DE3208507A1

DE3208507A1 - Killer-hefe

Info

Publication number: DE3208507A1
Application number: DE19823208507
Authority: DE
Inventors: Norio Ebina Kanagawa Gunge
Original assignee: Mitsubishi Chemical Industries Ltd Tokyo; Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1981-03-09
Filing date: 1982-03-09
Publication date: 1982-11-18
Also published as: US4418150A; JPS57146571A; GB2094341A; GB2094341B; FR2501231A1; JPH0157952B2; FR2501231B1

Description

Jnd. , Ltd. TER MEER · MÜLLER · STEINMEISTER ^:..*Fß^1 25..* "..' '.-*--·· 3208507

Beschreibung

Gegenstand der Erfindung ist eine Killcr-IIefe. 5

Es ist bekannt, daß Sake-Hefen mit Killer-Eigenschaften oder Killer-Charakter dazu verwendet werden können, die beim Brauen von Sake auftretenden Kontaminationen mit wilden Hefen zu verhindern. Dies bedeutet, daß diese Kille.r-Sake-Hefen gegenüber Killer-Toxinen immun (resi- ■ stent) sind, so daß die Herstellung und die Anwendung von ausgezeichneten Sake-Hefen mit Killer-Aktivität den Vorteil besitzt, daß sie nicht nur durch eingeschleppte wilde Killer-Hefen nicht abgetötet werden können, sondern" daß sie auch die Kontamination (Befall) mit gegenüber dem Killer-Toxin empfindlichen wilden Hefen, die häufiger angetroffen werden, verhindern könnm. Vom Standpunkt der Verhinderung.der Kontamination mi: wilden Hefen aus gesehen sind Hefen besonders bevor'/, igt, die gegen möglichst alle Killer-Toxine (die auch als iCiller-Substanzen bezeichnet werden) resistent sind, wie sie möglicherweise durch wilde Killer-Hefen produziert werden und die eine Killer-Wirkung gegen möglichst viele wilde Hefen ausüben. Die bislang bekannten Killer-Stämme von Saccharomyces cerevisiae sind jedoch in dieser Hinsicht nicht zufriedenstellend.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, eine Killer-Hefe anzugeben, die die oben·angesprochenen Eigenschaften aufweist.

Es hat sich nunmehr gezeigt, daß eine Killer-Hefe mit Resistenz gegen Killer-Toxine und einer Killer-Aktivität gegenüber einer Vielzahl von Hefearten dadurch gebildet werden kann, daß man ein bestimmtes Plasmid durch Zeil-

; ": Mitsubishi; Qfysn;. Ihd., Ltd.

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— 4 —

fusion oder Transformation in Saccharomyces cerevisiae einbringt.

Gegenstand der Erfindung ist daher der Saccharomyces -> cerevisiae-Stamm gemäß Hauptanspruch. Die Unteransprüche betreffen besonders bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands.

Die Erfindung betrifft somit einen neuen Stamm von Saccha romyces cerevisiae/ der gegen die Killer-Toxine resistent ist, die von den Killer-Stämmen von Kluyveromyces lactis produziert werden und der die gleichen Killer-Eigenschaften bzw. den gleichen Killer-Charakter aufweist wie diese Killer-Stämme.

.·

Die erfindungsgemäße Killer-Hefe gehört der Gattung Saccharomyces cerevisiae an und ist resistent oder immun gegenüber den Killer-Toxinen, die von den durch Doppelstrang-DNA-Plasmide (pGKl-1 und pGKl-2) gesteuerten KiI--ler-Stämmen von Kluyveromyces lactis produziert werden (beispielsweise von dem Stamm IFO 1267 oder dem Stamm ATCC 8585, wobei hier und im folgenden die IFO-Nummer diejenige ist, die bei der Hinterlegung des Stamms bei dem Foundation Institute of Fermentation, Osaka erteilt wurde und die ATCi'-Nummer diejenige ist, die bei der Hinterlegung des Stammes bei der American Type Culture Collection erteil ι. wurde) , und besitzt die gleichen Killer-Eigenschaf t:en oder den gleichen Killer-Charakter wie Killer-Stämme von Kluyveromyces lactis. Die erfindungsgemäße Killer-Hefe besitzt eine Killer-Wirkung gegenüber einer größeren Vielzahl von Hefen als die bislang bekannten Killer-Stämme von Saccharomyces cerevisiae, die durch Doppelstrang-RNA-Plasraide bedingt sind, beispielsweise der Stamm BO 60 (ATCC 42750) oder der Stamm B 511-4C (A¹J¹CC 38659). Dies bedeutet, daß die er-

' ifljii subishj» Chem. Ind., Ltd.

