DE3145474A1

DE3145474A1 - 3-substituierte 4,5,6,7-tetrahydroisoxazolo(5,4-c)pyridinverbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und diese enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE3145474A1
Application number: DE19813145474
Authority: DE
Inventors: Jens-Kristian Dipl.-Ing. 3650 Oelstykke Perregard
Original assignee: Kefalas AS
Current assignee: Kefalas AS
Priority date: 1980-11-27
Filing date: 1981-11-16
Publication date: 1982-09-02
Also published as: JPS57118583A; FR2494692A1; IT8168540A0; DK524181A

Description

Kefalas A/S
Kopenhagen-Valby,

3-Substituierte f,5,6,7-Tetrahydroisoxazolo |j5,4-cj pyridlnverbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel

BAD ORIGINAL.

M ch re l

Die Erfindung betrifft bisher nicht bekannte Verbindungen der allgemeinen Formel ' O-c 'H

in der R eine verzweigt oder unverzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 17 Kohlenstoffatomen einschließlich, eine Phenylgruppe, die gegebenenfalls mit 1 oder 2 Gruppen, ausgewählt aus niederen Alkylgruppen, niederen Alkyloxygruppen und Halogenatomen substituiert ist, eine Phenylalkylgruppe, eine niedere Alkyl-

12 1 2 oxygruppe oder eine Gruppe -NR R , in der R und R jeweils Wasserstoff-^ niedere Alkyl-, Phenyl- oder Cyclohexylgruppen sid,d stellt, sowie deren pharmazeutisch unbedenkliche Säureaddition J-salze, von denen gezeigt werden konnte, daß sie eine mit y-Aminobuttersäure (GABA) in Verbindung stehende Wirkung haben und zur Verwendung zur Behandlung von Krankheiten indiziert sind, die auf einer fehlerhaften Funktion des GABA-Systems in Verbindung stehen, wie Epilepsie, Parkinsonismus, Schizophrenie, Huntington¹s Chorea (Chorea chronica progressiva hereditaia), Krankheiten, die auf der fehlerhaften Funktion/Hypophysenhornionen beruhen und zerebraler Arteriosklerose.

Darüberhinaus zeigen die Verbindungen starke analgetische und myotonische Wirkungen.

Die Verbindungen der Formel I sind zwar in weiterem Sinn z.B. in der Europäischen Patentenmelduni- Nr. 78 100 191.2 veröffentlicht worden, wo gesagt wird, daß sie als Zwischenprodukte zur Herstellung der Verbindung THIP (4,5,6,7-Tetrahydro-isoxazolo f5,4-cj[ pyridin-3-ol) dienen, die, wie gezeigt wurde, eine Aktivität besitzt, die in Beziehung zu GABA steht. Es gibt jedoch keine tatsächlichen Beispiele solcher Zwischenprodukte.

BAD ORIGINAL

3U5A7A

Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise gefunden, daß Verbindungen der Formel I und wie ihre pharmazeutisch unbedenklichen Säureadditionssalze eine mit GABA in Verbindung stehende Aktivität gleicher Größenordnung besitzen, wie dies bei der Verbindung THIP der Fall ist und einige der neuen Verbindungen gemäß der Erfindung zeigen sogar eine verlängerte Wirkung, verglichen mitIHIP. Darüberhinaus zeigen diese Verbindungen ausgeprägte analgetische und myotonische Wirkungen.

Die Erfindung betrifft weiterhin neue Arzneimittel, die als Wirkstoff eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch unbedenklich 3s Säureadditionssalz davon enthalten.

Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I und Verfahren zur Behandlung von

Krankheiten, die mit der fehlerhaften Funktion des GABA-Systems |

in Verbindung stehen, ein Verjähren zur Erleichterung von f

Schmerzen wechselnder Etiologie und ein Verfahren zur Behänd- '

lung von myotonischen Zuständen (z.B. zur Induzierung der 1

Muskelerschlaffung oder zur Behandlung \on Muskelkrämpfen oder '

muskulärer Krämpfe rseheinungen). .

Die Ausdrücke "niedere Alkylgruppen" und tiiedere Alkoxygruppen" j umfassen solche Giuppen, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome ein- . , schließlich haben.

