DE3117710A1 - Verfahren und vorrichtung zum trennen von partikeln, insbesondere thrombozyten aus einer fluessigkeit - Google Patents
Verfahren und vorrichtung zum trennen von partikeln, insbesondere thrombozyten aus einer fluessigkeitInfo
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Description
Patentanwälte ■ European Patent Attorneys
München
T18 P1 D
THE INSTITUTE OP MEDICAL SCIENCES
Verfahren und Vorrichtung zum Trennen von Partikeln, insbesondere Thrombozyten aus einer Flüssigkeit
Priorität: 05. Mai 1980
USA-Ser.No. 146461 USA-Ser.No. 146462
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung
zum Trennen von in ihrer Größe und/oder Dichte unterschiedlichen fein verteilten festen Partikeln, wie zum
Beispiel Thrombozyten bzw. Blutplättchen oder anderen Blutzellen, aus einer Flüssigkeit.
Die Transfusion von Thrombozyten wird bei der Therapie zur Behandlung von Hämorrhagie bei Patienten mit Thrombopenie
und Thrombopathie in weitem Umfange angewandt. Sie ist unentbehrlich
bei Behandlungsprograramen für akute Leukämie, aplastische Anämie, von Thrombozytenmangel sowie als Ersatztherapie
bei größeren operativen Eingriffen.
Die Thrombozyten werden aus dem gesamten Blut als Thrombozyten-angereichertes
Plasma (PEP) durch Prozeduren getrennt, bei denen ein Zentrifugieren angewandt wird. Die Transfusion
von Thrombozyten wird meistens in Form von Thrombozyten-Konzentraten
(PG) durchgeführt, welche durch Zentrifugieren von PRP mit hoher Geschwindigkeit präpariert wurden. Um für
einen therapeutischen Erfolg eine ausreichende Anzahl von Thrombozyten zu erhalten, werden mehrere Bluteinheiten benötigt.
Durch Verwendung von Blut von mehreren verschiedenen Blutspendern werden die Risiken der Isoimmunisierung und der
Übertragung von Krankheiten vergrößert. Um genug Thrombozyten von einem einzigen Blutspender zu erhalten, wird die
sogenannte Technik der "Plasmapheresis" (Wiederzuführung
von Blut nach Waschung in physiologischer Kochsalzlösung unter Ausscheiden des Blutplasmas) angewandt, bei dem thrombozytenarmes
Plasma (PPP) und zusammengepackte rote Blut-
körperchen (EBC) in den Blutkreislauf des Spenders zurückgeführt werden. Das allgemein verwendete Verfahren der Zentrifugierung
mit geringer Geschwindigkeit in üblichen Einrichtungen, das "bei den meisten Blutbänken vorhanden sind,
ist mühsam, sehr zeitaufwendig und ergibt Thrombozyten, die in hohem Maße mit weißen Blutkörperchen (WBC) und RBCs
kontaminiert sind; weiterhin ergibt dieses Verfahren eine geringe Ausbeute an Thrombozyten. Durch Anwendung einer
spezialisierten Blutverarbeitungseinrichtung, die unter dem Namen "Haemonetics-30" bekannt wurde, wurde eine beträchtliche
Verbesserung bei der Bereitstellung von Thrombozyten erreicht, bei dem zwei bis vier Einheiten von PC von einem
einzigen Blutspender gesammelt werden konnte. Bei diesem als "Plateletpheresis" bekannten Verfahren wird das Blut direkt
von dem Spender durch eine rotierende Dichtung hindurch in einen Plastikbehälter einer Zentrifuge gepumpt. Die Blutkomponenten
werden dadurch getrennt, daß konzentrische Bänder gebildet werden, die in einer Reihenfolge, die von der spezifischen
Dichte abhängt, überströmt werden, wobei die einzelnen Komponenten aus dem Behälter herausfließen. Diese
Technik ermöglicht Jedoch lediglich eine mittlere Thrombozytenausbeute von 46 % von dem in dem Behälter zirkulierenden
Blut. Will man die für eine therapeutisch wirksame Transfusion benötigten Thrombozyten in der Größenordnung von 4- χ
11
10 Thrombozyten sammeln, so müssen mindestens 6 1 Blut verarbeitet werden, was zwei bis drei Stunden der Zeit des Blutspenders beansprucht. Dieser Vorgang ist daher zeitaufwendig und teuer. Auch fordert die Anschaffung dieser teuren Ausrüstung eine hohe Anfangsinvestition. Die mit dieser Technik gesammelten Thrombozyten sind in hohem Ausmaße mit weißen und roten Blutkörperchen (WBC und RBC) kontaminiert. Die Anwendung von Thrombozyten-Konzentrat, das mit weißen
10 Thrombozyten sammeln, so müssen mindestens 6 1 Blut verarbeitet werden, was zwei bis drei Stunden der Zeit des Blutspenders beansprucht. Dieser Vorgang ist daher zeitaufwendig und teuer. Auch fordert die Anschaffung dieser teuren Ausrüstung eine hohe Anfangsinvestition. Die mit dieser Technik gesammelten Thrombozyten sind in hohem Ausmaße mit weißen und roten Blutkörperchen (WBC und RBC) kontaminiert. Die Anwendung von Thrombozyten-Konzentrat, das mit weißen
♦ *
Blutkörperchen kontaminiert ist, kann zu schweren Komplikationen
beim Patienten führen. Thrombozyten und weißen Bluthumane
körperchen sind/Leucozyten-Antigene (UM) gemeinsam,
welche aufgrund .von weißen Blutkörperchen stärker immunisierend sind als aufgrund von
Thrombozyten. Im Ergebnis kann eine Kontaminierung mit weißen Blutkörperchen für eine Alloimmunisierung bei Patienten verantwortlich
sein, die ihrerseits bei jeder nachfolgenden Transfusion eine zunehmende Verringerung der hämostatischen
(blutstillend) Wirksamkeit der Thrombozyten führt und in schlimmeren Fällen zu einer post-transfusionalen Thrombopenie.
