DE3226914A1

DE3226914A1 - Verfahren und vorrichtung zum scharfeinstellen eines elektronenmikroskops

Info

Publication number: DE3226914A1
Application number: DE19823226914
Authority: DE
Inventors: Kohei Akikawa Tokyo Shirota
Original assignee: International Precision Inc Hachiohji Tokyo; INTERNATIONAL PRECISION Inc
Current assignee: Akashi Seisakusho KK
Priority date: 1981-07-17
Filing date: 1982-07-19
Publication date: 1983-02-03
Also published as: JPS5814460A; US4724319A

Description

32269U

PATENTANWÄLTE ZENZ & HELBER · D 4300 ESSEN 1 · AM RUHRSTEIN 1 ■ TEL.: (02 01) 4126 Seite - 2T^ Lf. ^ I

INTERNATIONAL PRECISION INCORPORATED 29-19, Akatsuki-cho 1—chome, Hachiohji—shi, Tokyo,Japan

Verfahren und Vorrichtung zum Scharfeinstellen eines Elek tronenmikroskops

Die Erfindung richtet sich, ganz allgemein gesagt, auf ein Verfahren zur Scharfeinstellung eines Elektronenmikroskops· Insbesondere betrifft die Erfindung ein Transmissions—Elektronenmikroskop mit einer photographischen Aufzeichnungseinrichtung, welches die Betrachtung und Aufzeichnung des Bildes einer Probe sehr viel einfacher gestattet und dabei eine verbesserte Bildqualität sicherstellt, und zwar durch ein eingebautes automatisches Scharfeinstellungssystem, welches so ausgelegt ist, daß es für eine vorgewählte Vergrößerung Fokusabweichungen auf einen zulässigen Bereich beschränkt. Dies gilt insbesondere für mäßige und kleine Vergrößerungen.

Die photographische Aufzeichnung eines Probenbildes, das durch ein Transmissions-Elektronenmikroskop erzeugt wird, stellt eine mühsame Tätigkeit dar, die ein hohes Maß an Sachkunde erfordert· Es ist zweifelsfrei mühselig, das betrachtete Bild wunschgemäß richtig scharf einzustellen, wenn es auf einem fluoreszierenden Bildschirm erzeugt wird, der normalerweise eine schlechte Auflösung liefert. Dies läßt sich daraus erklären, daß die Vergrößerung,

H/ko.

32269U

- sr-

- S-

mit der das Bild auf dem Schirm erzeugt wird, 10 bis 30 % kleiner als diejenige Vergrößerung ist, mit der das Bild auf einen photographischen Film projiziert wird, und daß die Auflösung des Films in der Größenordnung von 10 bis 40 yum liegt, während der fluoreszierende Bildschirm eine Auflösung in der Größenordnung von 50 bis 100 /um liefert. Unter diesen Umständen wird selbst ein Bild, das scharf und klar auf dem Schirm sichtbar ist, oft zu einem unscharfen Bild, wenn es auf dem Film photographisch aufgezeichnet wird·

Außerdem besteht bekanntlich die Gefahr, daß eine biologische Probe durch den Elektronenstrahl leidet, wobei die eigentliche Struktur der Probe zerstört werden kann, so daß es unmöglich wird, die gewünschte Information über die Probe zu erhalten· Aus diesem Grunde wird die Wahl des Betrachtungsfeldes bei einer Einstellung vorgenommen, in der die Energie oder Dichte des Elektronenstrahls beträchtlich vermindert ist· Hingegen wird das eigentliche Photographieren mit einiger Sicherheit keine wesentlichen Beschädigungen der biologischen Probe hervorrufen, und zwar wegen der extrem kurzen Zeit, die erforderlich ist. Da sich jedoch ein zufriedenstellendes Bild der Probe nur dann erzielen läßt, wenn die Feinstruktur der jeweiligen Probe betrachtet werden kann, wird die Probe notwendigerweise einer Bestrahlung durch den Elektronenstrahl bei hoher Dichte während relativ langer Zeit unterworfen, um ein helles und klares Bild auf dem fluoreszierenden Schirm zu erzeugen» Dies bedeutet wiederum, daß die biologische Probe beträchtlich beschädigt wird·

Tatsächlich bildet die mühsame und zeitaufwendige Prozedur, die zum Scharfeinstellen erforderlich ist, ein großes Hindernis bei der Realisierung einer automatisierten photo-