Beispiele pharmazeutisch unbedenklicher Salze von Verbindungen der Formel I sind Salze mit anorganischen Säuren, z.B. Hydrochloride, Hydrobromide, Nitrate, Sulfate, Phosphate und dergleichen oder mit organischen Säuren, wie Acetate, Propionate, Glycolate, Malonate, Maleate, Succinate, Fumarate, Tartrate, Citrate, Oxalate, Benzoate, Pamoate, Methansulfonate, Äthansulfonate, Benzolsulfonate, Toluolsulfonate und dergleichen, wobei diese Salze durch an sich bekannte Verfahren hergestellt werden können, z.B. durch Zugabe der fraglichen Säure zur.Base, vorzugsweise in einem Lösungsmittel.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Verbindung der allgemeinen Formel

in der R eine Schutzgruppe für die Aminogruppe ist, die leicht entfernbar ist, mit einem reaktiven Derivat einer Säure der Formel R.COOH, wobei R die genannte Bedeutung hat, acyliert, wonach die Schutzgruppe R^ abgespalten wird und die Verbindung der Formel I als freie Base oder als pharmazeutisch unbedenkliches Säureadditionssalz isoliert wird.

Als Schutzgruppe R werden vorzugsweise Gruppen verwendet, die anschließend leicht abgespalten werden können, wie AlkyL-oxycarbonylgruppen. Vorzugsweise wurde eine Substitution mit tertiär-Butyloxycarbonylgruppen angewendet gemäß dem Ver-

vo η
fahren/Tarbell et al, in Proc.Nat.Acad.Sci. Bd, 69(3),

wird Die 0-Acylierung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren/in üblicher Weise in einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise in Gegenwart eines tertiären Amins bei niederen Temperaturen durchgeführt.

Einige der Ausgangsstoffe der Formel' 11 werden zweckmäßig durch Umsetzen von 3-Hydroxy-4,5,6,7-tetrahydroisoxazolo ^5,4-cjpyridin (im folgenden als THIP abgekürzt) mit einem Dialkyldicarbonat, vorzugsweise ditertiär-ButyD/carbonat hergestellt. Nach der Acylierung gemäß der Erfindung wird die Schutzgruppe R^ gegebenenfalls unter milden Bedingungen, wie kontrollierter Hydrolyse/gespalten. Wenn R eine tertiär-Butyloxygruppe ist, kann sie zweckmäßig durch Reaktion mit wasserfreier Trifluoressigsäure bei etwa O⁰C entfernt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die folgenden Arbeitsbeispiele erläutert, die jedoch nicht als Beschränkung

dienen sollen.

_f: -' ~- 3Η5Α74

Beispiel 1

3-Hydroxy-6-(t-butyloxycarbonyl)-4,5,6,7-tetrahydroisoxazolo
£5,4-c]pyridin.

Es wurden 11,1 g THIP χ HBr in 50 cm^ Dioxan und 25 cvd?
Wasser suspendiert. Durch Zugabe von 4,0 g NaOH in 25 cm
Wasser unter Eiskiihlung wurde eine klare Lösung erhalten.
Es wurden danach '1,0 g Di-t-butyldicarbonat zugefügt und
die Temperatur au:' 25⁰C steigen gelassen. Das Gemisii
wurde weitere 1,5 Stunden heftig gerührt. Danach wurden
300 cm Äthylacetat und 100 cm Wasser zugesetzt und der
pH-Wert der wäßri/.en Lösung auf λ# 3,0 mit einer KHSO^-
Lößung eingestell-.. Die Äthylacetatphase wurde abgetrennt
und mit 2 χ ?5 cm ' Wasser gewaschen, über wasserfreiem
Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel abgedampft,
wobei 11,8 g (98 ^c _/u) Produkt zurückblieb.F. 134-136⁰C, IR
(KBr): ν _0H2400-3;'00 (breite, komplexe Banden), V_C:3q1690 cm

Beispiel 2

3-Acetyloxy -4,5,i>,7-tetrahydroisoxazolo[5,4-c]pyridinoxalat.

Das mit eineytertj är-Butyloxycarbonylgruppe geschützte THIP '; (4p8 g) wurde in 100 cm trockenem Tetrahydrofuran gelöst,

2,1 g Triäthylamln hinzugefügt und die Lösung auf O⁰C ge-

3 '

kühlt. Es wurde oine Lösung von 1,8 g Acetylchlorid in 20 cm ',

trockenem Tetrahydrofuran tropfenweise zugesetzt (t^5°C). i Die Lösung wurde schließlich 15 Minuten bei Raumtemperatur

gerührt, das Triäthylamoniumhydrochlorid abfiltriert und £

das Tetrahydrofuran abgedampft. Die Ausbeute betrug 4,2 g |

(75 %) 3-Acetyloxy-6-(t-butyloxycarbonyl)-4,5,6,7-tetrahydro- ^

isoxazolo[5,4-c]pyridin, F. 93-97°C ii.