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findungsgemäße Killer-Hefe, ähnlich wie die Killer-Stämme von Kluyveromyces lactis, beispielsweise der Stamm IFO 1267, eine Killer-Aktivität.gegenüber den folgenden Stämmen besitzt:

1. Stämme, die der Killer-Wirkung unterliegen (d. h. die durch die erfindungsgemäße Killer-Hefe abgetötet werden) :

Saccharomyces cerevisiae

G102D Ai; 22 (ATCC 38626) Μ".-7C BC 60 (Killer-Stamm)

P:--8-4A Killer (Killer-Stamm)

BM1-4C (Killer-Stamm)

Kluyveromyces lactis

IFO 1903 IFO 0433 L3d
L4

L5 ·. ■

Kluyveromyces thermotolerans IFO 0662

25 Kluyveromyces vanudenii

Saccharomyces rouxii

30 Torulopsis glabrata

Candida utilis

35 Candida intermedia

IFO	1673
M1
M7
IFO	0005
IFO-	0662
IFQ	0396
IFO	0761

/ Mitsubishi CBeip. Jndt^'fitcJ.

TKR MfER · MUl LER · S.TFINMKIS I KR FD-125.·

2. Stämme, die, wenn auch in geringerem Umfang der Killer-Wirkung unterliegen:

Saccharomyces italicus IFO 0523 IFO 104 9

Kluyveromyces lactis W600B (ATCC 32143)

Die Stämme der oben erwähnten erfindungsgemäßen Killer-Hefe schließen den Stamm Saccharomyces cerevisiae F102-2 ein, der am 06. März 1981 bei dem Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology des Ministry of International Trade and Industry, 1-3,Higashi 1-chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken 305, Japan hinterlegt worden ist und die Hinterlegungsnummer FERM-P 5903 und die.internationale Hinterlegungsnummer FERM-BP 106 gemäß dem Budapester Vertrag .erhalten hat.

Die erfindungsgemäße Killerhefe kann auch als eine Hefe definiert werden, die gegen Killer-Toxine resistent ist, die durch Killer-Stämme von Saccharomyces cerevisiae (beispielsweise dem Stamm BO 60) produziert werden, als auch gegenüber jem n, die von Killer-Stämmen von Kluyveromyces lactis produziert werden, resistent sind und die gleichen Killer-Eiiienschaften oder den gleichen Killer-Charakter aufweist wie die Killer-Stämme von Saccharomyces cerevisiae (beispielsweise der Stamm BO 60) als auch jenen von Kluyveromyces lactis. Die erfindungsgemäße Killer-Hefe besitzt somit die Killer-Eigenschaften sowohl der Killer-Stämme von Kluyveromyces lactis als auch von Saccharomyces cerevisiae. Konkret findet sich die Killer-Aktivität (mit anderen Worten die Abtötung von Stämmen unter Einwirkung der erfindungsgemäßen· Hefe) neben den oben angegebenen Sl ämmen auch für Saccharomyces italicus_. Weiterhin reicht-da α Aktivität bei den oben unter Ziff.

FD-125

TER MEER ■ MÜLLER · STEINMEISTER ·

angesprochenen Stämmen, die der Einwirkung in einem geringen Ausmaß unterliegen, im Fall der Saccharomyces italicus-Stämme IFO 0253 und 1049 aus.

Die erfindungsgemäße Killer-Hefe wird dadurch herge-• stellt, daß man die Plasmide, die.man in dem Killer-Stamm von Kluyveromyces lactis findet (pGKl-1 und pGKl-2, die im Journal of Bacteriology, Vol. 145 (1981), 382 bis 390 beschrieben sind) durch eine Zelllusionstechnik oder '10 Zellverschmelzungstechnik oder eine Transformationstechnik in Saccharomyces cerevisiae einführt.