;^::;".-^: 32269U

I NACHeERE_ICHT

graphischen Aufzeichnung des mikroskopischen Bildes. Genauer gesagt, läßt sLch bisher eine Automatisierung des photographischen Aufzeichnungssystems nur in soweit durchführen, als folgende Baugruppen betroffen sind, nämlich der Belichtungs— oder Lichtmesser, der mit hoher Präzision den Energiepegel des auf den fluoreszierenden Schirm auftreffenden Elektronenstrahls messen kann, der Verschlußmechanismus, der eine geeignete Belichtung in Abhängigkeit vom Anzeige—Ausgang des Lichtmessers sicherstellt, der automatische Filmtransport und der Datendrucker zum Ausdrucken von Daten, wie etwa der eingestellten Vergrößerung, der Anzahl der Einzelbilder und dergleichen. Abgesehen davon, wurde bereits ein automatisiertes Betrachtungsfeld-Wählsystem entwickelt, bei dem ein Objektträger, der von einem Elektromotor angetrieben werden kann, mit einer zentralen Datenverarbeitungseinrichtung oder einem Computer kombiniert ist, so daß Bereiche einer Probe, die betrachtet werden sollen, gespeichert und ausgegeben werden können. Bei diesem System wird eine Anzahl von Bildfeldern oder Punkten, die betrachtet werden sollen, vorher in einer Speichereinrichtung gespeichert, die die Bildfelder wahlweise einzeln oder aufeinanderfolgend zur Betrachtung und/oder Aufzeichnung ausgibt. Hingegen hängt das Scharfeinstellen oder Fokussieren des Probenbildes letztlich von der Manipulation der Bedienungsperson selbst ab, was viel Zeit beansprucht und eine Schwierigkeit darstellt, wenn es um ein schnelles Aufzeichnen insgesamt geht, und zwar trotz der Automatisierung der oben beschriebenen zugehörigen Mechanismen. Es wurde bereits eine Vielzahl von Anlaufen unternommen, um ein automatisches Fokussieren zu erzielen. Beispielsweise hat man überlegt, ein auf dem fluoreszierenden Schirm erzeugtes Bild in elektrische Signale umzuwandeln, die dann in einer elektronischen Einheit dazu verwendet werden, automatisch zu bestimmen, ob das Fokussieren oder Scharfeinstellen des

32269U

Probenbildes in zufriedenstellender Weise erreicht worden ist· Ein solches System ist jedoch nicht nur kompliziert und teuer, sondern kann auch keine zuverlässigen Messungen liefern, und zwar unter anderem wegen der geringen Qualität der zur Verfügung stehenden Signale· Unter diesen Umständen sind automatische Scharfeinstellungssysteme zur Abbildung mikroskopischer Bilder derzeit weit vom praktischen Einsatz, entfernt.

Demnach liegt der Erfindung unter anderem die Aufgabe zugrunde, ein photographisches Aufzeichnungssystem für ein Elektronenmikroskop zu schaffen, welches die Nachteile der bisher bekannten Systeme nicht aufweist.

Ferner richtet sich die Erfindung auf die Schaffung eines Elektronenmikroskops mit Einrichtungen, die ein automatisches und rasches Scharfeinstellen eines Probenbildc-M in verminderter Zeit ermöglichen, um dadurch den Vorgang der photographischen Aufzeichnung insgesamt zu erleichtern und zu beschleunigen, wobei die Probe vor Beschädigungen oder Zerstörungen wegen zu langer Bestrahlung durch den Elektronenstrahl geschützt wird·

Nach der Erfindung soll außerdem ein Verfahren geschaffen werden, welches eine vollständig automatisierte photographische Aufzeichnung von Elektronenmikroskop-Bildern ermöglicht, und zwar durch Kombination des Merkmals der automatischen Fokussierung mit den Einrichtungen zur automatisierten photographischen Aufzeichnung, wie etwa der automatischen Einrichtung zur Belichtungseinstellung; dabei soll, was die Bildqueütät anbelangt, eine erhöhte Zuverlässigkeit des photographischi aufgezeichneten Bildes sichergestellt werden·

Auch richtet sich die Erfindung auf die Schaffung einer Vorrichtung zum Durchführen des obigen Verfahrens.

:^:-"λ:"Υ.^:::.Χ" -^: 32269U

: „„'.*„.

jj^OHQEReiCHT

Im Hinblick hierauf und auf weitere Merkmale, die im laufe der folgenden Beschreibung noch deutlicher werden, wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, daß der Erregerstrom einer Objektivlinse für jede Vergrößerung des Elektronenmikroskops auf einen oder mehrere Werte eingestellt wird, wobei diese Werte die gewünschte Scharfeinstellung zur Erzielung eines Probenbildes von verbesserter Qualität bei einer vorgewählten Vergrößerung sicherstellen können, so daß sich für diese vorgewählte Vergrößerung die Scharfeinstellung automatisch durchführen läßt·

Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung eines bevorzugten Ausführungsbeispiels im Zusammenhang mit der beiliegenden Zeichnung· Die Zeichnung zeigt in:

Fig. 1 schematisch eine Probe, die durch ein Elektronenmikroskop betrachtet wird, sowie ein Bild der Probe zur Erläuterung des Randeffekts;

Fig. 2 in graphischer Darstellung die Beziehungen zwischen einem Bereich von Fokus-Unterschreitungen, in dem Bilder hoher Qualität erhalten werden können, einem Bereich von Fokus—Unterschreitungen, der der maximal zulässigen Unscharfe entspricht, und den Vergrößerungen eines Elektronenmikroskops, wobei diese Beziehungen für die Erfindung von ausschlaggebender Bedeutung sind;

Fig. 3 schematisch ein Linsensystem zur Darstellung des Unschärfe-Phänomens eines Bildes sowie der Betrachtung des Bildes unter der Voraussetzung der Fokus-Unterschreitung, wie es der Lehre der Erfindung entspricht;

Fig. 4 in Form eines Blockdiagramms die grundsätzliche Anordnung eines Steuer— und Manipuliersystems zur automatischen Scharfeinstellung und photographischen Aufzeichnung des Bildes eines Elektronenmikroskops nach der Erfindung.