3 '^j

Dieses Produkt (3,0 g) wurde zu 10 cm eisgekühlter wasser- ι

freier Trifluoressigsäure zugefügt. Das Gemisch wurde ge- ?

von .. *

rührt, bis die Entwicklung/CO₂ aufgehört hatte. Uberschüs- _vj

sige Trifluoressigsäure wurde abgedampft und das resultierende .-!

BAD ORIGINAL

31 4 5 4 7 A

öl wurde in einigen cm trockenem Aceton gelöst. Es wurden 2,5 g wasserfreie Oxalsäure in 10 cm trockenem Aceton zugesetzt. Unter Rühren und Kühlen fiel das Oxalat aus. Ausbeute: 2,2 g (76 %). F. 217-219⁰C (Zersetzung), (Gefunden: C 44, 43;.H 4,59; N 10,07; für C₁₀H₁₂N₃O₇ berechnet: C 44,12; H 4,45; N 10,29 96).

Beispiel 3
3-Benzoyloxy-4, 5,6,7-tetrahydrolsoxazo Lor5,4-cjpyridin-oxalat.

Das Zwischenprodukt 3-Benzoyloxy-6-(t-butyloxy-carbonyl)-4,5,6,7-tetrahydroisoxazolo[5,4-cJpyridin wurde als Öl in . einer Ausbeute von 74 % gemäß Beispiel 2 hergestellt. Die t-Butyloxycarbonylgruppe wurde gemäß Beispiel 2 abgespalten und es wurden 71 % Ausbeute des Oxalate erhalten. F. 195-197⁰C (Zersetzung), (Gefunden: C 53,51; H 4,35; N 8,64; für C₁₅H^ berechnet: C 53,89; H 4,23; N 8,-58%).

' Beispiel- 4

3-(2,6-Dimethylbenzoyloxy)-4,5,6,7-tei rahydroisoxazolo j 5,4-pyridin-oxalat.

Das Zwischenprodukt 3-(2,o-Dimethylbenzoyloxy-ö-(t-butyloxycarbonyl)-4,5,6,7-tetrahydroisoxazoloJ5,4-cjpyridin wurde ii einer Ausbeute von 80 % gemäß Beispiel 2 hergestellt. F. 147-149°C.

Die t-Butyloxycarbonylgrüppe wurde gen aß. Beispiel 2 abgespalten, wobei 84 % des Oxalats erhallen wurden. F. 188-190³C (Zersetzung). (Gefunden: C 55,51; H 5,16; N 7,62; für C₁₇H₁₈N₂O₇ berechnet: C 56,34; H 5,02; N 7,73 %).

Beispiel 5

Ethyl-3-(4,5,6,7-tetrahydroisoxazolo ]_' , 4-cj pyridyl )carbonatoxalat.

-3 U5474

Das Zwischenprodukt Ethyl-6-(t-butyloxycarbonyl)-3-(4,5,6,7-tetrahydroisoxazolol5,4-c] pyridyl)carbonat wurde in 68 %iger Ausbeute aus t-Butyloxycarbonyl-THIP und Äthylchiοrameisensäureester gemäß Beispiel 2 hergestellt. F. 95-97°C. Die t-Butyloxycarbonylgruppe wurde gemäß Beispiel 2 abgespalten. Es wurde eine Ausbeute des Oxalats von 97 % erhalten. F. 154-157°C (Zersetzung). (Gefunden: C 43,76: H 4,84; N 9,27; für C₁₁H₁₄N₂O₈ berechnet: C 43,71; H 4,68; N 9,27 %).

Eaisplel 6

3-(4,5,6,7-Tetrahyd roisoxazolo j 5,4-c j pyridyl)N,N-dimethylcarbamat-oxalat.