Als Saccharomyces cerevisiae-Stamm, der als Akzeptor für die Plasmide verwendet wird, kann.man einen Stamm einsetzen, der zu dem Genus Saccharomyces cerevisiae Hansen gehört, beispielsweise den Stamm AH22 (ATCC 38626) , den Stamm BO60 (ATCC 42750) oder dergleichen. Mit Vorzug verwendet man insbesondere eine <5>°-Mvitante, namentlich einen Stamm ohne Mitochondrium-DNA. Die \nwendung des Stammes BO60 ist bevorzugt, wenn es angestrebt wird, die erfindungsgemäße Killer-Hefe mit einer Resistenz gegen Killer-Stämme von Saccharomyces cerevisiae und mit den Killer-Eigenschaften dieser Killer-Stämme zu versehen. Als Plasmide kann man die Plasmide pGKl-1 und pGKl-2 verwenden, die man .in den Killer-Stämmen von Kluyveromyces lactis findet, beispielsweise in dem Stamm IFO 1267, wie es in Journal of Bacteriology, Vol. 145, (1981), 382 bis 390 beschrieben ist.

Die Plasmide pGKl-1 und pGKl-2 sind lineare DNA-Plasmide mit Molekulargewichten von 5,4 j+ 0,1 χ 10 Dalton bzw. 8,4 _+ 0,1 χ 10 Dalton und der gleichen Dichte von 1,687 . g/cm³. Die Spaltungseigenschaften dieser Plasmide für verschiedene Arten von Restriktionsenzymen sind die folgenden:

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i qhem\.Tnd· , Ltd

1) pGKl-1:

Mit EcoRI: Spaltung in zwei Fragmente (Molekulargewichte: 2,4 x10⁶ und 3,0 χ 10⁶ Dalton (welche Einheit für alle folgenden Molekulargewichte gilt) . ■ · ■ ·

Mit Hindlll: Spaltung in drei. Fragmente (Molekularge-

wichte; .0,5 x10 , 1,5 χ

10⁶ und 3,4 χ 10⁶).

Mit BgIII:

Mit Hindi:

Mit Pstl:

Mit BamHI

Spaltung in drei Fragmente (Molekularge-,6

wichte: 4,0 x1Q

0,96 χ 10.⁶ und 0,54 χ 10⁶) .

10⁶).

Spaltung in zwei Fragmente (Molekulargewichte: 4,1 x10 und 1,4 χ Spaltung in drei Fragmente (Molekulargewichte: 0,5 χ 10⁶, 1,0 χ 10⁶ und 3,9 χ Spaltung in zwei Fragmente (Molekulargewichte: 2,7 x10⁶ und 2,7 χ 10⁶) .

10⁶) .

Mit Xhol, Haell, Smal, Sail und Hpal: Keine Spaltung

2) pGKl-2: Mit EcoRI:

Mit BamHI·:

Spaltung in sieben Fragmente (Molekularge-

0,95 χ 10⁶,

wichte: 2,5 x10⁶, 2,3 χ 10⁶

0,85 χ 10⁶, 0,7 χ 10⁶, 0,55 χ 10⁶, 0,5 χ 10⁶) Spaltung in zwei Fragmente (Molekulargewichte: 3,6 χ 10⁶ und 4,8 χ 10⁶).

Mit Hindlll, Pstl, Hpal, Xhol, Haell, Smal und HincII: Keine Spaltung.

Zur Herstellung der c;rfindungsgemäßen Killer-Hefe werden beide Plasmide pGkl-1 und pGKl-2 in Saccharomyces cerevisiae eingeführt.

Im Fall der Anwendung einer Zeilfusionstechnik oder einer Zellverschmelzungstechnik für die Herstellung der erfindungsgemäßen Killer-Hefe werden in üblicher Weise Protoplasten aus Kluyveromyces lactis, die die oben angegebenen Plasmide umfassen, mit jenen von Saccharomyces cerevisiae

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Mitsubishi Chem. Ind., Ltd,

vermischt, wonach die Mischung mit Polyäthylenglykol behandelt wird. Nach dieser Behandlung wird die Mischung auf einem geeigneten isotonischen selektiven Medium ausgebreitet, auf dem lediglich Protoplasten von Saccharomyces cerevisiae unter Bildung der erfindungsgemäßen Killer-Hefe regeneriert werden kennen. .

