondere Saccharose 10-100
g/l, vorzugsweise 20 g/l.
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Zur Verfestigung des Mediums wird Agar-Agar hinzugegeben 0,5-2 g/l,
vorzugsweise 1 g/l. Der pH-Wert des fertigen Mediums liegt zwischen 4 und 7, vorzugsweise
pH 4,5 - einzustellen mit KOH und HCL.
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Diese so erzeugten Kalluskulturen wurden unter konstanten Kultivierungsbedingungen
bei einer Temperatur von 230C -28"C, vorzugsweise bei 250C w 100. bei einer Beleuchtung
von 0-500 Lux-von Leuchtstoffröhren (Fa. Osram), Weißlicht und FluoraR-Licht, vor2ugsweise
bei 100 Lux Licht von Fluora-Leuchtstoffröhren, lebend erhalten.
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-Von den Källuskulturen werden Zellsuspensionskulturen, vorzugsweise
annähernd Einzelzell-Suspensionskulturen im Induktionsmedium, Jedoch ohne Agar-Zusatz,
im folgenden als Erhaltungsmedium benannt, angelegt. Nach der Adaption der Zellen
auf die geänderte Kultivierungsart wird ein Produktionsmedium für das Alkaloid selektiert.
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Das Produktionsmedium besteht aus Mineralsalzen, wie Kaliumnitrat
500-1500 mg/l, vorzugsweise 950 mg/l,Ammoniumnitrat 400-1000 mg/t, vorzugsweise
720 mg/l, Magnesiumsulfat 50-300 mg/l, vorzugsweise 185 mg/l, Kalziumchlorid 50
300 mg/l, vorzugsweise 166 mg/l, Kaliumdihydrogenphosphat 10-100 mq/l, vorzugsweise
68 mg/l, Mangansulfat 0-10 mg/l, vorzugsweise 7 mg/l, Borsäure 0-10 mg/l, vorzugsweise
2,4 mg/l, Zinksulfat 0-12 mg/l, vorzugsweise 4 mg/l, Kaliumjodid 0-2 mg/l, vorzugsweise
0,4 mg/l, Ammoniumheptamoylbdat 0-0,5 mg/l, vorzugsweise 0,09 m/l, Kupfersulfat
O-O,lmg/l, vorzugsweise 0,01 mg/l; Komplexbildnern, wie Ethylendinitrilotetraessigsäure-Dinatriumsalz
(Titriplex 111R) 0-50 mg/l, vorzugsweise 37 mg/l, und Eisensulfat 0-50 mg/l, vorzugsweise
28 mg/l, und Vitaminen und organischen Substanzen, wie Glycin 0-100 mg/l, vorzugsweise
2 mg/l, meso-Inosit 0-150 mg/l, vorzugsweise 100 mg/l, Nikotinsäure 0-10 mg/l, vorzugsweise
5 mull, Vitamin B6-Hydrochlorid 0-1 mg/l, vorzugsweise 0,5 mg/l, Vitamin Bi-Hydrochlorid
0-1 mg/l, vorzugsweise 0,5 mg/l, Biotin 0-0,1 mg/l, vorzugsweise 0,5mg/l, Folsäure
0-1,5 mg/l, vorzugsweise 0,5 mg/l, und Phytohormonen, vorzugsweise Cytokinine und
besonders N6-Benzyladenin 0,2-2 mg/l, vorzugsweise 1,13 mg/l, und Auxine, vorzugsweise
Indolessigsäure 0-2 mg/l, vorzugsweise 0,17mg/l, und Kohlenhydrate, besonders Saccharose
10-100 g/l, vorzugsweise 50 g/l. Der pH-Wert liegt zwischen 5-7, vorzugsweise pH
6, einzustellen mit KOH oder HCl. Sämtliche Mediumkomponenten werden gelöst oder
suspendiert, in einer wässrigen Vorlage vereinigt, titriert und auf das Endvolumen
aufgefüllt. Die portionierten Medien werden zur Sterilisation bei 121°C, lbar 25
min lang autoklaviert.
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Die Alkaloidbildung der Substanz D3 wird in einem Zweistufen-Prozeß
induziert, indem die Zellen der Suspensionskultur des D3-bildenden Kulturstammes
von Picralima nitida vom Erhaltungsmedium (identisch mit dem Induktionsmedium, jedoch
ohne Agar-Zusatz) in das Produktionsmedium (s.oben) als Inokulum überführt werden.
Die Zellmasse kann geerntet werden nach Alkaloidbildung, vorzugsweise nach Verbrauch
der Kohlenhydratquelle.