Weiterhin gibt es Körpersystem-Reaktionen, die innerhalb von 20 Minuten nach beendigter Thrombozytentransfusion
auftreten und die Schüttelfrost oder Fieber mit sich bringen. Antikörper gegen kontaminierende Leucozyten spielen bei diesen
Reaktionen eine Rolle. Aufgrund dieser Nebenwirkungen ist die Entfernung der kontaminierenden weißen Blutkörperchen von dem
Thrombozyten-Konzentrat durch Differential-Zentrifugierung
strengstens empfohlen, was das Verfahren weiter verkompliziert. Aus obigem wurde deutlich, daß ein starkes Bedürfnis
nach einer verbesserten Thrombozyten-Sammel-Technik besteht, bei dem diese sicherer und beim Sammeln von Thrombozyten-Konzentrat
wirkungsvoller ist, d. h. zu einer höheren Ausbeute führt, frei von weißen Blutkörperchen ist, kürzere Zeit
und geringere Kosten erfordert, als die bisher bekannten Techniken.
Kurz zusammengefaßt bezieht sich die Erfindung allgemein auf eine Zentrifugentrennung von fein verteilten festen Körperchen.
Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein neues Verfahren und eine Vorrichtung zum zentrifugalen Trennen von
festen Körperchen, die hinsichtlich Größe und./oder Dichte
unterschiedlich sind, beispielsweise Thrombozyten und andere
Blutzellen oder verschiedene Arten von synthetischen Partikeln oder Kügelchen.
Die Technik des Trennens fein verteilter unterschiedlicher fester Körperchen basiert in weitem Umfang auf einer Differentialsedimentation
mittels Zentrifugieren. Die Hauptprobleme bei diesem Verfahren liegen darin, daß kleine Partikel
von größeren Partikeln partiell eingefangen v/erden und darin, daß kein eng definierter Endpunkt der Trennung während der
Sedimentation existiert. Die Anwender stehen daher einer Kompromißsituation gegenüber, bei der bei der Vergrößerung
der Ausbeute der -getrennten Partikel deren Reinheit verringert ist und umgekehrt.
Hiervon ausgehend ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren und eine Vorrichtung zur Trennung von
fein verteilten festen Körperchen, die hinsichtlich Größe und/oder Form unterschiedlich sind, zu schaffen, bei dem
eine maximale Ausbeute und eine maximale Reinheit der getrennten Partikel erzielt wird.
Diese Aufgabe wird durch die im Kennzeichenteil des Patentanforderers
1 angegebenen Merkmale gelöst„
Zur Lösung dieser Aufgabe wurden die bekannten Verfahren und Systeme, die als "Gegenstrom-Zentrifugierung (CC) oder zentrifugale
Elution" (CE) bekannt sind, wesentlich modifiziert, um sie für diese neue Verwendung anzupassen.
Bei dem CE-Verfahren und -System, das von der Firma ßeckman Company entwickelt wurde, wird die Trennung der Partikel in
einer Trennkammer innerhalb des "EIutriator"-Rotors ausgeführt.
Die Neigung der Partikel, sich in einem zentrifugalen Feld abzusetzen, wird in der Kammer durch einen Flüssigkeitsstrom
in entgegengesetzter Richtung ausgeglichen. Durch Vergrößerung der Durchflußgeschwindigkeit werden die kleineren
Partikel ausgewaschen, während die größeren oder dichteren Partikel in der Kammer bleiben. Um die Trennung von Partikeln
auszuführen, wird ein großes Flüssigkeitsvolumen mit relativ hoher Durchflußgeschwindigkeit durch die Trennkammer geleitet.
Das Pumpen der Flüssigkeit in den Rotor hinein und durch die Trennkammer hindurch wird mittels einer Rotations-Dichtung
ausgeführt. Obwohl das Beckman-System und das entsprechende Verfahren bei der Trennung von Blutkörperchen wie
zum Beispiel Granulocyten, Monocyten und jungen roten Blutkörperchen
erfolgreich angewandt wurden, sind sie für die Trennung von Thrombozyten nicht geeignet.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung basiert auf experimentellen Studien von (Zentrifugen)-Kammern
mit unterschiedlicher Konfiguration. Eine Konfiguration mit konischer Form und größerem Volumen als der Beckman-Kammer,
d. h. mit einem Volumen von 10,5 ml anstelle von 4,5 ml wurde
für die Trennung von Thrombozyten als äußerst günstig gefunden. Die Gründe hierfür liegen darin, daß eine konische
Kammer mit einem öffnungswinkel von etwa 40° einen steilen
und gleichförmigen Gradienten für die Flüssigkeitsgeschwindigkeit erzeugt, der dem Gradienten der Zentrifugalkraft entgegengesetzt
ist, wodurch ermöglicht wird, daß Blutzellen in stabilem Gleichgewicht als dichte Zellensuspension mit
einer scharfen oberen Grenze gehalten werden, die die physikalischen Eigenschaften eines Wirbelbettes von Partikeln
aufweist. Dieses Wirbelbett von Blutzellen wirkt als
-4Ά-
Tiefenfilter, das den Thrombozyten erlaubt, frei hindurchzulaufen,
während es alle anderen Blutzellen in der Kammer zurückhält. Ein wichtiger Unterschied dieses Verfahrens gegenüber
dem Beckman-Verfahren liegt darin, daß eine sehr kleine Durchflußgeschwindigkeit von 5,5 ml/min und ein kleines
Volumen des Mediums von 5 bis 8 ml für die Trennung von Thrombozyten benötigt wird, während bei der Trennung von
anderen Blutzellen durch das Beckmansche CE-Verfahren Durchflußgeschwindigkeiten
von 15 bis 25 ml/min und Volumina des Mediums von 700 bis 1000 ml benötigt werden. Auch erfordert
die Trennung von Thrombozyten bei dem erfindungsgemäßen Verfahren etwa 2 Minuten, während die Trennung anderer Blutzellen
etwa 40 bis 60 Minuten erfordert. Im Ergebnis kann der
Trennungsprozeß der vorliegenden Erfindung als Verschiebungsprozeß, der mit einer Piltrierung kombiniert ist, charakterisiert
werden, bei dem ein kleines Volumen einer Kochsalzlösung das PRP von dem übrigen Blut schnell verdrängt.