Es wurden 4,8 g t-Butyloxycarbonyl-THIP in 100 cm trockenem j Tetrahydrofuran gelöst und 2,1 g Triäthylamin zugegeben. Unter '

■χ )

Eiskühlung wurden 2,2 g N.N-Dimethylcarbamoylchlorid in 20 cm ,^l

trockenem Tetrahydrofuran zugegeben. Das Gemisch wurde 2 Stun- i

den unter RUckflußtedingungen erwärmt und schließlich wurde |

das Tetrahydrofurar. abgedampft. Der Rückstand wurde in 200 cnr j

CH₂Cl₂ gelöst und π it 2.x 250 cm⁵ eisgekühlter 0,1 m-Kalium- *

carbonates sung gewaschen. Die CH_?C1₂-Phase wurde über Mag- |

nesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel ehgedampft. '

Das zurückbleibende Öl wurde an einer Säule chromatographiert, '

die mit Silicagel 6 0 "Merck" gefüllt war. Es wurde das 6- \ (t-Butyloxycarbonyl)-3-(4,5,6,7-tetrahydroisoxazolo[5,4-c] pyridyl )N,N-dimethylcarbamat mit Äther eluiert. Die Ausbeute betrug 2,4 g (39 50. F. 68-72°C.

Die t-Butyloxycarbonylgruppe wurde gemäß Beispiel 2 abgespalten und es wurden 94 % Ausbeute des Oxalats enthalten, F. 240-242⁰C (Zersetzung). (Gefunden: C 43,79; H 5,35; N 13,35; für C₁₁H₁₅N₃O₇ berechnet: C 43,85; H 5,03; N 13,95 50.

Beispiel 7

In gleicher Weise wie gemäß Beispiel 6 wurden folgende Verbindungen hergestellt:

^mr Ί
3-(4,5,6,7-Tetrahydroisoxazolo[5,4-cj pyridyl)-N,N-diethyl-

carbamat-oxalat, F. 216-218⁰C und 3-(4,5,6,7-Tetrahydroisoxazolo[5,4-cjpyridyl)-N-methyl-N-phenyl-carbamat-oxalat, ' F. 183-184⁰C, wenn NjN-Dimethylcarbamoylchlorid durch N,N-Diethylcarbamoylchlorid bzw. durch N-Methyl-N-phenylcarbamoylChlorid ersetzt wurde.

Die Verbindungen von Beispiel 7 wurde auf analgetische Wirksamkeit gemäß dem Versuch unter Verwendung heißer Platten bei Mäusen (Chen und Beckmann, Science, Bd. 13, Seite 631,1951), wobei ED^Q-Verte von 16 bzw. 18 mg/kg p.o. gefunden wurden. Weiter wurden die Verbindungen gegen arthritische Schmerzen bei der Ratte nach dem Verfahren von A.W. Pircio et al, Eur.J.Pharmacol., Bd. 31, Seiten 207-215, 1975 geprüft, woboi ED₅₀-Werte von ca. 56 (1 Stunde), 42 (5 Stunden), 42 (5 Sunden und 25 (1 Stunde), 25 (3 Stunden),15 (5 Stunden) durch perorale Verabreichung gemessen wurden.

In gleicher Weise wurden hergestellt dLe folgenden Verbindungfc] 3-Butanoyloxy-4,5,6,7-tetrahydroisoxaz olo[5,4-cJpyridin-eitrat 3-Capryloxy-4,5,6,7-tetrahydroisoxazol0 [5,4-cJpyridin-sucrinat 3-Palmitoyloxy-4,5,6,7-tetrahydroisoxazolo J5,4-cjpyridin-malea· 3- (4,5,6,7-Te trahydro isoxazolo fb, 4-cjf ρ yridyl )-N-methyl-N-cyclohexylcarbamat-acetat,

Die Verbindungen von Formel I wurden nach den genormten zuverlässigen Testmethoden geprüft, die im folgenden beschrieben werden.

Isoniazid-Antagonismus

Männliche Mäuse, 20 - 25 g
Isoniazid 300 mg/kg subkutan
Macrolon-Käfige Typ II

Dosierung und Verfahrensweise

intr apere toniax/

Die Versuchsverbindung wird intraperetonial/ der Dosierung 0, 1/2, 1/8 und 1/32 der intravenös ermittelten LD₅₀ injiziert.

BAD ORIGfMAL

*ΐ J-jMiJl·*"* * ι "'

3 U5474

Im Fall von unlöslichen Substanzen/ die Dosierungen O, 1/4, 1/16 und 1/64 der intraperetonial bestimmten Dosierungen LDe₀ verwendet.

Es wurden für jede Dosierung 5 Mäuse vewendet.

Unmittelbar nach der Verabreichung der Versuchssubstanzen wurden 300 mg/kg Isoniacidp ubkutan injiziert. Diese Dosis Isoniacid induziert unterbrocher β tonische clonische Krämpfe innerhalb von 60 Minuten.