Wenn andererseits die Herstellunc durch eine •Transformationstechnik bewirkt wird, werden die oben angesprochenen Plasmide in üblicher Weise zu Protoplasten von Stämmen von Saccharomyces cerevisiae zugesetzt, wonach eine Behandlung mit Polyäthylenglykol durchgeführt wird, der sich die Verteilung der Mischung in einem isotonischen Medium anschließt. Anschließend werden die Stämme mit Killer-Funktion aus den Kolonien der regenerierten Protoplasten isoliert.

Die erfindungsgemäße Killer-Hefe erhält man in der oben beschriebenen Weise. Weiterhin kann man erfindungsgemäß nützliche proteinhaltige Produkte produzieren, indem man exogene DNA (beispielsweise die Cene, die die Codierung für die Produktion von menschlicl en Polypeptiden, Hormonen, Enzymen, Impfstoffen etc. m fweison) unter Anwendung einer DNA-Rekombinationstechnik in die oben angesprochenen Plasmide oder einen Teil davon einführt, beispielsweise einen Teil, in dem der. Promotor, der Replikationsursprung und der Killer-Faktorbereich vorhanden sind, aus. dem jedoch andere Bereiche, die für die Plasmidreplikatiön oder für die Expression der eingeführten Gene unnötig sind, entfernt worden sind. Somit kann die Killer-Aktivität als Transformationsbildner angewandt werden.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

yj c u u ο ν / FD-1 25". ,"". .**.***: .*·..*'

TERMEER- MÜLLER · STEINMEISTER - - "- * · · · Vl I .'

- ίο - ■

Beispieli

Herstellung der Killer-Hefe durch eine Zelifusionstechnik oder Zellverschmelzungstechnik
· .

Man bereitet die Protoplasten'von 2 g eines Killer-Stamms von Kluyveromyces lactis,der- die Bezeichnung 2105-1D trägt (00 ade leu pGKl-1 und .pGKl-2) (dieser Stamm ist eine der Tetraden, die man durch die Kreuzung des Kluyveromyce's Iactis-Stamms IFO 1267 mit dem Kluyveromyces lactis-Stamm W600B erhält) und von 0,8 g eines keinen Killer-Stamm darstellenden Saccharomyces cerevisiae-Stamm, nämlich den Stamm AH22 (a leu 2-3, leu 2-112 his 4-519 can1 p_°J und. gibt sie zu 10 ml bzw. 5 ml einer Pufferlösung (0,1m Ci-

1.5 trat/Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert, von 6,1) unter Bildung von Suspensionen. Dann nimmt man jeweils 2 ml der betreffenden Suspensionen, mischt sie und zentrifugiert sie während 10 Minuten bei 2000 min . Zu dem erhaltenen Zentrifugenrückstand gibt man 4 ml einer 33 %-igen wäßrigen Polyäthylenglykollösung, die 50 mMol CaCl₂ enthält und inkubiert die Mischung während 30 Minuten bei 30⁰C. Dann zentrifugiert man die Mischung während 10 Minuten bei 2000 min , gibt zu dem erhaltenen Zentrifugenrückstand eine 0,6m K.iliumchloridlösung in .Wasser unter BiI-dung einer Suspension, die man dann auf ein NB (Stickstoff base der Fima Difco Laboratories) + Leucin (leu) + Histidin (his) + Glucose-Medium (welches 0,6m KCl als Stabilisator enthält), d.h. das Medium zur Regenerierung ' der Protoplasten des Saccharomyces cerevisiae-Stamms AH22 gießt. Durch Inkubieren während etwa 5'Tagen.bei 3O⁰C bilden sich viele Kolonien. Hiervon trennt man 243 Kolonien ab und untersucht sie auf die genetischen Markierungen und die Killer-Eigenschaften. Von 236 Kolonien, die die gleichen Nucleinsäure-Marker, wie der Saccharomyces cerevisiae-Stamm .AH22 aufweisen (Paarungstyp a; Erforder-