Im Gegensatz hierzu verwendet die Zelltrennung bei dem CE-Verfahren
eine Geschwindigkeitsablagerung durch Auswaschen mit großen Volumina eines Mediums. Die Existenz der Filtrierwirkung
in einem solchen Wirbelbett aus Blutzellen, die in der Trennkammer enthalten sind, wird unterstützend expermentell
dadurch belegt, daß erfolglose Versuche zum Entfernen von Kontaminierungen mit roten und weißen Blutkörperchen
aus den PRP-Präparationen durchgeführt wurden, welche von der erwähnten "Haemonetics-30" Blutverarbeitungsmaschine gesammelt
wurden. Offensichtlich konnte die Anwesenheit einer weitaus größeren Anzahl von Blutzellen in dieser PRP-Präparation,
im Vergleich zu der des gesamten Blutes, die selbststabilisierende
und filternde Wirkung des Wirbelbettes von Blutzellen nicht erreichen, was zu einer Verschiebung einer
großen Anzahl von roten und weißen Blutkörperchen mit der PEP führte.
- sr-
Mit der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren angegeben,
mit dem thrombozyten—angereichertes Plasma (PRP) aus
dem gesamten Blut getrennt werden kann, indem eine Trennkammer mit Blut außerhalt» des Rotors vorgefüllt wird, im
Gegensatz zum Beschicken der Kammer während des Zentrifugierens bei dem Beckmanschen Verfahren. Das Beckmansche
Verfahren zum Beschicken mit Blut wurde für die Trennung
von Thrombozyten als vollständig ungeeignet befunden, da häufig das Zusammenkleben von Blutzellen auftrat, was zu
einer Blut-Hämolyse führte, die von einem Freisetzen von
Adenosindiphosphat (ADP) begleitet war. Letzteres bewirkt offensichtlich, daß sich die Thrombozyten mit dem ADP verklumpen,
was dann ihre Trennung verhindert. Durch vorhergehendes Beschicken der Kammer mit Blut, wird dieses Problem
vollständig beseitigt.
Weiterhin wird mit dem neuen Verfahren der vorliegenden Erfindung
ermöglicht, daß zu Beginn am oberen Ende der Kammer während des Zentrifugierens für 1 Minute ein von Blutzellen
freier Raum vorhanden-ist, ohne daß der Gegenstrom der Kochsalzlösung
eingeschaltet ist. Dies verhindert eine sofortige Elution von Blutzellen von dem oberen Ende der Kammer, was
andererseits die Austrittslinie kontaminieren würde und das Sammeln von reinem PRP verhindern würde.
Weiterhin kann mit der vorliegenden Erfindung ein in sich abgeschlossenes, unabhängiges System für die Trennung von
unterschiedlichen festen Partikeln geschaffen werden, bei dem der Beckmansche "Elutriator"-Rotor nicht angewandt
werden muß. Hierdurch kann das externe Pumpensystem des Beckmanschen Systems durch ein internes Pumpemsystem ersetzt
werden, welches eine Kolbenpumpe verwendet, die in die
die Kammer enthaltende Einheit integriert ist. Diese Ein~
heit wird als Einsatz für eine Zentrifuge verwendet, die mit einem schwingenden Becher ausgerüstet ist. Die Pumpe
in der Einheit wird über die Zentrifugalkraft mit Energie versorgt; sie sorgt für den erforderlichen Iluid-Strom innerhalb
der Trennkammer, wobei dieser Fluid-Strom der Zentrifugalkraft
entgegengerichtet ist. Die Durchflußgeschwindigkeit wird über ein Nadelventil gesteuert. Generell werden
bei dem Verfahren und bei der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung rote und weiße Blutkörperchen aufgrund der Zentrifugalkraft
in einem stabilen Gleichgewicht in einer vorzugsweise konischen Kammer gehalten, während das thrombozyten-reiche
Plasma (PHP) durch ein äquivalentes Volumen normaler Kochsalzlösung verdrängt wird, welche durch die
Suspension der Blutzellen im wesentlichen entgegensetzt zur Richtung der Zentrifugalkraft filtert. Das flüssige Medium
tritt am Scheitel der konischen Kammer ein, wobei der Scheitel in Richtung fort von der Rotationsachse orientiert ist; hierdurch
ist das flüssige Medium am zentrifugal äußeren Ende der
Kammer, während das PRP an der Basis der Kammer austritt, die durch das zentrifugal innere Ende der Kammer gebildet ist.
Der Flüssigkeitsstrom wird mittels einer Kolbenpumpe in Abhängigkeit von der Zentrifugalkraft erzeugt.
Die Vorrichtung ist als Einsatz aufgebaut, der bei einem schwingenden Becher einer Zentrifuge angewandt wird. Sie besteht
aus einem Zylinder und einem Kolben, wobei der Kolben sowohl die konische Trennkammer an seinem unteren Ende als
auch die das PRP aufnehmende Kammer an seinem oberen Ende aufweist. Ein Nadelventil in dem Kolben steuert die Durchflußgeschwindigkeit
des durch den Zylinder fließenden Mediums über einen Durchtrittsweg, der zu dem zentrifugal äußeren
-45-
Ende der konischen Kammer führt. Um eine unmittelbare Entnahme von Blutzellen aus der konischen Kammer aufgrund des
Flusses der Kochsalzlösung beim Beginn des Zentrifugierens
zu verhindern, sind Steuereinrichtungen vorgesehen, die die
Bewegung des Kolbens in dem Zylinder verhindern, bis maximale Zentrifugalkraft wirkt. Die Steuereinrichtung enthält
einen O-Ring an dem Kolben, der in einer Rille oder Nut in
der Wand des Zylinders aufgenommen wird. Hierdurch wird ermöglicht, daß Blutzellen von dem zentripetalen Ende der
Kammer ferngehalten werden; dies wird dadurch erreicht, daß Zellen bei geringer Zentrifugierungsgeschwindigkeit, die für
eine Minute angewandt wird, abgelagert werden; danach wird die Zentrifugierungsgeschwindigkeit auf den benötigten höheren
Wert angehoben, bei welchem dann der O-Ring aus der Rille bzw. Nut heraustritt, wobei der Kolben dann beginnt, das
Medium von dem Zylinder in die konische Kammer zu fördern.