Die Berechnungen wurden durchgeführt im direkten Verfahren "on line" am Terminal einer Datenverarbeitungsanlage. Die Ergebnisse wurden als prozentualer Zeitanstieg während des AuftKtens der Krämpfe wiederg€-geben und zusätzlich wurde die letzte Dosis berechnet, die einen wesentlichen Effekt zeigt (MED ■ minimale wirksame Dosis), berechnet mittels des Van der Waerden-Tests.

Die EPcQ wird als diejenige Dosis in mg/kg bestimmt, die diese Zeit um 50 % ansteigen läßt.

Gitterschockversuch bei Mäusen
Männliche Maus ei , 2n - 2^V> g.

Das Mäusergitter besteht aus einem Käfig aus unzerbrechlichem Kunststoffglas mit e<-nem Boden aus Drahtgitter und einem Deckel aus dem Kunststoffglas, auf welchem ein Mikrophon angebracht ist, das für die Frequenz von Mäuseschreien empfindlich ist_o Ein Stimulator mit einem Potentiometer mit Motorantrieb bringt eine Reihenfolge von Quadratwellenimpulsen mit kontinuierlich ansteigender Stromstärke (in Milliampere) auf das Gitter auf. Die Häufigkeit der Impulse beträgt 20 Zyklen/sek. für die Dauer von 5 Millisekunden. Die Stromstärke in Milliampere wird auf einen digitalen Amperemeta· wiedergegeben, das mit dem Stimulator verbunden ist. Die Aktivierung des Mikrophons durch Mäuseschreie schneidet die Stromstärke ab und die letzte Stromstärke erscheint auf dem MilLiampermeter.

BAD ORIGINAL

. 3 U5474

Dosierung und Verfahrensweise

Die Testsubstanz wird intraperetonial in den Dosierungen 1/2, 1/4 und 1/8 der intravenös bestimmten LD^₀ verabreicht. Bei unlöslichen Substanzen werden die Dosierungen 1/4, 1/8 und 1/16 der intraperitonial bestimmten LD verwendet. 5 Mäuse werden für jede Dosierung gebraucht. Jede MaiB dient als Ihre eigene Kontrolle.

Vor der Verabreichung der Testsubstanz werden die Tiere (jeweils eines gleichzeitig}auf das Gitter gesetzt und die Schmerzschwelle wird durch Ansteigen der Intensität der Stromstärke bestimmt, bis die Maua schreit. Die Schmerzschwelle kann auf dem Milliamperemeter abge] esen werden.

15 Minuten und 30 Minuten nach der Verabreichung der Testsubstanz werden die Mäuse erneut getestet und die Schmerzschwelle gemessen. Außerdem kann die Testsubstanz nach der oralen Verabreichung in den Dosierungen 1, 1/2 und 1/4 der intravenös bestimmten LD,-q geprüft werden und die Schmerzschwelle wird vor und 30 Minuten nach Verabreichung bestimmt. Unlösliche Testsubstanzen werden oral Jn den Dosierungen 1/2, 1/4 und 1/8 der intraperetonial bestimmten LDc₀ getestet.

Die analgetische Wirkung ist vorhanden, wenn die Schmerζ-schwelle über den Wert vor der Dosierung (Kontrollwert) . erhöht ist. Die Resultate werden als prozentualer Anstieg der Schmerzschwelle wiedergegeben, berechnet auf der Basis oes Kontrollwertes. Die Registrierung kann auch direkt auf der Datenverarbeitungsanlage ("on line") erfolgen. In diesem Faul. warten die Lochkarteninstruktion^und die Lochkarten selbst automatisch erzeugt und die Ergebnisse werden als minimale wirksame Dosis (MED) nach dem X-Test von v.in der Waerden aufgezektißt

Bestimmung der Bindung von H-GABA an lie Gehirnmembrane der Ratten

BAD

-^:· 3U5474

Ratten im Gewicht von 125 - 200 g

0,32 m-Saccharose (täglich frisch hergestellt) 10 % Triton X-1C0

0,05 n-Tris-Citrat-Puffer (pH 6,8)

6,05 g Trisma ^^R' (Base)

3,502 g Citronensäure. H₂O auf 1 Liter Wasser

⁵H-GABA - Aminotuttersäure, ^-2,3-⁵H(N) (etwa).