Γ: S-": I':"'' -':"'- - ' 32269Η

Allgemein gesagt, wird eine Probe, unter anderem eine biologische Probe, für ihre Prüfung unter einem Elektronenmikroskop üblicherweise in einer Dicke von größenordnungsmäßig 60 bis 80 nm präpariert, um eine mikroskopische Betrachtung durchführen zu können. Bei dieser Betrachtung einer so extrem dünnen Probe mit niedriger oder kleiner Vergrößerung in der Größenordnung von 50000 oder weniger ist es bekannt, daß man ein Probenbild mit klarem Kontrast dann erhalten kann, wenn die Betrachtung in einer Einstellung erfolgt, in der der Brennpunkt des Elektronenmikroskops aus demjenigen Punkt, der der genauen Fokussierung entspricht, geringfügig gegen den Bereich der Fokus-Unterschreitung verschoben wird. Dies läßt sich aus der Tatsache erklären, daß die Struktur einer Probe 1, wie sie in Figur 1 (A) dargestellt ist, mit einer Umfangskante erscheint, die durch eine sogenannte Rand—Unterschreitung verstärkt ist. Letztere entspricht dem Fresnel¹sehen Rand, der im Bereich der Fokus—Unter— schreitung zu beobachten ist. Dadurch wird die Umfangs— linie der Probe 1 deutlicher abgesetzt, um ein Probenbild la hoher Schärfe zu ergeben. Wenn die Breite D des Randes, nämlich die Dicke der Konturlinie nach Figur 1 (B) zu schmal wird, so vermindert sich entsprechend die Schärfe der Umfangslinie der Probe. Eine übermäßige Breite des Randes hingegen läßt sie Kontur des Probenbildes la verschwimmen. Der Wert der Breite D des Randes, bei der der gewünschte Randeffekt mehr oder weniger deutlich auf der Photographic des Probenbildes la zu erkennen ist, liegt im Bereich von 50 bis 120 /Jtn.

Der Fokus—Unterschwung Δ f (nämlich die Verschiebung in den Bereich der Fokus-Unterschreitung), bezogen auf den Scharfeinstellungspunkt der Objektivlinse des Elektronenmikroskops, erg ibt sich aus folgender Gleichung:

Af - D²/3,2Am² (1)

wobei D die Breite des Randes, λ die Wellenlänge des Elektronenstrahls, bestimmt durch die Beschleunigungsspannung, und M die Vergrößerung bedeutet·

Wenn die Beschleunigungsspannung für den Elektronenstrahl auf 100 KV eingestellt wird, so entspricht der Bereich des Fokus-Unterschwungs Δ f, der der Bedingung 50 μια - D S i20 yum auf der Photographic der Probe genügt, dem Bereich
zwischen den Linien A und B in Figur 2·

Als nächstes sei die Unscharfe betrachtet, die sich aufgrund der Divergenz des auf die Objektivlinse 3 auftreffenden Elektronenstrahls 2 ergibt, welche im wesentlichen
bestimmt wird, durch den Streuwinkel des Strahls, der
durch die Probe 1 übertragen wird· Gibt man den Divergenzwinkel des Strahls als Ck (siehe Figur 3) an, so ergibt
sich die Unscharfe S* die durch den Winkel CL und den
Fokus-Unterschwung &f bestimmt wird, aus der folgenden
Gleichung:

$m M-Af.cL .(2)

wobei M die Vergrößerung der photographierten Probe bedeutet· Der DivergenzwinkeloC,der im wesentlichen bestimmt wird durch den Streuwinkel der Probe 1, und zwar praktisch unabhängig von der Divergenz des auf die Probe auftreffenden Elektronenstrahls, ist in der Regel konstant und liegt

—4
in der Größenordnung von 1 χ 10 rad·· Wenn die Randbreite, bei der die Unscharfe <f auf der Photographie diskriminiert werden kann, auf 100 yum eingestellt wird, dann sollte die
Bedingung £ £ 100/Um erfüllt sein· Der Bereich, in dem
die vorstehende Bedingung erfüllt ist, entspricht demjenigen Bereich des Fokus-Unterschwungs Af, der unterhalb
der Linie C in Figur 2 liegt· Man kann also sagen, daß der

Γ:^:-·..: j":"; -Γ": - ' 32269U - «8"-

Bereich, in dem ein scharfes und klares Bild der Probe mit dem gewünschten Randeffekt bei Unterdrückung der Unscharfe auf ein vernachlässigbares Maß betrachtet werden kann, der Fläche E entspricht, die von den Linien A, B und C in Figur 2 umschlossen ist. Anders ausgedrückt, erhält man ein Probenbild verbesserter Qualität, wenn die Scharfeinstellung unter Bedingungen durchgeführt wird, die innerhalb der Fläche E liegen· Dies wiederum bedeutet, daß eine Scharfeinstellung, die die Betrachtung und/oder photo graphische Aufzeichnung eines scharfen und klaren Probenbildes gestattet, automatisch erzielt wird, wenn man den Fokus—Unterschwung Δ f automatisch steuern kann. Zur Steue rung des Ausmaßes der Fokus-Unterschreitung bzw. des Fokus unterschwungs Δ f sei angenommen, daß der Wert des Erreger Stroms der Objektivlinse 3, bei der das Bild des Brennpunktes in einer Bildebene 4 des Linsensystems nach Figur 3 abgebildet wird, durch die Stromstärke Iq wiedergegeben wird. Sodann läßt sich das Verhältnis zwischen der Änderung ΔΙ des Erregerstroms zur Änderung der Fokussierung, nämlich zum Fokus-Unterschwung Af, folgendermaßen ausdrücken :

Af - 2 · C₀-AlZI₀ (3)

wobei c der chromatische Abweichungskoeffizient der Objektivlinse 3 ist.