Es wird also ein unabhängiges System geschaffen,-mit dem PRP
aus dem gesamten Blut mit hohem Wirkungsgrad gesammelt werden kann, vorzugsweise von einem einzigen Blutspender. Dieses
Blut ist frei von anderen Blutzellen und hinsichtlich Quantität und Qualität mit den bei Blutbänken und Krankenhäusern
praktizierten Anforderungen kompatibel. Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung schafft ein vollständig
versiegeltes, zum einmaligen Gebrauch bestimmtes billiges System, welches aus drei miteinander verbundenen
kollabilen Plastikbehältern besteht, die über eine stabile Halterung zusammengehalten werden, welche in den Zentrifugenbecher
eingepaßt ist. Insbesondere enthält dieses System gemäß der vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung drei Behälter,
die aus einem mittleren Behälter, vorzugsweise in konischer Form, der mit Blut gefüllt ist und als Trennkammer
wirkt, einen unteren Behälter, der normale Kochsalzlösung
enthält, die das PRP aus dem mittleren Behälter verdrängt und schließlich einen oberen Behälter, der das aus dem
mittleren Behälter verdrängte PEP aufnimmt. Dieses System ist vollständig steril und ermöglicht während aller Verfahrensschritte
eine aseptische Handhabung.
Weiterhin wird mit der vorliegenden Erfindung der Start des Fluid-Stromes während des Beginns der Zentrifugierung für
ungefähr eine Minute verzögert, wodurch zu Beginn des Vorganges am oberen Ende der Kammer ein von roten und weißen
Blutkörperchen freier Raum geschaffen wird. Dies wird entweder durch einen elastischen O-Ring erreicht, der um einen
Kolben herum liegt und in eine Rille an einer Innenwand des Zylinders eingreift, welcher den O-Ring so lange an seinem
Platz hält, bis die Zentrifugalkraft einen gewissen vorgegebenen Wert erreicht hat oder dadurch, daß ein federbelastetes
Ventil eingebaut ist, das bei einer gewissen vorgegebenen Beschleunigungskraft öffnet.
Im folgenden wird die Erfindung an Hand mehrerer Ausführungsbeispiele
im Zusammenhang mit der Zeichnung ausführlicher erläutert. Es zeigt:
Pig. 1: eine Draufsicht auf eine Trennkammer;
Fig. 2: eine vertikale Schnittansicht der Trennkammer längs der Linie 1-1 der Fig. 1;
Fig. 3: eine vertikale Schnittansicht der Vorrichtung, geschnitten
längs der zentralen Achse, wobei ein Kolben in seiner oberen Stellung ist;
Fig. 4: eine vertikale Schnittansicht der Vorrichtung, genommen
längs der vertikalen Mittelachse, wobei der Kolben in der unteren Stellung ist;
Fig. 5: eine vergrößerte Schnittansicht der Vorrichtung, genommen
längs der vertikalen Mittelachse gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung, bei dem
drei kollabile Behälter in den Zentrifugenbecher eingesetzt sind;
Fig. 6: eine vertikale Schnittansicht, genommen längs der vertikalen Mittelachse, wobei die Vorrichtung in
zerlegtem Zustand und mit leeren Behältern gezeigt ist;
Fig. 7J eine vertikale Schnittansicht ähnlich Fig. 6, bei
der die Vorrichtung teilweise zusammengesetzt ist und bei der zwei Behälter gefüllt sind;
Fig. 8: eine vertikale Schnittansicht der Vorrichtung, genommen längs der vertikalen Mittelachse, wobei die
Vorrichtung in einen Zentrifugenbecher eingesetzt ist und in der oberen Stellung in dem Becher verriegelt
ist;
Fig. 9: eine vertikale Schnittansicht der Vorrichtung, genommen längs der vertikalen Mittelachse, bei der die
Vorrichtung in ihrer unteren Stellung in dem Zentrifugenbecher ist;
Fig. 10: eine vertikale Schnittansicht des Zentrifugenbechers,
genommen längs der vertikalen Mittelachse, wobei der Zentrifugenbecher einen eingesetzten Behälter enthält
und wobei die Trennung von PPP und PC in dem Behälter gezeigt ist;
Fig. 11: eine vertikale Schnittansicht des konischen Behälters zusammen mit dessen Satellitenbehälter, genommen
längs der vertikalen Mittelachse, wobei beide Behälter in invertierter Stellung gezeigt sind und
mit einer Blut-Reinfusionsleitung verbunden sind;
3?ig. 12: eine vergrößerte fragmentarische vertikale zentrale
Schnittansicht durch eine kapillare Einlaßöffnung und ein Kugelventil am Boden des konischen Behälters;
Fig. 13: eine vergrößerte vertikale Schnittansicht einer weiteren Version einer Anordnung zum Trennen von
Thrombozyten, genommen längs der vertikalen Mittelachse, wobei Einrichtungen zum Regulieren der Durchflußgeschwindigkeit
und zum Trennen der kollabiLen Behälter dargestellt sind;
Fig. 14: eine fragmentarische Schnittansicht eines modularen Einsatzes, der ein Nadelventil für die Regulierung
der Durchflußgeschwindigkeit und einen Verbindungsnippel aufweist, genommen längs der Linie 16-16 der
Fig. 13; und '
Fig. 1^5: eine fragmentarische Schnittansicht durch einen
modularen Einsatz, der ein Nadelventil zum Regulieren der Durchflußgeschwindigkeit und ein durch
Zentrifugalkraft betätigtes federbelastetes Ventil enthält.