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Die pharmakologischeWirkung des Alkaloids wurde wie folgt geprüft:
Die analgetische Wirkung wurde mit Hilfe der Radioreceptorassay-Methode bestimmt.
(Tab. 1).
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Die pharmakologische Wirkung des Alkaloids D3 wurde in Verdrängungsexperimenten
an Opiatrezeptorpräparationen festgestellt (Pert und Snyder,Mol. Pharmacol., 10,
868-79, 1974).
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Durch Variation des Inkubationsmediums ließ sich eine morphin- agonistische
(analgetisch) Wirkung aufzeigen. Dieser morphinagonistische Effekt wurde im Tierexperiment
bestätigt.
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Tab. 1: Substratspezifität spezifischer 39-Naloxon Bindung Displacer
IC50-Werte nMol/l 8 mMol/l NaCl 120 mMol/l NaCl +) Naloxone 4.5 0.4 5.1 0.2 1.1
Nalorphine 14*0 t 0.5 11.0- 0,4 0.8 Morphine 25.5 2.5 670 +- 31 20.3 Codeine 3,900
15,000 +- 3.9 Leu-Enkephalin 20 i00 5.0 Alkaloid D3 625 + 75 4.000 + 100 5.4 Pericalline
2.250 + 250 13,000 + 200 5.7 + Natrium-shift - IC50 Wert +NaCl/-NaCl Die antibakterielle
Wirksamkeit wurde bestimmt (Tab. 2), indem das Alkaloid D3 an 32 verschiedenen Mikroorganismenstämmen
in 9 verschiedenen Konzentrationen (Verdünnungsreibe) im Agar-DiffusionsTest getestet
wurde. Die höchste Einzeldosis war hierbei 100 pg/plaque.
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Tabelle 2 Antibakterielle Wirksamkeit von 5-Ethyliden-1,4,5,6,7,8-hexahydro-7-methylen-2H-3,6-ethanoazonino/5,4-b/indol.
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MHK'= Minimale Hemmkonzentration in pg/ml.
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Testkeim Nähr- MHK nach boden 1 2 5 - Tagen Streptococcus pyogenes
BC Iso-B. 1000 Micrococcus spec. 250 Micrococcus luteus 1000 Streptococcus pyogenes
II 15,6 Staphylococcus epidermidis BC 500 1000 Staphylococcus aureus BC 500 Staphylococcus
aureus ATCC 500 Streptococcus faecalis 8043 .500 1000 Candida albicans ATCC 250
Sproßpilz 1,95 Candida tropicalis 1000 Hefe 30 Escherichia coli ATCC 1000 Klebsiella
pneumoniae BC 1000 Pseudomonas aeruginosa ATCC 1000 Klebsiella Pneumoniae Neo +
1000 Escherichia coli Carbeni 1000 Salmonella typhi murium BC 1000 Enterobacter
cloacae BC 1000 Shigella sonn-ei BC 500 1000 Candida albic.ans ATCC Sab-B. 250 500
Sproßpilz 841 500 Candida tropicalis 500 100.0 Hefe 30 Escherichia coli ATCC Mini-M.
250 Klebsiella pneumoniae BC 250 Pseudomonas aeruginosa ATCC 500 1000 Klebsiella
pneumoniae Neo + 250 Escherichia coli Carbeni Salmonella typhi murium BC 250 Enterobacter
cloacae BC 250 Shigella sonnei BC 62,5 125 Ausgangskonzentration: 1000 pg/ml
Das
neue Alkaloid kann leicht zu pharmazeutischen Präparaten verarbeitet werden, indem
eine wirksame Menge der Aktivsubstand zusammen oder im Gemisch mit organischen oder
anorganischen, festen oder flüssigen, pharmazeutisch verwendbaren Trägerstoffen,
die sich enteral oder parenteral verabreichen lassen, gemischt werden.
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So verwendet man Tabletten oder Gelatinekapseln, welche den Wirkstoff
zusammen mit Verdünnungsmitteln, wie z.B.
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Lactose, Dextrose, Sucrose, Mannitol, Sorbitol, Cellulose und/oder
Glycerin und Schmiermittel, z.B.Kieselerdes Talg, Stearinsäure oder Salze davon,
wie Magnesium oder Calciumstearat und/oder Polyethylenglykol, aufweisen.