MiLsubishi Chem. Ind., Ltd

• · ft ft »mn · * ·

TER MEER·. MÜLLER · STEINMEISTER

nis für Leucin und Histidin und Resistenz gegen Canavanin (a leu 2-3, 2-112 his 4-519 cani)) besitzen 61 die Killer-Eigenschaften oder den Killer-Chiirakter, der für Kluyveromyces lactis charakteristxsch is ι (die Fähigkeit, den KiI-ler-Stamm B511-4C von Saccharomyc.es cerevisiae abzutöten) Aufgrund der Erkenntnisse der Ag.irosegel-Analyse und der Tatsache, ob die Plasmide aufgenommen wurden oder nicht- und aufgrund anderer Erkenntnisse in taxonomischer Hinsicht einschließlich morphologischer Kennzeichen der ZeI-len und dergleichen (beispielsweise aufgrund der Tatsache, daß sie Lactose nicht assimilieren können und gegenüber Cycloheximid empfindlich sind) wird angenommen, daß die ■ pGKl-Plasmide als Ergebnis der Zellverschmelzung gefolgt von der Replikation zur Entwicklung der Killer-Funktion von Kluyveromyces lactis in Sacrharomyces cerevisiae überführt wurden. Dieser Stamm wird <ί1ξ Saccharomyces cerevisiae-Stamm F102-2 bezeichnet und wurde bei dem Fermentation Research Institute der Agenc y of Industrial. Science and Technology unter der Bezeichi ung FERM-P 5903 bzw. der internationalen Hinterlegungi:nummer FERM-BP 106 hinterlegt.

Beispiel2

Herstellung der Killer-Hefe mit Hilfe einer Transformationstechnik

Man wandelt 1 g des Saccharomyces cerevisiae-Stamms AH22 (a leu .2-3, 2-112 his 4-519 cani p°) in Protoplasten um und wäscht diese dreimal mit einer 0,1m wäßrigen Kaliumchloridlösung, wonach man während 10 Minuten bei 3000 min zentrifugiert. Den erhaltenen Zentrifugenrückstand suspendiert man in 15 ml einer 10 mMol Tris-IIydrochlorid-Pufferlösung (die 50 mMol CaCl₂ und 0,6m KCl enthält). Zu

10 μ.1 der erhaltenen Suspension gibt man 10 μΐ einer 3,6m

TER MEER · MÜLLER · STEINMEISTER

wäßrigen Kaliumchloridlosung und gibt dann 40 μΐ einer 10 mMol Tris-Hydrochlorid-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,6, die 0,5 μg pGKl-1 und 0,5 μg pGKl-2 enthält, zu (wobei man d-ie Plasmide pGKl-1 und pGKl-2 nach der V«rfahrenswc2.istj herstellt, die in dom .Journal o(. Bacteriology, Vol.145 (1981) 382 bis 390 beschrieben ist), wobei diese Lösung zusätzlich 3 mMol Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält. Man beläßt die erhaltene Mischung (60 μΐ) während 30 Minuten in einem Eisbad, worauf man 500 μΐ einer 10 mMol Tris-Hydrochlorid-Pufferlösung (pH-Wert = 7,6), die 40 % Polyathylenglykol (Molekulargewicht = 6000) , 50 mMol CaCl₂ und 0,6m KCl enthält, zugibt und inkubiert dann unter vorsichtigem Schütteln während 60 Minuten bei 30⁰C. Nach der Zugabe einer wäßrigen 0,6m Kaliumchloridlosung breitet man die Mischung auf einem isotonischen YEPD-Medium aus und inkubiert während 4 Tagen bei 30°C, wobei man 6000 Kolonien der regenerierten Protoplastcn erhält. Von diesen Kolonien isoliert man 2000 und untersucht sje auf die Killer-Funktion unter Verwen-■ dung des Saccharcmyces cerevisiae-Stamms B511-4C als Testorganismus. Von diesen Kolonien umfassen zwei Kolonien transformierte Stämme (Killer-Stämme). Die durch Reinigen dieser beiden transformierten Stämme erhaltenen Sub-Klone besitzen die gleichen genetischen Eigenschaften (a leu 2-3, 2-112 his 4-519 c_an1_) und-taxonomisehen Eigenschaften wie der Mutterstamm AH22 (indem sie gegenüber Cycloheximid empfindlich'und nicht in der Lage sind, Lactose zu assimilieren) und zeigen weiterhin die Killer-Funktion der Killer-Stämme von Kluyveromyces lac tis. Weiterhin, wie sich durch Agarosegel-Analyse gezeigt hat, enthalten die Sub-Klone die pGKl-Plasmido.

Mitsubishi Chem. Ind., Ltd.