Gleiche oder funktionsmäßig gleiche Teile der einzelnen Ausführungsbeispiele sind in den Fig. mit gleichen Bezugszeichen
versehen.
Die in den Fig. 1 und 2 dargestellte Vorrichtung zeigt eine Trennkammer, die mit dem Beckmanschen JE-6 Elutriator-Rotor
und der Beckmanschen J-21 Präparations - Zentrifuge arbeitet. Der Hauptkörper der Kammer 2 hat einen konischen
Hohlraum 3 und einen mittels eines O-Ringes 5 abgedichteten
Deckel 4. Der Deckel 4· hat zwei öffnungen 6 und 7· Die zentrale
öffnung 6 ist die Einlaßöffnung und die exzentrisch liegende Öffnung 7 ist die Auslaßöffnung. Beide Öffnungen
sind mit O-Ringen 8 und 9 abgedichtet. Ein Rohr 10 ist durch die zentrale öffnung 6 hindurch eingesetzt und mündet dicht
oberhalb des Bodens der Kammer 3. Der Deckel 4· hat eine Ausnehmung
11, die dazu dient, die richtige Stellung der Kammer in dem Beckmanschen Elutriator-Rotor festzulegen.
Die in den Fig. 1 und 2 gezeigte Trennkammer ist optimal für
die Trennung von Thrombozyten aus Blut geeignet. Die Form der Kammer wurde nach aufwendigen experimentellen Testreihen verschiedener
Kammern mit verschiedenen geometrischen Formen erhalten. Bei diesen Testreihen wurden verschiedene konische
Formen mit verschiedenen Öffnungswinkeln, parabolische Kammern mit und ohne Erweiterung an ihrem breiteren Ende als auch die
Beckmansche Kammer verwendet. Letztere wurde für die Trennung von Thrombozyten für vollständig unwirksam befunden.
Das von der Firma Beckman Company entwickelte Zentrifugal-Elutions-Verfahren
für die Trennung von verschiedenen Zellen und Partikeln wurde für den vorliegenden Zweck ebenfalls für
ungeeignet befunden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Trennen von Thrombozyten
oder spezieller zum Abtrennen von thrombozyten^angereicher-=
tem Plasma (PEP) aus Blut ist wie folgt% Die Trennkammer
(Fig. 1 und 2) wird in den Elutriator~Rotor eingesetzt und das Beckmansche System wird mit Kochsalzlösung "geladen", wobei
vorhandene Luft entfernt wird. Der Rotor wird dann auf
eine Seite gesetzt, ohne daß die Rotations-Dichtung von *, dem externen Strömungssystem abgetrennt w.rd ο Dann wird die
Kammer sorgfältig entfernt, ohne daß Luft in das Stömungssystem gelassen wird» Die Kochsalzlösung wird dann aus der
Kammer entfernt, worauf die Kammer mit AC antikoaguliertem
menschlichem Blut gefüllt wird. Die Einlaß-und Auslaßöffnun»
gen werden mit einem Streifen einer Plastikfolie bedeckt, die zuvor mit Silikonfett bestrichen ximrdeo Dann wird die Kammer
in den Elutriator-Rotor eingesetst und der Kunststoffstreifen
wird abgezogene Das Abdecken der Kammeröffnungen mit dem Plastikstreifen verhindert ein Verschütten von Blut und den
Eintritt von Luft in das System. Die Zentrifuge wird dann mit 25ΟΟ Upm gedreht und nach einer Minute nach dem Beginn des Zentri
fugierens wird eine Elution mit niedriger Durchflußgeschwindigkeit von 3»5 ml/min eingeleitet. Der Elutionsfluß muß für
eine Minute aufrechterhalten werden, um das obere Ende der Trennkammer von partiellen Absetzungen roter Blutkörperchen
und weißer Blutkörperchen zu befreien, um eine Kontaminierung des PRP zu verhindern. Zwei Minuten nach Beginn des Zentrifugierens
wird das Sammeln der Thrombosyten begonnen. Die
ersten zwei ml enthalten nur thrombozyt?en.=reines Plasma (PPP),
während die darauffolgend eluierten 6 bis 8 ml des PRP etwa 90 % der Gesamtmenge der Thrombozyten des Blutes enthalten.
Gleiche oder funktionsmäßig gleiche Teile der einzelnen
Ausführungsbeispiele sind in den Fig. mit gleichen Bezugszeichen versehen.
Die in den Pig. 1 und 2 dargestellte Vorrichtung zeigt eine
Trennkammer, die mit dem Beckmanschen JE-6 Elutriator-Rotor
und der Beckmanschen J-21 Präparations - Zentrifuge arbeitet. Der Hauptkörper der Kammer 2 hat einen konischen
Hohlraum 3 und einen mittels eines O-Ringes 5 abgedichteten
Deckel 4. Der Deckel 4 hat zwei öffnungen 6 und 7· Die zentrale
Öffnung 6 ist die Einlaßöffnung und die exzentrisch liegende Öffnung 7 ist die Auslaßöffnung. Beide Öffnungen
sind mit O-Ringen 8 und 9 abgedichtet. Ein Rohr 10 ist durch
die zentrale Öffnung 6 hindurch eingesetzt und mündet dicht oberhalb des Bodens der Kammer 5· Der Deckel 4 hat eine Ausnehmung
11, die dazu dient, die richtige Stellung der Kammer in dem Beckmanschen Elutriator-Rotor festzulegen.
Die in den Fig. 1 und 2 gezeigte Trennkammer ist optimal für die Trennung von Thrombozyten aus Blut geeignet. Die Form der
Kammer wurde nach aufwendigen experimentellen Testreihen verschiedener Kammern mit verschiedenen geometrischen Formen erhalten.