Wie es sich aus der obigen Gleichung (3) ergibt, läßt sich der Wert Af in beliebiger Weise dadurch steuern, daß man den Wert Δΐ entsprechend variiert. In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, daß eine feine und genaue Steuerung von ΔΙ möglich ist, und zwar durch Heranziehen der elektrischen Steuertechnik. Es sei hier erwähnt, daß bei bisher bekannten Elektronenmikroskopen das Scharfeinstellen

wiederholt durchgeführt wird, und zwar jedesmal dann, wenn eine Photographic des Schirmbildes aufgenommen wird, da nämlich eine Defokussierung auftritt, für die folgende Gründe angegeben werden können:

a) Ungenauigkeit oder Positionsabweichung der Probe 1 entlang der optischen Achse 5 der Objektivlinse·

b) Ungleichförmigkeit in regenerierten Hysteresen des magnetischen Kreises der Objektivlinse 3.

c) Korrektur des Brennpunktes, die erforderlich wird aufgrund der Tatsache, daß beim Ändern der Vergrößerung eine Verschiebung der Objektivebene einer zwischengeschalteten Linse und dem

nach eine Verschiebung der

Bildebene der Objektiv

linse 3 auftritt. (Da die Probe in der Objektivebene liegt, die ihrerseits! fixiert ist, tritt eine Defokussierung auf, wefin die Bildebene entlang der optischen Achse verschoben wird, es sei denn, die Brennweite der Objjektivlinse würde variiert oder nachgestellt.)

Die erstgenannte Ungenauigkeit bzw. der Fehler in der Position der Probe tritt auf beim Auflegen der Probe auf den Probenträger bzw· beim Abnehmen der Probe von diesem und beim Durchbiegen der Probe selbst. Dieser Fehler liegt in der Größenordnung von 10 /Um, Er läßt sich weiter vermindern, indem man die Probe sehr sorgfältig auflegt oder auf eine Proben-Positioniereinrichtung zurückgreift, die so ausgebildet ist, daß sie den Positionierungsfehler bis auf ein Minimum unterdrückt. Der an zweiter Stelle genannte Fehler, nämlich die Ungleichförmigkeit in der Hysteresis, liegt normalerweise in der Größenordnung von

0,1 % und läßt sich für eine Linse mit einer Brennweite

^: 32269H

-43.

NACHGEREIoHT

von ca. 5 ^m auf ca. 0,5 yüm reduzieren. Außerdem kann die Ungleichförmigkeit in der Hysteresis im wesentlichen einflußlos gemacht werden, indem man eine solche Einstellung unmittelbar vor der Scharfeinstellung durchführt, so daß immer dieselbe Hysteresislinie verfolgt werden kann. Hierzu kann man beispielsweise mit maximaler Erregung arbeiten. Schließlich läßt sich das an dritter Stelle genannte Problem der Verschiebung der Bildebene durch Einführung von Korrekturgrößen lösen, die vorher bei der Auslegung des Linsensystems für jede Vergrößerung bestimmt werden, so daß die Objektivebene unabhängig von den Vergrößerungen unveränderbar bleibt. Außerdem besteht die Möglichkeit, die Vergrößerung bei fixierter Bildebene der Objektivlinse in einem weiten Bereich zu variieren, indem man die Anzahl der Zwischenlinsen erhöht.

Unter Berücksichtigung der obigen Ausführungen läßt sich abschätzen, daß die Abweichungen des Brennpunktes ingesamt in einem Bereich von 0 bis (-) 15 yurn fallen. Demnach läßt sich aus Figur 2 ablesen, daß der richtige Fokus-Unterschwung Af für eine Vergrößerung von 1000 zwischen (-) 200 und (—) 1200 yüm sowie für eine Vergrößerung von 2000 zwischen (-) 50 und (-) 300 yum liegt. Unter diesen Umständen kann der Fehler von größenordnungsmäßig 15 farn vernachläßigt werden. Wenn beispielsweise der Wert des Erregerstroms I (wobei I » I_Q — ΔΙ) vorner so eingestellt wird, daß Af für eine Vergrößerung von 1000 den Wert von (—) 600 μτη und für eine Vergrößerung von 2000 den Wert von (-) 150 pm annimmt, so läßt sich für die beiden Vergrößerungen der Fehler im Wert des Fokus—Unterschwungs Af auf den Bereich von (-) 600 bis (-) 615 /um bzw. (-) 150 bis ( —) 165 yum beschränken. Anders ausgedrückt bedeutet dies, wenn die Erregerströme I in dieser Weise vorher eingestellt und in Kombination mit den gewünschten Vergröße-

32269U

rungen gespeichert werden, kann man optimal fokussierte Probenbilder bei den vorgewählten Vergrößerungen erzielen, ohne daß man die Bilder durch Beobachtung des Bildschirms scharf einstellen muß. Gemäß Figur 2 fällt der geeignete Fokus-Unterschwung Af für ein Bild, das mit der Vergrößerung von 8000 erzeugt wird, in den Bereich von (-) 3,2 bis (-) 19 /um. Stellt man also den Strom I so ein, daß die Verminderung Al zu einem Fokus-Unterschwung Äf von (-) 4 pm führt, so läßt sich der Fokus-Unterschwung Δί auf den Eiereich von (-) 4 bis (-) 19 yum beschränken, wodurch in fehlerfreier Weise ein optimal fokussiertes Bild erzeugt werden kann. Auf diese Weise lassen sich im Vergrößerungsbereich bis zu etwa 8000 zufriedenstellend fokussierte Bilder .erzielen, in dem man die Dekremente ΔΙ des Erregerstroms jeweils entsprechend den Fokus—Unterschwüngen Af für alle vorgewählten Vergrößerungen vorher einstellt, wobei es nicht erforderlich ist, die auf dem Bildschirm erzeugten Bilder visuell zu überwachen, selbst wenn die Probe ausgetauscht oder die Vergrößerung umgeschaltet wird.