.320800/ I.-D-13V" ·**··: ·· ··

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B e i s p..i e 1 3

Herstellung der Killer-Hefe durch eine Zellfusionstechnik · (Zeilverschmelzungstechnik)
5

Man bereitet Protoplasten aus dem Saccharomyces cerevisiae-Staiiun, der die Killer-Eigenschaften aufweist, die für Kluyveromyces lactis charakteristisch sind, und aus dem Killer-Stamm BO60 von Saccharomyces cerevisiae, und unterwirft sie einer Z el'lver Schmelzung unter Anwendung" der in Beispiel 1 beschriebenen Zellfusionstechnik. In dieser Weise erfolgen die Kernverschmelzung und das Cytoplasmavermischen gleichzeitig, was zur Folge hat, daß der gebildete Saccharomyces cerevisiae-Stamm die Killer-Eigenschaften beider Stämme,' nämlich von Kluyveromyces lactis und von Saccharomyces cerevisiae BO60 aufweist.

Beispiel· 4
Bestimmung der Killer-Aktivität

Die Bestimmung der Killer-Aktivilät erfolgt nach der Methylenblau-Agar-Technik, die in ι ournal of Bacteriology, Vol. 145 (1981) 382 bis 390 beschrieben ist. Man inkubiert Zellen eines Test-Stammes (d.h. des Stammes, der dahingehend untersucht werden soll, ob er abgetötet wird oder nicht) in dem YEPD-Medium (1 % Hefeextrakt + 2 % Pepton + 2 % Glucose). Dann suspendiert man den Stamm in

7 sterilem Wasser und breitet 0,1 ml (10 Zellen/ml) der erhaltenen Suspension auf einem K'iller-Bestimmungsmedium aus (1 % Hefeextrakt + 2 % Pepton + 2 % Glucose + 0,003 % Methylenblau + 2,5 % Agar + 0,05m Citrat-Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 5,0).

Zur Untersuchung der Killor-Aktivität bringt man Zellen eines Stammes der Killer-Hefe (d.h. des Stammes, der da-

_v *_ ^ , FD-12T5.

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hingehend untersucht werden soll, ob er ein AbtÖtungsvermögen besitzt), den man auf YEPD-Agar gezüchtet hat, in .Form von Streifen auf das in der oben beschriebenen Weise hergestellte Bestimmungsmedium, auf den die Zellen des zu untersuchenden Stamms ausgebreitet und während 2 bis Tagen bei 25⁰C inkubiert worden sind. Wenn die Killer-Hefe eine Killer-Aktivität aufweist, ist eine· deutliche Abtötungszone um die Killer-Hefe herum zu beobachten. In der nachfolgenden Tabelle I sind die ermittelten Ergebnisse auf der Grundlage der folgenden Bewertungssymbole zusammengefaßt:

+ ■ Abtötung
- = keine Abtötung

_+' = schwache Abtötung, d.h. es findet sich eine kleine Abtötungszone um die Killer-Hefe herum-

Die Ergebnisse der Bestimmung der Killer-Aktivität der . gemäß den Beispielen 1 bis 3 hergestellten erfindungsgemäßen Killer-Hefen unter Verwendung der in der nachfolgenden Tabelle I angegebenen Test-Stämme sind.ebenfalls in dieser Tabelle I angegeben. Weiterhin ist auch die Killer-Aktivität der Killer-Stämme von Saccharomyces cerevisiae (BO60 und B511-4C) und des Killer.-Stamms von Kluy veromyces lactis (IFO 1267) in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführt.

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TERMEER- MÖLLER ■ STEINMEISTER

TABELLE I

Untersuchte Stämme	Beispiel 1	Bei	. + i	—
S. cerevisiae			I	+
G102D	+		-
MT-7C ·	+		+
BO60	+
F38-4A	+
B511-4C ■	+
. AH22	+
S. italicus
IFO 0253	+
IFO 0725	-
• .IFO 1049	+
K. lactis.
- IFÖ 1903
K43
WM37
W600B
K51
- L4

L5
K. lactis

IFO 0648 IFO 1090

IFO 1267 K. thermotolerans IFO 0662 IFO 1050 IFO 1674 IFO 1778 IFO 1779 IFO 1780 Beispiel j S.cerevisiaeι Κ.lactis

B060 und
B511-4C *1

H-"

IFO 1267 *2

FD-1,25.