35 Ci/mmol (New England Nuclear) (täglich avf 1 uM mit Wasser verdünnt).

Verfahrensweise A. Preparierung der Membrane

Ratten wurden durch einen Schlag auf den Kopf getötet, ausbluten gelassen und die Gehirne entfernt und in eiskalter Salzlösung gekühlt. Nach dem Spülen und Wiegen wurden zwei Gehirne zusammen homogenisiert in 4ocm^ eiskalter 0,32 m-Saccharoselb"sung unter Verwendung eines Homogenisiergeröts mit Motorantrieb und einem Pistill aus Teflon (6 Bewegungen auf und nieder, Drehung mit langsamer Geschwindigkeit).

Die Proben wurden 10 Minuten bei 900 g zentrifugiert und anschließend wurden die überstehenden Flüssigkeiten 20 Minuten bei 17 000 g (4⁰C) zentrifugiert. Zu jedem erhaltenen Pellet wurden 20 cm Wasser zugegeben und die Proben wurden 30 Sekunden homogenisiert (Ultra Turrax). Nach Zugabe von weiteren 10 cm Wasser wurden die Proben 20 Minuten bei 8 500 g (4°C) zentrifugiert. 2/3 der überstehenden Flüssigkeiten wurden verworfen und der hellbraune obere Teil des Pellets wurde von Hand aufgewirbelt. Diese überstehende Flüssigkeit wurde 30 Minuten bei 37 500 g (4⁰C) zentrifugiert. Der Pellet wurde 1 Minute in 10 ein Wasser homogenisiert (Ultra Turrax). Die Probe wurde in 2 Gläser verteilt und es' wurden weitere 25 cm^ Wasser zu jeder Probe

-· λ&γ-

314547A

gegeben.· Jedes Glas enthielt nun Membranen aus einem Gehirn in 30 cm Wasser. Diese Proben werden 30 Minuten bei 37 500 g (4⁰C) zentrifugiert und die Pellets anschließend in Aceton/ CO₂ gefroren, verkorkt und bis zum Gebrauch in gefrorenem Zustand gelagert (wenigstens über Nacht).

B. Vorbehandlung der Membrane.

An demjenigen Tag, bei welchem die Messungen durchgeführt werden, wird der Pellet in Aceton/Trockeneis 20 Minuten gefroren und 25 cm^ Wasser werden vor der Homo gpai sie rung (Ultra Turrax) 1 Minute lang zugegeben. Es werden 25 cm einer 0,05 n-Tris-Citratpufferlösung und 0,250 cm einer 10 96igen Lösung eines oberflächenaktiven Mittels Triton X-100 zugegeben und die Probe wird 30 Minuten bei 37°C bebrütet und danach bei 37 500 g 20 Minuten lang (4⁰C) zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und der Pellet wird in 0,05 n-Tris-Citratpufferlösung suspendiert (75 Sekunda! im Ultra Turrax) bis zu einer Konzentration von 30 mg ursprünglichem Naßgewicht je cm . Die Suspension wird 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und danach auf Eis aufbewahrt.

C. Prüfung der Bindekraft

Es werden in jeweils 2 Inkubationsröl· rchen auf Eis 780 mm Wasser, 200 mm des in Wasser gelösten Arzneimittels, 2Q mm·³ einer Lösung von 1 uMol H-GABA (Endkcnzentration von H-GABA im Röhrchen =10 nMol) sowie 1000 mm' der Membransuspension eingefüllt. Nach dem Inkubieren 5 Minuten auf Eis werden die > bei 31 000 g 18 Minuten lang zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und der Pellet wird sorgfältig mit 3x5 cm eiskaltem Wasser gespürt. Überschüssiges Wasser wird sorgfältig mit weichem Papie:r abgewischt. Es wird 1 cm Soluene350 zugegeben und die Proben werden 30 Minuten bei 37⁰C inkubiert. Es werden 10 cm⁵ Instagel oder Lumage] mit einem Gehalt von 10 cm Essigsäure je Liter zugefügt und

ORIGINAL

die Radioaktivität wird durch einen Flüssigkeits-Szintillationszähler gemessen. Die unspezifische Bindung von H-GABA wird durch Inkubieren der Proben mit 1 mMol GABA bestimmt.

Jede Meßreihe besteht aus 8 Doppelmessungen (1 Vergleichsmessung, 1 Probe -nit 1 mMol GABA und 1 bis 2 Reihen Testverbindungen in Z bis ο Konzentrationen).