Hingegen liegt dann, wenn die Probe mit einer Vergrößerung von 10000 betrachtet werden soll, der optimale Bereich des Fokus—Unterschwungs Af zwischen (—) 2 und (—) 12 /um. Hier läßt sich der Fehler von Δί,, der zwischen 0 und (-) 15 jam liegt, nicht mehr vernachlässigen. Um dieser Situation gerecht zu werden, wird nach einem weiteren Merkmal der Erfindung vorgeschlagen, zwei verschiedene Erregerströme I vorher einzustellen, die zwei unterschiedliche Dekremente ΔΙ ergeben, was zu zwei unterschiedlichen Fok.us-Unterschwüngen Af von ( + ) 2 yum bzw. (-) 8fjan führt. Sodann wird mindest eine der Photo— graphien, die jeweils bei diesen Fokus-Unterschwüngen aufgenommen werden, ein korrekt scharf eingestelltes

vf j!-; -]'■': . ^: 32269U

"ή S j nachgereicht]

Bild aufweisen_f Des weiteren gilt für die Vergrößerung von 18000, das der richtige Fokus-Unterschwung &f i"¹ Bereich yon 0,7 bis 4 pn liegt· Dementsprechend läßt sich der Erregerstrom I so einstellen, daß fünf Dekremente (M vorgewählt werden, die jeweils fünf Fokus-Unterschwünge Akf von (+) 1, (-) 2, (-) 5, (-) 8 bzw. (-) 11 um ergeben. Sodann können unter diesen Bedingungen jeweils fünf Photographien aufgenommen werden, unter denen sich mindestens eine befindet, die ein korrekt scharf eingestelltes Bild aufweist. In diesem Zusammenhang sei erwähnt, daß es im Hinblick auf die Schwierigkeit der Erzielung einer sicheren korrekten Fokussierung des Elektronenmikroskops ein nach dem Stande der Technik häufig angewendetes Verfahren darstellt, fünf oder mehr Photographien von ein und derselben Probe aufzunehmen, wobei man den Brennpunkt Schritt für Schritt verändert und anschließend diejenige Photographie auswählt, die das am besten fokussierte Bild aufweist. .

Ferner sei darauf hingewiesen, daß sich die in Figur 2 dargestellte Vergrößerung auf die letztlich erzielte Photographie bezieht und diejenige Vergrößerung beinhaltet, mit der das auf einem photographischen Film aufgenommene Bild auf ein Aufzeichnungsblatt gedruckt wird. Die Vergrößerung beim Drucken liegt normalerweise in der Größenordnung von 4 für Plattenkameras und in der Größenordnung von 10 für 35 mm-Kameras. Dementsprechend sollte die Größe der Erregerstrom-Abweichung ΔI in Abhängigkeit von der verwendeten Photokamera geändert werden. Außerdem besteht die Möglichkeit, die Größe der Abweichung ΔΙ in Abhängigkeit von der gewünschten Druckvergrößerung zu variieren. Abgesehen davon ist es bei einer Vergrößerung von unter 8000 gleichermaßen möglich, eine Mehrzahl von Photographien bei einer entsprechenden Anzahl von ΔΙ aufzunehmen, wobei anschließend dasjenige Negativ ausgewählt wird, welches für

Γ:"-;.:"^v:::.;--;■ -^: 32269U

die gewünschte Druckvergrößerung geeignet ist. Es ergibt sich also, daß scharfe und klare Photographien von Proben, beispielsweise von biologischen Proben, automatisch aufgenommen werden können, ohne daß man das Probenbild beobachten und manuell scharf einstellen muß, solange die Vergrößerung nicht mehr als 18000 beträgt; Letzteres stellt den am häufigsten angewendeten Bereich dar.

Aus der obigen Beschreibung geht hervor, daß der Parameter I₀ einen festen Wert darstellt. Diesen Parameter I_Q kann man beispielsweise dadurch bestimmen, daß man einmal die Scharfeinstellung bei hoher Vergrößerung durchführt, bei der die Tiefenschärfe ganz besonders gering wird. Auf der Basis des solchermaßen bestimmten Parameters I₀ läßt sich der tatsächliche Erregerstrom I für die vorgewählte Vergrößerung dadurch ableiten, daß man die der vorgewählten Vergrößerung entsprechende Abweichung ^I von dem festen Wert Iq abzieht. In diesem Falle läßt sich eine Deformation der Probe auf ein Minimum unterdrücken, da der Strom I_Q konstant gehalten wird, wodurch eine erneute Einstellung des Brennpunktes entfällt, wie sie sonst wegen einer möglichen Deformation oder Verschiebung der Probe erforderlich wird. Dadurch läßt sich das korrekt fokussierte Bild automatisch erzielen. Außerdem können Bestrahlungsfaktoren, wie etwa bestrahlte oder beleuchtete Probenbereiche, die Dichte des Elektronenstrahls (Bildhelligkeit) und dergleichen ziemlich beliebig gesteuert werden, indem man den Erregerstrom des fokussierenden Linsensystems entsprechend steuert. Wenn also die korrekten Stromwerte in entsprechender Weise zusammen mit den photographischen Vergrößerungen vorher eingestellt sind, wird es überflüssig, die obigen Parameter bei jeder Photographie manuell einzustellen, was die Bedienung des Elektronenmikroskop.systera weiter vereinfacht.