Bei diesen Testreihen wurden verschiedene konische Formen mit verschiedenen Öffnungswinkeln, parabolische Kammern
mit und ohne Erweiterung an ihrem breiteren Ende als auch die Beckmansche Kammer verwendet. Letztere wurde für die
Trennung von Thrombozyten für vollständig unwirksam befunden. Das von der Firma Beckman Company entwickelte Zentrifugal-Elutions-Verfahren
für die Trennung von verschiedenen Zellen und Partikeln wurde für den vorliegenden Zweck ebenfalls für
ungeeignet befunden.
-Si-
Das unter Anwendung der in den Fig. 3 und 4- gezeigten Vorrichtung
durchgeführte Verfahren zum Abtrennen von Thrombozyten
beginnt mit dem Pullen des unteren Teiles des Zylinders
15 mit 15 ml Kochsalzlösung über die Einlaßöffnung 20
und darauffolgendes Schließen des Ventiles 21. Die konische Kammer 14 wird dann mit 21 ml AC-koagulationsgehemmtem Blut
gefüllt. Die Vorrichtung wird dann in den schwingenden Becher der Zentrifuge eingesetzt und für eine Minute mit ca. 500 Upm
gedreht, um den oberen Teil der Kammer von Blutzellen freizuhalten. Danach wird die Zentrifugendrehzahl auf ca. 2000
Upm enöht. Bei dieser höheren Zentrifugalkraft schnappt der 0-iing 17 aus der Rille 18, wobei der Kolben 12 abzusinken
beginnt und hierdurch die Pumpwirkung einleitet. Die DurchfLußgeschwindigkeit ist über das Nadelventil 22 auf ungefähr
5 ml/min voreingestellt, so daß die gesamte Kochsalzlösung ungefähr in 3 Minuten aus dem Zylinder (Pig. 4·) in
die Trsnnkammer 14- gepumpt wird und hierdurch das gesamte
PRP aus dem Blut in die obere Sammelkammer 19 verdrängt. Für das Reinigen der Sammelkammer 19 sind die Schraubanordnung
und ein O-Ring 23 vorgesehen, der sie gegenüber der konischen
Kammer 19 abdichtet.
Die mit dem in den Fig. 3 und 4· dargestellten System gesammelten
Thrombozyten sind sogar reiner als diejenigen, die mit dem obon beschriebenen Verfahren unter Anwendung des Elutriator-Ro:;ors
und der in den Fig. 1 und 2 gezeigten Kammer erhalten wurden. Es wurden mehr als 10 Zellen unter einem
Mikrosl'.op analysiert, wobei kein einziges weißes oder rotes
Blutkörperchen gefunden wurde. Dieses System erlaubt also das Sammeln von nahezu 90 % der gesamten Thrombozyten des Blutes.
Die durch dieses System isolierten Thrombozyten waren hinsichtlich ihrer Funktion ebenso wirksam wie die mit dem
zuvor beschriebenen System der Fig. 1 und 2 isolierten Thrombozyten.
Ci 11 77
Die in den Pig. 5 und 6 bis 12 gezeigte Ausführungsform der
Erfindung ist als einmal verwendbares System aufgebaut, das aus drei kollabilen, d.h. zusammenklappbaren Behältern besteht,
die vollständig abgedichtet sind. Dieses System ermöglicht während aller Verfahrensschritte vollständig steril
zu arbeiten. Dieses System erfüllt somit alle gesetzlichen
Auflagen (beispielsweise der PDA; Pood and Drug Administration)
für die Sicherheit bei der Anwendung beim Menschen. Dieses System besteht aus einem konischen Behälter 31, der
als Trennkammer dient. Dieser konische Behälter 31 ist in
einer festen Halterung 32 gehalten, die in zwei Hälften (Fig.
6) geteilt ist und die einen konischen Hohlraum besitzt.
Unterhalb des konischen Behälters 31 ist ein Satellitenbehälter
33 befestigt, der mit dem Elutions-Medium, wie zum
Beispiel normaler Kochsalzlösung, gefüllt ist. Der Satellitenbehälter 33 ist mit dem konischen Behälter 13 mittels einer
kurzen kapillaren Röhre 34- (Pig· 5 und 12) verbunden, welche
mit einer kleinen Kugel 35, die als Kugelventil dient, bedeckt ist. Auf einer Seite des Satellitenbehälters 33 ist
ein Absperrorgan 36 für das sterile Einfüllen des Mediums
in dem Behälter 33 vorgesehen. Die feste Halterung 3<- hält
weiterhin einen Sammelbehälter 371 der oberhalb des konischen
Behälters 31 angeordnet ist. Sowohl der konische Behälter als
auch der Sammelbehälter weisen Durchstech-Verbindungsanordnungen 38 und 39 auf, die eine aseptische Verbindung
und ein aseptisches Trennen dieser Behälter durch einen sterilen Nadelverbinder 4-0 mit zwei (spitzen) Enden ermöglicht.
Um die Durchstech-Verbindungsanordnung 38 an ihrer Stelle zu halten, ist eine ringförmige Klemme *<-5 vorgesehen,
die in die Konstruktion der festen Halterung -j2 integriert
ist, so daß die Verbindungsanordnung 8 währenc der nachfolgenden Verfahrensschritte festgehalten ist, wenn die
beiden Hälften zusammengebaut sind. Beide Hälften der festen Halterung 32 werden durch einen O-Ring 41 zusammengehalten,
der ebenfalls als Schnappring dient, der in die Rille 42 der inneren Wand des Zentrifugenbechers 43 paßt und die feste
Halterung 32 in ihrer oberen Stellung innerhalb des Zentrifugenbechers
hält. Die gezahnte bzw. stufenförmige Ausbildung 44, die am unteren Ende der festen Halterung 32 vorgesehen
ist, dient dazu, ein Verklemmen des Behälters 33 zu verhindern, wenn die Halterung 32 nach unten gleitet und den
Behälter 33 zusammendrückt.