TER MEER · MÜLLER · STEINMEISTER

- 16 -

TABELLE I (Fortsetzung)

Untersuchte Stämme

Beispiel
1

Beispiel
2

+

I

+

Beispiel
3

S.cerevisiae
BO60 und
B511-4C *1

i

K. lactis
IFO 1267
*2)

_

+

K. africanus

IFO 1671

-

. -

+ +

-

K. drosophilarum

IFO 1012

-

K. marxianus

IFO 0219

-

• -

-

K. phaffi

IFO 1672

-

K. polysporus

IFO 0996

-

K. vanudenii

IFO 1673

+

-

K. wickerhamii

IFO 1675

-

Schizosaccharcmycis
pombe

M210

-

■-

-

.-

SG55

-

M216

-

Killer-Hefe von
Beispiel 1

. +

—

Killer-Hefe^: von
Beispiel 2

+

—

Killer-Hefe von
Beipsiel 3

-

S. rouxii

M1

+ +

+ _: -■ ; +·

M7

■ +

Torulopsis glabrata

IFO 0005

+■

IFO 0662

Candida utilis

+ + + ·

IFO 0396

■ + + + ·

+

TER MEER ■ MÜLLER · STEINMEISTER

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TABELLE I (Fortsetzung)

Untersuchte Stämme

5 Candida intermedia IFO 0761

Beispiel 1.

Beispie L

Bei spiel S.cercvisiae
BO60 und
B511-4C*1

K.lactis IFO 1267 *2

*1: Die Stämme BO60 und B511C zeigen eine völlig gleiche Killer-Aktivität, .so daß sie in der gleichen Spalte abgehandelt werden. S. steht für Saccharomyces *2: K. steht für Kluyveromyces

Wie aus der obigen Tabelle I ersichtlich ist, besitzen die gemäß Beispiel 1 und 2 hergestellten erfindungsgemäßen Killer-Hefen die -Killer-Eigenschnften des Kluyveromyces Inctis-Stamms TFO 1267 und sind <i«Hjonübt>r' d icscin Slamm r<·- sistent. Weiterhin besitzt- die gemäß Beispiel J hergestellte erfindungsgemäße Killer-Hefe die Killer-Eigenschaften der Stämme Kluyveromyces lactis IFO 1.267 und Saccharomyces cerevisiae BO60 (oder B511C) und ist gegen beide Stämme resistent.

Claims

PATENTANWÄLTE TER MEER-MÜLLER-STEINMEISTER Beim Europäischen Patentamt zugelassene Vertreter — Professional Ri- resentuhves beforo the Europium Patent Oflice Mandataires agrees pres !'Office euro] -en des brevets Dipl.-Chem. Dr. N. ter Meer Dipl.-Ing. H. Steinmeister Dipl.-Ing. F. E. Müller A t t lldGbnok.s,rasso 51 TriftstrassG A, D-8OOO MÜNCHEN 22 D-480O BIELEFELD 1 · FD-125 . 09. März 1982 MITSUBISHI CHEMICAL INDUSTRIES LIMITED " 5-2, Marunouchi 2-chome, Chiyodarku, Tokyo,- Japan Killer-Hefc Priorität: 09. März 1981, Japan, Nr. 33453/1981 Patentansprüche

1. Saccharomyces cerevisiae-Stamm, der resistent ist gegen die von den Killer-Stämmen des. Genus Kluyveromyces lactis produzierten Killer-Toxine und der die gleichen Killer-Eigenschaften wie diese Killer-Stämme bestitzt. ■

2. Saccharomyces cerevisiae-Stamm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er resistent ist gegen die von den Killer-Stämmen des Genus Saccharomyces cerevisiae als auch die von den KiI-

TER MEER · MÜLLER · STEINMEISTER -..^: M^tSUtiifehi* ChW.''ltld. , Ltd. -FD

_ 9 —

ler-Stäramen des Genus Kluyveromyces lactis produzierten Killer-Toxine und daß er die gleichen Killer-Eigenschaften besitzt wie die Killer-Stämme des Genus Saccharomyces cerevisiae als auch des Genus Kluyveromyces lactis.

3. ■ Saccharomyces cerevisiae-Stamm nach einem der Ansprüche 1 und 2, wie er unter der Nr. FERM-P 5'903 bzw.
FERM-BP 106 bei dem Fermentation Research Institute
(FRI), Japan hinterlegt ist.