32269U ^:. I

-ft-

Figur 4 zeigt schematisch ein elektronisches Mikroskop— system, das mit einem automatischen Kamerasystem versehen ist, wobei eine Einrichtung zum automatischen Fokussieren des Probenbildes kombiniert ist mit einem Verschluß und weiteren derartigen Mechanismen. Ferner umfaßt das System die Funktionen des Speicherns (Einschreibens) und Aus— gebens von Punkten der Probe, die betrachtet werden sollen (Betrachtungsfeld)·

Nach Figur 4 ist eine Steuer- oder Betätigungskonsole F vorgesehen, auf der ein Schalter 10 zum Bewegen oder Positionieren der Probe angeordnet ist· Der Schalter IU umfaßt vier Wechselkontakte, die veranlassen, daß die Probe· jeweils in der positiven X—Richtung, in der negativen X-Richtung, in der positiven Y-Richtung und in der negativen Y—Richtung verschoben wird, und zwar unter der Einwirkung zugehöriger . elektromotorischer Antriebe. Neben dem Schalter 10 befindet sich ein Schalter 11 zur Ände- \ rung der Vergrößerung. Mit diesem läßt sich der Erregerstrom für das Abbildungslinsensystem einschließlich Zwischen— und Projektionslinsen variieren, um eine wahl der gewünschten Vergrößerung zu ermöglichen. Ferner sind auf der Konsole F ein Aufzeichnungs- oder Speicher-Schalter 12, ein Auslese-Schalter 13 und ein Photographior-Schalter 14 für die photographischen Aufnahmen in einer Reihe mit den Schaltern 10 und 11 angeordnet.

Der Speicher-Schalter 12 dient dazu, Daten für die Betrachtung in einem Speicher G (ROM) zu speichern. Genauer gesagt, wenn der Schalter 12 eingeschaltet wird, werden die Koordinaten der Probe, die zu diesem Zeitpunkt In der optischen Achse des Mikroskops liegen (also der Punkt der Probe, der betrachtet werden soll) in den Speicher G an einer vorbestimmten Adresse gespeichert, und zwar zusammen mit der gewünschten Vergrößerung, die durch den Scnalter 12 gewählt ist. Hierzu kann die Anzahl der Umdrehungen des

32269.H j

zugehörigen Antriebsmotors gezählt werden, und zwar ausgehend von einer Referenzposition. Der Zählwert wird in den Speicher G als derjenige Wert gespeichert, der die oben erwähnte Koordinate wiedergibt. Außerdem kann die Wahl der Adresse mittels eines manuell betätigten Schalters oder unter der Steuerung eines entsprechend vorbereiteten Programms erfolgen.

Der Auslese-Schalter 13 dient dazu, die in dem Speicher G enthaltenen Daten auszulesen. Auf der Basis der auf diese Weise ausgelesenen Daten wird der Objektivträger verschöben, um die Koordinate der Probe wieder einzustellen, wobei gleichzeitig der Erregerstrom für das Bildlinsensystem von der gewählten und eingestellten Vergrößerung bestimmt wird.

Der Photographier—Schalter 14 veranlaßt einen photo— graphischen Aufzeichnungsapparat dazu, das Probenbild aufzunehmen. Wenn man den Photographier—Schalter 14 gleichzeitig mit dem Auslese—Schalter 13 oder im Anschluß an diesen einschaltet, wird ein (nicht dargestellter) Belichtungsmesser in Betrieb gesetzt,um die Belichtungszeit (nämlich die Öffnungszeit des Verschlusses) zu bestimmen, während ein zu belichtender photographischer Film aus einem (nicht dargestellten) Filmmagazin zugeführt wird. Nach der Belichtung gelangt der Film in . ein weiteres Magazin, welches zur Aufnahme des belichteten Films vorgesehen ist.

Der Speicher G kann als Speicher mit direktem Zugriff und von geeigneter Speicherkapazität ausgelegt sein, in welchem die X— und Y—Koordinaten der Probe sowie die gewählte Vergrößerung bzw. die gewählten Vergrößerungen an den zugeordneten Adressen gespeichert werden. Außerdem können zusätzlich der Wert T, der die Druckvergrößerung berücksichtigt, sowie die Anzahl der Einzel-

bilder, die bei der gewählten Vergrößerung belichtet werden sollen, gespeichert werden.

Außer dem Speicher G ist ferner ein Speicher H vorgesehen, der dazu dient, diejenigen Daten aufzunehmen, zu denen die Daten der Erregerströme I für die Objektivlinse bei den verschiedenen Vergrößerungen gehören. Wenn beispielsweise der· Erregerstrom I der Objektivlinse bei einer gewählten Vergrößerung M durch den Ausdruck I ,„■. wiedergegeben wird, lassen sich die im Speicher H gespeicherten Daten folgendermaßen ausdrucken:

". ¹O ~ ^ΔΙ(Μ)

wobei Δ I(_My für die Abweichung des Erregerstroms entsprechend dem Fokus-Unterschwung Af bei der gewählten Vergrößerung M steht. Zusätzlich dazu speichert der Speicher H verschiedene weitere Daten, die die Dichte des Elektronenstrahls (Helligkeit), die Erregerströme für das Kondensor-Linsensystem bei verschiedenen Vergrößerungen, die Anzahl■der bei bestimmten Vergrößerungen zu belichtenden Einzelbilder und dergleichen betreffen. Abgesehen davon können in diesem Speicher Daten der Erregerströme für das Abbildungs-Linsensystem gespeichert ; werden. .