Es wurden die Mittelwerte von Kontrollen und Proben mit 1 mMo'.. GABA berechnet. Die gemessenen cpm-Werte wurden gegen die Arzneimittelkonzentration auf halblogerythmischem Papier aufgetragen und die am besten passende S-fönnge Kurve gezeichnet. Die IC-Q-Werte wurden als diejenigen Konzentrationen bestimmt, bei denen die Bindung 50 % der gesamten Bindung minus der unspezifischen Bindung betrug.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt, wöbe: die Versuchssubstanzen durch die Nummer des Beispiels bezeichnet sind, welche die Herstellung der jeweiligen Substanz beschreiben.

Die entsprechenden Versuchswerte für THIP sind als Vergleichswert angegeben.

Tabelle I

Test substanz	Isoniazid- Äntagonismus	Mausgitter schock + + + + + +	⁵H-GABA-Bindung IC₅₀
Beispiel 2 3 • « . 4 ii 5 » 6 THIP	2,9 3,2 8,6 10,8 1,2 1,3	2,8 · 10~⁷ 3,3 · 10"⁷ 5,3 · 10"⁶ 8,2 · 10~⁷ 5,5 · ΙΟ"⁵ 1,7 · 10'⁷

Die Verbindungen von Formel I und die nicht-toxischen Säureadditionssalze dieser Verbindungen können Tieren, wie Hunden, Katzen, Pferde, Schafe ader dergleichen einschließlich Menschen sowohl oral wie parenteral verabreicht werden und könen

314547Λ

beispielsweise in Form von Tabletten, Kapseln, Pulvern, Sirups oder in Form von den üblichen sterilen Lösungen für Injektionszwecke angewendet werden. Ergebnisse nach der Anwendung beim Menschen war^sehr aussichtsreich.

Am zweckmäßigsten werden die Verbindungen der Formel I oral in Dosierungseinheiten, wie Tabletten oder Kapseln verabreicht, wobei jede Dosierungseinheit ein nicht toxiahes Additionssalz einer der Verbindungen mit einer Säure in einer Menge von etwa 5 bis 100mg, jedoch am meisten bevorzugt von etwa 10 bis 50 mg enthält, berechnet als freies Amin, wobei die gesamte tägliche Dosis gewöhnlich von etwa 20 bis etwa 200 mg reicht. Die genauen Einzeldosierungen sowie die täglichen Dosierungen in besonderen Fällen werden natürlich nach bewMirten medizinischen Grundsätzen unter Anleitung einet Arztes bestimmt.

Bei der Herstellung von Tabletten wird meistens der Wirk-. stoff mit gewöhnlichen Adjuvantien, wie Maisstärke, Kartoffelstärke, Talkum, Magnesiumstearat, Gelatine, Laktose, Gunmen oder dergleichen vermischt.

Wenn die Verbindung der Formel I in Form des freien Amins vorliegt, ist vorzugsweise R eine höhere Alkylgruppe mit 8 bis 17 Kohlenstoffatomen einschließlich, wobei die Zubereitung vorzugsweise in Form einer öΊigen Lösung für Injektionszwecke vorliegt und solche Lösungen häufig einen sehr verlängerten Effekt aufweisen, verglichen mit der entsprechenden nicht veresterten Vebin-lung.

Typische Beispiele von Formulierungen lir Arzneimittel, die 3-Acetoxy-4,5,6,7-tetrahydroisoxazolo['*>,4-c pyridin (abgekürzt Lu 18-013) als Wirkstoff enthalten, sind die folgenden:

1. Tabletten mit 10 mg Lu 18-013, berechnet als freie Base in Form des Oxalats:

BAD ORIGINAL

Lu 18-013: 10 mg

Lactose: 37 mg

Kartoffelstärke: lh mg

Gelatine: 2 mg

Talkum: H mg

2. Kapseln enthaltend je Kapsel:

Lu 18-013: ?5 mg
Lactose: 40 mg

Magnesiumstearac: 0,5 mg ■;

Jedes andere pharmazeutische Hilfsmittel zur Tabletierung

kann verwendet werden unter der Voraussetzung, daß diese ι

Stoffe mit dem Wirkstoff verträglich sind, und zusätzliche ix

Zubereitungen und Josierungsformen können ähnlich denjeni- Ϊ

gen sein, die gegenwärtig für Neuroleptika, wie ThioUixene, i

Clopenthixol oder '"lupenthixol, in Gebrauch sind. Auch (

Kombinationen der Verbindungen von E'ormel I sowie ihre 4

nicht-toxischen Säareadditionssalze mit anderen Wirkstoffen, |

insbesondere anderen Neuroleptika, Thymoleptika, Beruhigungs- *

mittel oder dergleichen fallen in den Erfindungsbereich. *$

Wie vorher erwähnt ist bei der Isolierung der Verbindungen >_t von Formel I in Form eines Säureadditionssalzes die Säure , j;