In den Fig. 6 bis 12 sind die einzelnen Verfahrensschritte in
ihrer Ablauffolge gezeigt, die beim Trennen von Thrombozyten
mit dem vorliegenden System ausgeführt werden. Fig. 6 zeigt einen vertikalen Schnitt der Vorrichtung in nicht-zusammengesetzter
Form. Alle drei Behälter 33, 31 und 37 sind leer und zusammengeklappt dargestellt, wobei der obere Sammelbehälter
37 noch nicht angeschlossen ist. In Fig. 7 ist das füllen des konischen Behälters 31 mit Kochsalzlösung und PPP
gezeigt. Der konische Behälter 31 ist als in einer Hälfte der
festen Halterung 32 eingesetzt dargestellt. Fig. 8 zeigt ein zusammengesetztes System, das innerhalb des Zentrifugenbechers
44 angeordnet ist. Der O-Ring 41, der die beiden Hälften der
Halterung 32 zusammenhalt, hält auch die zusammengesetzte Halterung
in der oberen Stellung des Zentrifugenbechers, wo der O-Eing 41 in die Rille 42 des Behälters 43 eingreift. Diese
Halteanordnung erlaubt, daß man die Vorrichtung für ungefähr eine Minute einer Zentrifugierung mit geringerer Geschwindigkeit,
beispielsweise mit 500 Upm unterwirft, um den oberen Bereich
der Kammer von Blutzellen freizuhalten bzw. zu reinigen. Danach wird die Zentrifugiergeschwindigkeit auf ungefähr
2000 Upm erhöht, wobei der O-Ring 41 aus d.er Rille 42 ausrastet.
Hierdurch beginnt die Halterung 32 abwärts gegen den Satellitenbehälter 33 zu gleiten, wodurch Kochsalzlösung durch
-85-
die kapillare Röhre 34 in den konischen Behälter 31 gedrückt
wird. Durch diesen Vorgang wird PRP aus der Blutprobe in den oberen Sammelbehälter 37 verdrängt, wie in Fig. 9 dargestellt.
Danach wird der Sammelbehälter 37 abgetrennt, in einen kleineren Becher einer anderen Zentrifuge (Fig. 10)
eingesetzt und dort mit hoher Drehzahl zentrifugiert, um PC und PPP zu erhalten. Das PPP wird dann mit dem in dem
konischen Behälter 31 (Fig. 7) verbliebenen Blut gemischt
und das sowohl Kochsalzlösung als auch PPP enthaltene Blut wird dem Spender reinfusioniert. Fig. 12 zeigt eine vergrößerte
Schnittansicht der kapillaren Verbindungseinrichtung und des Kugelventiles zwischen dem Satellitenbehälter
33 und dem konischen Behälter 31-
Die in Fig. 13 und 14 gezeigte Vorrichtung ist eine Version
eines vergrößerten Systems der Figur 5, das jedoch lediglich einen zusammenklappbaren Behälter 33 aufweist, der Kochsalzlösung
enthält. Weiterhin hat dieses Syätem eine konische Trennkammer 47, die innerhalb eines zylindrischen Körpers
angeordnet ist, welcher sich unter Einfluß einer Zentrifugalkraft im Inneren des Zentrifugenbechers 43 bewegen kann und
der einen Druck auf den zusammenklappbaren Behälter 33 ausübt. Die das PRP empfangende Kammer 49 ist mittels eines
O-Ringes 20 gegenüber dem zylindrischen Körper 48 oberhalb der Trennkammer 47 abgedichtet. Die Vorrichtung besitzt ebenfalls
ein Nadelventil 51 (Fig- 1*0 für die Regulierung der
Durchflußgeschwindigkeit. Dieses Nadelventil (51) ist innerhalb
eines modularen Einsatzes 52 angeordnet und besitzt einen Nippel zur Verbindung mit dem zusammenklappbaren Behälter 33·
SG-
Fig. 15 zeigt einen modularen Einsatz, der eine mögliche Version einer Anordnung zur Verzögerung des Flüssigkeitsstromes während des Starts des Zentrxfugierungsvorganges
darstellt, bis die maximale Zentrifugalkraft ein Ventil 53 betätigt. Auch hier ist ein Nadelventil 51 vorgesehen, das
die Durchflußgeschwindigkeit steuert.
Leerseite
Claims (15)
- Pat entansprüc he( 1./Verfahren zum Trennen von festen Partikeln aus einer luüssigkeitsprobe, wie zum Beispiel Thrombozyten aus Blut, gekennzeichnet durch folgende Schritte:Die Blutprobe wird in eine Zentrifugenkammer mit inneren und äußeren Enden eingefüllt,die Kammer wird einer anfänglichen Zentrifugalkraft ausgesetzt, die mindestens einen vorgegebenen Minimalwert hat, um die roten Blutkörperchen in der Probe fort von dem inneren Ende der Kammer schichtenweise auszurichten, unddie Kammer wird einer zweiten Zentrifugalkraft ausgesetzt, wobei in das äußere Ende der Kammer eine verdrängende Flüssigkeit aus einem Hohlraum eingespritzt wird, deren Volumen zwischen dem O,2-und 2-fachen des Volumens des Plasmas in der Probe liegt, wobei eine Durchflußge-.etwa
schwindigkeit von weniger als/1,0 ml pro Minute pro ml der Blutprobe für die Verdrängungsflüssigkeit vorgesehen ist und wobei ein mit Thrombozyten angereichertes Plasma von dem inneren Ende der Kammer mit im wesentlichen dem gleichen Volumen und der gleichen Geschwindigkeit verdrängt wird, mit dem bzw. der die verdrängende Flüssigkeit aufgrund der zweiten Zentrifugalkraft auf die Blutprobe aus dem Hohlraum ausgestoßen wird. - 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kammer im wesentlichen einen konischen Querschnitt hat und daß die Verdrängungsflüssigkeit eine gepufferte Koch-salzlösung ist, wobei die Kammer während des Einspritzens einer größeren Zentrifugalkraft unterworfen ist als während des Ausrichtens.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumen der eingespritzten Verdrängungsflüssigkeit ungefähr gleich dem Volumen des Plasmas in der Probe ist und daß die Flüssigkeit mit einer Geschwindigkeit von 0,35 ml pro Minute pro ml der Probe eingespritzt wird.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Einspritzens der Verdrängungsflüssigkeit in die Kammer dadurch ausgeführt wird, daß die Verdrängungsflüssigkeit in einem Halterungshohlraum aufgespeichert ist und die die Blutprobe enthaltende Kammer unter dem Einfluß der Zentrifugalkraft in diesen Hohlraum hinein verschoben wird.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der Kammer eine ausreichende Anzahl von Blutzellen vorhanden ist, um eine dichte Zellensuspension zu bilden, die die Eigenschaften eines Partikel-Wirbelbettes hat und die als Tiefenfilter wirkt, das den Thrombozyten erlaubt, frei hindurchzugelangen, während andere Blutzellen in der Kammer in stabilem Gleichgewichtszustand gehalten werden.