Die in den Speichern G und H gespeicherten Daten werden ! an eine zentrale Datenverarbeitungseinheit I (Abkürzung: CPU) abgegeben, und zwar unter der Steuerung der Signale, die durch die Schalter 10 bis 14 eingegeben werden. Die CPU steuert ihererseits verschiedene Stromquellen, die in einer Stromquellenschaltung J enthalten und mit verschiedenen aktiven Elementen des Elektronenmikroskops und der photographischen Kamera verbunden sind, um letztere

auf der Basis der zugeführten Daten und in Abhängigkeit von einem vorgegebenen Programm zu steuern. Die Stromquellenschaltung J umfaßt eine Stromquelle 15, die an Kondensorlinsen 26 und 27 des Elektronenmikroskops K angeschlossen ist, um diese Linse zu erregen und damit den Weg zu variieren, dem der aus einer Elektronenschleuder 25 emittierte Elektronenstrahl folgt. Ferner umfaßt die Schaltung J eine Stromquelle 16 zur Erregung der Objektivlinse 29, eine Stromquelle 17 zur Erregung der Zwischenlinsen 30 und 31 sowie der Projektorlinse 32 und eine Stromquelle IS, die an Antriebsmotoren 22 und 23 angeschlossen ist, welche zur Verschiebung eines mit diesen Motoren gekoppelten Objektträgers 28 dienen, wobei die Verschiebung, in der X-Richtung und/oder in der Y-Richtung innerhalb des magnetischen Feldes der Objektivlinse 29 stattfindet. Zur Schaltung J gehört außerdem eine Stromquelle 19, die an ein Relais 24 zur Steuerung des Verschlusses 33 angeschlossen ist, wobei letzterer zwischen der Projektorlinse 32 und einer Filmebene 37 liegt. Auch ist in der Schaltung J eine Belichtungsmeßschaltung 20 vorgesehen, um die optimale Strahlungsmenge zu bestimmen, der der photographische Film ausgesetzt wird. Schließlich umfaßt die Schaltung J eine Stromqaelle 21 für einen Motor 38 zum Fördern des photographischen Filmes im Anschluß.ian jeden"Aufnahmevorgang 3ild für Bild von einem Magazin 35 für unbelichteten Film zu einem Magazin 36 für belichteten Film.

Wenn der Speicher-Schalter 12 während der Betrachtung eines bestimmten Punktes (Betrachtungsfeld) der Probe unter Verwendung des Systems nach der obigen Anordnung eingeschaltet wird, so werden die relevanten Koordinaten X₁ und Y₁ des Punktes oder Betrachtungsfeldes sowie die zu diesem Zeitpunkt eingestellte Vergrößerung M^ in dem Speicher G an der Adresse n. gespeichert. Wenn andere

32269U :

Betrachtungsfelder ausgewählt werden und der Speicher-Schalter 12 während der Betrachtung dieser Felder betätigt wird, werden in gleicher Weise entsprechende

Koordinaten X₀. .... X und Y~, .... Y sowie die Ver- d^w η 2 η

größerungen M„, .·., M an den Adressen n~, ..., η gespeichert. Der unbelichtete Film befindet sich im Magazin 35, und zwar in einer Länge, die mindestens der Anzahl η von Einzelbildern entspricht. Die Anzahl

der Aufnahmen oder Einzelbilder ist ebenfalls vorher in dem Speicher G gespeichert worden. In diesem Zusammenhang besteht auch die Möglichkeit, während der Speicherung der Anzahl von zu belichtenden Aufnahmen oder Einzelbilder im Speicher G dann ein Signal zu erzeugen, wenn diese Anzahl mit der Anzahl der im Magazin enthaltenen Aufnahmen oder Einzelbilder zusammenfällt.

Nachdem die Vorbereitung des Photographiervorganges in dieser Weise beendet worden ist, werden der Auslese-Schalter 13 und der Photographier-Schalter 14 betätigt. Die CPU stellt dann arithmetisch die Koordinaten X^ und Y^ wieder ein, und zwar in Abhängigkeit von den Daten, die im Speicher G an der Adresse n., gespeichert sind, während Erregerströme für die Objektivlinse 29, die Zwischenlinsen 30 und 31 sowie die Projektorlinse 32 auf der Basis der aus dem Speicher H ausgelesenen Daten eingestellt werden. Anschließend erfolgt die Erregung der Kondensorlinsen 26 und 27, woran sich eine Reihe von Betätigungsschritten anschließt, wie etwa die Messung der Belichtung, die Förderung des Films, die Bestrahlung und so fort. Die Photographierschritte werden, nacheinander in ähnlicher Weise durchgeführt, und zwar i auf der Basis der Daten, die an den Adressen n-, n~, ·.., η gespeichert sind. Wenn an der nächstfolgenden Adresse keine Daten aufgefunden werden, so stellt die CPU fest,

32269U :

daß der Photographiervorgang abgeschlossen ist. Sie stoppt sodann die Betätigung des Elektronenmikroskops und der photographischen Kamera, indem sie die Stromzufuhr zur Stromquellenschaltung J unterbricht. Hierbei kann der Hauptschalter geöffnet werden, nachdem das System ausreichend heruntergekühlt worden ist, und zwar im Anschluß an das Abschalten einer (nicht dargestellten) Öldiffusionspumpe.

Wenn ein großes Betrachtungsfeld kontinuierlich beobachtet und photographisch aufgezeichnet werden soll, können gewisse Veränderungen an den SpeicherInhalten vorgenommen werden, wobei die Vergrößerung auf einen bestimmten ausgewählten Wert fixiert wird, während die Daten des gewünschten Betrachtungsfeldes der CPU aufgegeben werden, um arithmetisch die Verschiebung und Ausrichtung der Probe zu bestimmen. Unter diesen Bedingungen kann ein großes Betrachtungsfeld automatisch photographiert werden.