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Tabletten enthalten ebenfalls Bindemittel, z.B, Magnesium, Aluminiumsilikat,
Stärke, wie Mais, Weizen, Reis, Gelatine, Methylcellulose, Natrium, Carboxymethylcellulose
und/oder Polyvinylpyrrolidon und, wenn erwünscht, Sprengmittel, z.B. Stärken, Agar,
Alginsäure oder ein Salz davon, wie Natriumalginat, und/oder Brausemischungen oder
Adsorpti onsmittel, Farbstoffe, Geschmacksstoffe und Süßmittel.
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Ferner kann man das Alkaloid in Form von injizierbaren, z.B. intravenös
verabreichbaren Präparaten oder Infusionslösungen einsetzen. Solche Lösungen sind
vorzugsweise isotonische wässrige Lösungen oder Suspensionen, wobei diese z.B. aus
lyophilisierten Präparaten, welche die Wirksubstanz allein oder zusammen mit einem
Trägermaterial enthalten, vor Gebrauch hergestellt werden können* Die pharmazeutischen
Präparate können in an sich bekannter Weise, z.B. mittels konventioneller Misch-,
Granulier-, Dragier-, Lösungs- oder Lyophilisierungsverfahren, hergestellt werden
Beispiel
1 Anlegen der Zellkulturen.
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Samen von. Picralima nitida werden unter sterilen Bedingungen im Dunkeln
angekeimt. Von Teilen und Explantaten etiolierter Keimlinge werden auf Induktionsmedium,
bestehend aus Kaliumnitrat 800 mg/l, Magnesiumsulfat 250 mg/l, Kaliumchlorid 200
m/l, Kalziumchlorid 200 mg/l, Natriumdihydrogenphosphat 150 mg/l, Ammoniumsulfat
100 mo/l, Dinatriumhydrogen phosphat 25 mg/l, Titriplex IIIR 18,6 mg/l, Eisensulfat
13,9 mg/l, Borsäure 5 mg/l, Mangansulfat 4 mg/l, Zinksulfat 1,5 mg/l, Kupfersulfat
0,25 mg/l, Natriummolybdat o,25 mg/l, Kobaldchlorid 0,25 mg/l, Kaliumjodid 0,05
mg/l, meso-Inosit 100 mg/l, Nikotinsäure 1,25 m/l, Panthotenat 1 mg/l, Vitamin Bi
0,5 mg/l, Vitamin B6 0>5 mg/l, NZ-Amine (Typ A) 2g/l, Indolessigsäure 1 mg/l,
2,4-Dichlorphenoxyessigsäure 1,5mg/l, Naphthylessigsäure 0,1 mg/l, Kinetin 1 mg/l,
Saccharose 20 g/l und Agar 10 g/l, aufgelegt und Kalluskulturen erzeugt.
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Die Kulturen werden unter konstanten Kultivierungsbedingungen lebend
erhalten (Temperatur 25OC+ 1°C, ca. 100 Lux FluoraR -Licht, Uberimpfcyclus: 28 Tage).
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Von den Kalli werden Zellsuspensionskulturen im Erhaltungsmedium (Induktionsmedium,
jedoch ohne Agar-Zusatz) angelegt unter ebenfalls konstanten Kultivierungsbedingungen
(Temperatur 25"C + 1°C, 100 Lux, Fluora R -Licht, Erlenmeyer-Glas kolben gefüllt
mit Medium 25 % (V/V), auf dem Kreisschüttler 150 UpM mit 5 cm Exentrizität, alle
7 Tage überimpft in frisches Medium mit gleicher Inokulum-Verdünnung von 1:3) gezüchtet.
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Nach Adaption der Zellen auf die geänderte Kultivierungsart wird ein
Produktionsmedium für das Alkaloid D3 entwickelt.
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Das Produktionsmedium besteht aus Kaliumnitrat 950 mg/l, Ammoniumnitrat
720 mg/l, Magnesiumsulfat 185 mg/l, Kalziumchlorid 166 mg/l, Kaliumdihydrogenphosphat
68 mg/l, Titriplex IIIr 3j,3 mg/l, Eisensulfat 27,8 mg/l, Mangansulfat 7 mg/l, Zinksulfat
4 mg/l, Borsäure 2,4 mg/l, Kaliumjodid 0,37 mg/l, Ammoniumheptamolybdat 0,09 mg/l,
Kupfersulfat 0,01 mg/l, meso-Inosit 100 mg/l, Nikotinsäure 5 mg/l
Glycin
2 mg/l, Folsäure 0,5 mg/l, Vitamin B1 0,5 mg/l, Vitamin B6 0a5 mg/l, Biotin 0,05
mq/l, 6-Benzyladenin 1,13 mg/l, Indolessigsäure 0,17 mq/l und Saccharose 50 g/l.