- 6. Vorrichtung zum Trennen fester Partikel aus einer Flüssigkeitsprobe, wie zum Beispiel Thrombozyten aus Blut, gekennzeichnet durch einen Körper (13,4-3), der einer Zentrifugalkraft unterwerfbar ist und der einen Hohlraum (33) aufweist, der ein Volumen einer Verdrängungsflüssigkeit aufnehmen kann, daß in dem Körper (13»4-3) ein Kolben (12,32) vorgesehen ist, der in Abhängigkeit von der Zentrifugalkraft auf ihn in den Hohlraum (33) bewegbar ist, wo-Z-bei der Kolben einer Zentrifugenkammer (14,31) enthält, die innere und äußere Enden aufweist und die die Probe enthält, von der die Partikel getrennt werden sollen, wobei der Kolben einen Einspritz-Durchtrittsweg (15»34-) aufweist, durch den die Yerdrangungsflussxgkeit aus dem Hohlraum (33) zu dem zentrifugal äußeren Ende der Kammer in Abhängigkeit von der Bewegung des Kolbens in den Hohlraum hinein verdrängt wird, daß am zentrifugal inneren Ende der Kammer (14,31) ein Entlade-Durchtrittsweg (16,40) vorgesehen ist, durch den eine mit Partikeln angereicherte Flüssigkeit in Abhängigkeit vom Einspritzen der Verdrängungsflüssigkeit in die Kammer herausführbar ist und daß Einrichtungen (17,18; 31,32; 43) vorgesehen sind, die ein Fließen der Verdrängungsflüssigkeit aus dem Hohlraum in die Kammer verhindern,bevor die zentrifugale Ausrichtung der Blutzellen in der Kammer stattgefunden hat.
- 7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Steuereinrichtungen (17,18; 31,32; 43) vorgesehen sind, die eine Bewegung des Kolbens (12,32) in den Hohlraum (33) hinein so lange verhindern, bis eine minimale Zentrifugalkraft auf den Kolben ausgeübt wird.
- 8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß Steuereinrichtungen einen O-Ring (17;31) enthalten, der in einer Nut (18,32)Λ der Wand des Kolbens (12,32) gehalten ist.
- 9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Steuereinrichtungen ein Ventil (43) in dem Einspritz-Durchtrittsweg enthalten, das durch Zentrifugalkraft betätigbar ist.mm 2P ·*
- 10. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein weiteres Ventil (22,4-1) in dem Einspritz-Durchtrittsweg vorgesehen ist, das die Durchflußgeschwxndigkeit dort hindurch steuert.
- 11. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Blutprobe in der Kammer und ein Volumen gepufferter Kochsalzlösung in dem Hohlraum vorgesehen sind.
- 12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Kochsalzlösung ein Volumen zwischen dem 0,2-fachen und dem 2-fachen des Volumens des Plasmas in der Blutprobe aufweist.
- 13. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein zusammenklappbarer Behälter (33) in d.em Hohlraum vorhanden ist, wobei der Behälter (33) die Verdrängungsflüssigkeit enthält und wobei der Behälter (33) mit dem Einspritz-Durchtrittsweg in Verbindung steht.
- 14·. Vorrichtung nach Anspruch 131 dadurch gekennzeichnet, daß ein zweiter Behälter (31) in der Kammer vorgesehen ist, der die Blutprobe enthält und der mit dem zusammenklappbaren Behälter (33) in dem Hohlraum in Verbindung steht und daß ein dritter Behälter (37) vorgesehen ist, der über den Entlade-Durchtrittsweg mit dem zweiten Behälter (31) zur Aufnahme des mit Thrombozyten angereicherten Plasmas in Verbindung steht.
- 15. Vorrichtung nach den Ansprüchen 13 und 14-, dadurch gekennzeichnet, daß ein Dreifachbehälter (31» 33, 37) vorgesehen ist, der folgendes enthält:-S-Einen Mittelteil (31) mit im wesentlichen konischer Form, der ein zentrifugal äußeres Ende am Scheitel des Konus und ein zentrifugal inneres Ende an dessen gegenüberliegender Seite aufweist, wobei der Mittelteil (31) die Blutprobe enthält,einen zusammenklappbaren Einspritzteil (33) ·, der ein Volumen einer Kochsalzlösung enthält, wobei dieses Volumen kleiner ist als das Volumen des Mittelteiles (31) und wobei der Einspritzteil (33) mit dem zentrifugal äußeren Ende des Mittelteiles (31) in Verbindung steht, zum Einspritzen von Kochsatzlösung in den Mittelteil (31)» wenn der Einspritzteil (33) zusammenklappt, undeinen ausdehnbaren Sammelteil (37), der mit dem zentrifugal inneren Ende des Mittelteiles (31) in Verbindung steht, zum Sammeln des aus dem Mittelteil (31) verdrängten, mit Thrombozyten angereicherten Plasmas.
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