Wie es sich aus der obigen Beschreibung ergibt, wird das Scharfeinstellen des Elektronenmikroksops erfindungsgemäß automatisch durchgeführt, und zwar derart, daß die Erregungen der Objektivlinse des Elektronenmikroskops wahlweise auf einen oder mehrere Werte in Abhängigkeit von den Vergrößerungen der photographischen Aufzeichnung vorher eingestellt werden, so daß eine optimale Fokussierung bei jeder ausgewählten Vergrößerung sichergestellt werden kann. Dieses Merkmal der automatischen Fokussierung kann mit der Automatisierung der Verschlußfunktion, der Filmförderung und weiterer Faktoren kombiniert werden, um ein voll automatisiertes elektronisches Mikroskopsystem zu schaffen, einschließlich der Funktion der photographischen Aufzeichnung·

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Scharfeinstellen eines Probenbildes eines Elektronenmikroskops, dadurch ge kennzeichnet,, daß der Erregerstrom für eine Objektivlinse des Elektronenmikroskops auf mindestens einen Wert eingestellt wird, der einer von mehreren vorbestimmten Vergrößerungen entspricht; daß eine der vorbestimmten Vergrößerungen ausgewählt wird; und daß die Objektivlinse mit dem der gewählten Vergrößerung entsprechenden Erregerstrom erregt wird, so daß das Probenbild durch Wahl der gewünschten Vergrößerung automatisch und korrekt fokussiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Erregerstrom zur Erregung der Objektivlinse durch folgende Gleichung wiedergegeben wird:

¹O -

wobei I der erwähnte Erregerstrom und I_Q ein Erregerstrom ist, bei dem/Probe in einem Brennpunkt der Objektivlinse abgebildet wird, während ,Δΐ eine Änderungsgröße des Erregerstroms I_Q bedeutet, die einen Punkt, bei dem das Bild tatsächlich scharf eingestellt ist, um einen vorbestimmten Betrag (Af) zur Seite der Fokus-Unterschreitung wandern läßt·

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Betrag .( Af) so gewählt wird, daß eine Randunterschreitung auftritt.

32269 U
- 2 -

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das scharf eingestellte Probenbild mit automatisch bestimmter Belichtung photographisch aufgezeichnet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Erregerstrom für ein Kondensor—Linsensystem des Elektronenmikroskops automatisch vorher eingestellt wird, so daß eine Bestrahlung erzeugt wird, die sich für die photographische Aufzeichnung eignet.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Sätze von ersten Daten, die jeweils eine Kombination der Vergrößerung und der Lage eines zu betrachtenden Punktes auf der Probe repräsentieren, vorher in einem ersten Speicher gespeichert werden, während zweite Daten, die die Erregerströme der Objektivlinse jeweils in Übereinstimmung mit jeder der Kombinationen aus Vergrößerungen und Ortsangaben repräsentieren, zusammen mit den für die photographische Aufzeichnung erforderlichen Daten vorher in einem zweiten Speicher gespeichert werden, und daß nach Wahl einer Vergrößerung die ersten und zweiten Daten, die dieser gewählten Vergrößerung entsprechen, aus dem ersten und zweiten Speicher ausgelesen und arithmetisch behandelt werden, wodurch die Probe automatisch in eine Position gelangt, in der der Betrachtungspunkt zentriert ist, ferner die Objektivlinse mit einem Erregerstrom erregt wird, der der gewählten Vergrößerung entspricht, und schließlich die entsprechenden photographischen Aufzeichnungsbedingungen durch zugehörige Steuermittel automatisch eingestellt werden, und zwar auf der Basis der Ergebnisse der arithmetischen Behandlung·

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Bild mindestens eines einzelnen

32269H : :^:"_:-: - 3 -

Punktes der Probe scharf eingestellt wird, um einen Wert für den Erregerstrom abzuleiten, bei dem das Bild zufriedenstellend fokussiert ist, daß Änderungsgrößen des Erregerstroms für die Objektivlinse in Übereinstimmung mit den vorher eingestellten Vergrößerungen vorher eingestellt werden, und zwar bezogen auf den abgeleiteten Wert, und daß die der gewählten Vergrößerung entsprechende Änderungsgröße beim Photographieren des durch die Objek— tivlinse fokussierten Bildes dem Erregerstrom aufgeprägt wird.

8. Elektronenmikroskop, gekennzeichnet durch eine automatische photographische Einrichtung, bei der der Filmtransport, die Betätigung des Verschlusses und die Bestimmung der Belichtung automatisch durchführbar sind; durch einen Probenträger (28), der von motorischen Antrieben (22, 23) verschiebbar ist; durch Speichereinrichtungen (G, H), die betriebsmäßig mit einer Einrichtung (11) zur Änderung der Vergrößerung des Mikroskops (K) gekoppelt sind, um .Daten zu speichern, die dem Erregerstrom für eine Objektivlinse des Mikroskops entsprechen, wobei der Erregerstrom vorbestimmt ist in Abhängigkeit von einer vorgewählten Vergrößerung, bei der eine Photographie der Probe aufgenommen werden soll; und durch eine Einrichtung (I) zur Steuerung des an die Objektivlinse angelegten Erregerstroms in Abhängigkeit von den aus den Speichereinrichtungen ausgelesenen Daten, wenn das Photographieren mit dieser Vergrößerung durchgeführt wird·