vorzugsweise derart ausgewählt, daß sie ein Anion enthält, id

I das nicht-toxisch ist und pharmakologisch unbedenklich ist, *■ wenigstens in gewöhnlichen therapeutischen Dosierungen.
Representative Salze, die in dieser bevorzugten Gruppe eingeschlossen, sind Hydrochloride, Hydrobromide, Sulfate,
Acetate, Phosphate, Nitrate, Methansulfonate, Ethansulfonate,
Lactate, Citrate, 'i'artrate oder Bitartrate, Embonate und
Maleate der Amine von Formel I. Andere Säuren sind ebenfalls
geeignet und können gegebenenfalls verwendet werden. Beispiele hierfür sind: Fumarsäure, Benzoesäure, Ascorbinsäure,
Bernsteinsäure, Salicylsäure, Bismethylensücylsäure, Propionsäure, Gluconsäure, Apfelsäure, Malonsäure, Mandelsäure,

Zimtsäure,/Stearinsäure, Palmitinsäure, Itaconsäure, Glycol-Citraconsäure

BAD ORIGINAL /

säure, Benzolsulfonsäure und SuIfaminsäure, die ebenfalls als salzbildende Säuren für die Additionssalze verwendet werden können. Wenn es gewünscht ist, eine erfindungsgemäße Verbindung in Form der freien Basen zu isolieren, kann dies nach üblichen Verfahrensweisen erfolgen, wie durch Lösen des isolierten oder nicht-isolierten Salzes in Wasser, Behandeln mit einem geeigneten alkalischen Material, Extrahieren der freigesetzten freien Base mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, Trocknen des Extrakts und Verdampfen zur Trockne oder fraktioniertes Destillieren, um das freie basische Amin zu isolieren.

Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Linderung, .Erleichterung, Milderung oder Hemmung der Manifestationen bestimmter physiologisch-psychologischer Anomalien von Tieren durch Verabreichen einem lebenden Tier, einschließlich dem Menschen, einer angemessenen Menge eine Verbindung der Formel I oder eines nicht-toxischen Säureadditiontsalzes davon. Eine angemessene Menge würde von etwa 0,5 mg bis etwa 20 mg/Körpergewicht Je Tag von etwa 20 mg bis etwa 200 mg je Tag bei der oralen Verabreichung betragen.

Die Erfindung ist nicht auf die genauen Details der Herstellungsverfahren oder auf die genauu Verbindung oder Zubereitungen gemäß dem Beispielen beschränkt. Offensichtliche Änderungen und Äquivalente sind dem Fachmann ersichtlich.

BAD ORIGfNAL

Claims

3H5474 Patentansprüche

1. 3-Substituierte 4,5,6,7-Tetrahydroisoxazolo [5,4-c] pyrldinverbindungen der allgemeinen Formel

Il

0 - 0 - R

in der R eine verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 17 Kohlenstoffatomen einschließlich, eine Phenylgruppe, die gegebenenfalls mit 1 oder 2 Gruppen, ausgewählt aus niederen Alkylgruppen, niederen Alkoxygruppen und Halogenatomen substituiert ist , eine PhenylalkjLgruppe, eine

1 2 niedere Alkyloxygruppe oder eine Gruppe von -NR R , in der

1 2
R und R Jeweils Wasserstoff, eine niedere Alkyl-, Phenyl- oder Cyclohexylgruppe bedeuten, und deren pharmazeutisch unbedenklichan Säureadditionssalze.

2. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1, sowie deren pharmazeutisch unbedenkliche Salze, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel

OH

I II

in der R^ eine Schutzgruppe für die Aminogruppe ist, die f⁴

ί leicht entfernbar ist, mit einem reaktiven Derivat einer Säure der Formel R-COOH, in der R die genannte Bedeutung · hat, umsetzt und anschließend die Schutzgruppe R abspaltet

3U5474

und die Verbindung der Formel I als freie Base oder in Form eines pharmazeutisch unbedenklichen Säureadditionssalzes isoliert.

3. Arzneimittel, enthaltend als Wirkstoff einer Verbindung der allgemeinen Rrmel I nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon, zusammen mit einem üblichen p^rmazeuti sehen Träger oder Excipienten.

4. Arzneimittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich eine kleinere Menge eines Tranquillizers oder Neuroleptikums enthält.