Das Medium hat einen pH von 6. Die Alkalojd-D3-Bildung wird induziert, indem die
Zellen der Picralima nitida-Suspensionskultur vom Erhaltungsmedium in das Produktionsmedium
überführt werden als Inokulum in einer Verdünnung von i:3. Nach Verbrauch der Saccharose
wird die Zellmasse geerntet. Die gefriergetrocknete Zellmasse stellt das Ausgangsmaterial
für die Alkaloid-D3-Isolierung dar.
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Beispiel 2 Verfahren zur Gewinnung des Alkaloids.
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Zu mehreren parallelen Ansätzen werden jeweils 500 g -gefriergetrocknetes
Picralima nitida Zellmasse (Alkaloid-D3 Gehalt = 0sO88 % = 440 mg) im Vielzweckextraktor
10 Stunden lang mit 15 1 Methanol extrahiert.
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Der methanolische Extrakt wird auf ein Volumen von 2 Litern am Rotationsverdampfer
eingeengt. Ausgefallenes Material wird durch Filtration abgetrennt. Der eingeengte
Extrakt wird mit 18 1 Wasser zu einer 10 % methanolischen Lösung verdünnt, die auf
eine Säule (1000 mm x 150 mm i.d.) mit 3000 g XAD-2 (300p- 1000g) aufgetragen wird,
um die Primärmetaboliten abzutrennen. Das XAD-2 Adsorberharz wird mit 10 1 Wasser
gewaschen und die Alkaloid-D3-haltige Fraktion mit 3 l Methanol eluiert.
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Ausbeute: 41,5 g, davon 0,92 % Alkaloid D3 ^ 382 mg.
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Anschließend wird die methanolische Lösung auf ein Volumen von 100
ml am Rotationsverdampfer eingeengt und auf einer Säule (1000 mm x 50 mm i.d.) mit
1000 g Lichroprep RP8 (40 - 63 pm) chromatographiert. Danach wird das Adsorberharz
mit 5 l 60% Methanol gewaschen und die Alkaloid-haltige Fraktion mit 3 1 100% Methanol
eluiert. Die methanolische Lösung wird am Rotationsverdampfer zur trockne eingeengt.
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Ausbeute: 2,0 g, davon 15,4 % Alkaloid D3 = 308 mg.
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Je 1 g dieser Fraktion wird in 10 ml Methanol gelöst und mittels präparativer
Hochdruckflüssigkeitschromatographie an einer Lichroprep RP 18 Säule chromatographiert.
Eluiert wird mit einer 0,01 m Ammoniumacetatlösung (pH 8 mit Triethylamin) und Methanol
als organische Phase. Zur Trennung wird ein linearer Gradient von 60 % bis 100 %
Methanol benutzt.
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Die Alkaloid D3-Fraktionen werden vereinigt, mit H20 auf 10% Methanol
verdünnt und zur Abtrennung des Ammoniumacetats und Triethylamins auf eine Säule
mit 50 g XAD-2 (100p"200p) aufgetragen. Das Adsorberharz wird mit 1 1 Wasser gewaschen
und das Alkaloid D3 mit 100 ml Methanol eluiert. Die methanolische Lösung wird am
Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt.
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Ausbeute: 240 mg Alkaloid D3 = 54,5 % der theoretischen Ausbeute.
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Das Alkaloid D 3 wird aus 5 ml Aceton umkristallisiert. Die Kristalle
werden mit einem Glasfaserfilter abgetrennt, mit eiskaltem Aceton gewaschen und
anschließend im Vakuum getrocknet.
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Ausbeute: Aus jeweils 0,5 kg Zelltrockenmasse werden so 205 mg Alkaloid
D3 = 46,5 % der theoretischen Ausbeute gewonnen.
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Beispiel 3 20 mg Alkaloid werden in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung,
ggfs. unter Zusatz eines Lösungsvermittlers, gelöst.
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Man sterilisiert durch Membran-Filtration und füllt unter sterilen
Bedingungen in eine Ampulle.
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Beispiel 4 Tabletten.
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30 mg Alkaloid, 150 mg mikrokristalline Cellulose, 50mg Aerosil, 15
mg Cutina HR, 20 mg Hydroxypropylmethylcellulose-phthalat (HPMCP).
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Die aufgeführten Stoffe werden gemischt, gepreßt und die Preßlinge
mit einet Film HPMCP überzogen.
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Beispiel 5 Kapseln: 50 mg Alkaloid, 5 mg Talku, 10 mg Aerosil 200
werden gemischt, granuliert und in Hartgelatinekapseln abgefüllt.