FR2481614A1 - Procede, dispositif et appareil pour separer par centrifugation les plaquettes du sang - Google Patents

Abstract

A.MACHINE A SEMER A LA VOLEE DES SEMENCES DE L'ENGRAIS ET AUTRES MATERIAUX GRANULES OU EN POUDRE. B.MACHINE CARACTERISEE EN CE QU'ELLE COMPREND UNE PLAQUE 11 AVEC UN TROU 12 QUI COINCIDE A LA SORTIE DE LA TREMIE, MUNIE D'UNE GLISSIERE 23 FIXEE SOUS L'OUVERTURE ET AINSI OBLIGE LE MATERIAU A PASSER DE TRAVERS LE DISTRIBUTEUR 1 POUR ETRE SOUMIS A LA FORCE CENTRIFUGE DES PALES 27 DU DISTRIBUTEUR 1. C.L'INVENTION S'APPLIQUE AUX DISTRIBUTEURS DE SEMAILLES, ENGRAIS OU ANALOGUES CAPABLES DE DIRIGER LEUR EPANDAGE SOUS UN ARC PRECIS EN HAUTEUR ET DIRECTION.

Description

La présente invention concerne un procédé et un appareil pour séparer des

particules solides, comme des plaquettes, d'un échantillon liquide tel que du sang et, notamment, pour séparer du sang entier un plasma riche en plaquettes. L'invention est notamment destinée à un service de transfusion de plaquettes. On sait que la transfusion des plaquettes est une forme, maintenant largement utilisée, de thérapie pour le traitement d'une hémorragie chez des patients atteints de thrombocytopénie

et/ou de thrombocytopathie. Cette transfusion est indis-

pensable dans les programmes de traitement de la leucémie aiguë, de l'anémie aplastique, d'une déficience en plaquettes, ainsi que comme thérapie de remplacement au

cours des très grandes interventions chirurgicales.

Dans l'appareil et selon le procédé de l'inven-

tion, on effectue la séparation de particules solides dissemblables, comme des plaquettes et autres globules sanguins, en maintenant à l'aide de la force centrifuge des globules rouges et blancs du sang en équilibre constant dans une chambre, qui est de préférence de forme conique, tout en déplaçant du plasma riche en plaquettes (PRP) à l'aide d'un volume équivalent d'une solution saline physiologique normale qui filtre à

travers la suspension des globules sanguins en se dépla-

çant dans un sens généralement opposé à celui de la force centrifuge. Le milieu liquide entre dans la chambre conique par le sommet de celle-ci qui est orienté

loin du centre de rotation, en se trouvant ainsi à l'ex-

trémité externe de la chambre par rapport à l'effet centrifuge, cependant que le PRP sort de la chambre par la base de celle-ci, qui constitue l'extrémité interne de la chambre pour l'effet centrifuge. L'écoulement du liquide est engendré à l'aide d'une pompe à piston

fonctionnant sous l'effet de la force centrifuge.

L'appareil est conçu pour être inséré dans un godet ou panier oscillant de centrifugeuse, et il consiste en un cylindre et un piston, ce dernier comportant à la fois

la chambre conique de séparation à son extrémité infé-

rieure et la chambre de réception du PRP à son extrémité supérieure. Le piston comporte une soupape à pointeau commandant le débit du milieu s'écoulant du cylindre et passant par le conduit menant à l'extrémité externe

de la chambre conique (par rapport à l'effet centrifuge).

Pour éviter qu'au début de la centrifugation l'écoulement de la solution saline ne provoque une décharge immédiate des globules sanguins de la chambre conique, un dispositif de réglage permet de retenir le mouvement du piston dans le cylindre jusqu'à application d'une force centrifuge maximale. Le dispositif de réglage comprend une bague torique montée sur le piston et qui peut se loger dans une gorge de la paroi du cylindre. Cela permet de faire sortir les globules sanguins de l'extrémité centripète de la chambre en provoquant, par application durant une minute d'une faible vitesse de centrifugation, la sédimentation des globules, après quoi la vitesse de centrifugation est augmentée jusqu'à une valeur supérieure requise à laquelle la bague torique sort brusquement de la gorge et le piston commence à refouler le milieu du

cylindre dans la chambre conique.

On sépare donc ainsi, par des modes opéra-

toires impliquant une centrifugation, les plaquettes sous forme d'un plasma riche en plaquettes (PRP) du sang entier. La transfusion des plaquettes s'effectue le plus souvent sous forme de concentrés de plaquettes (CP) que l'on prépare par centrifugation à grande vitesse de PRP. Il faut plusieurs flacons de sang pour obtenir un nombre de plaquettes qui suffit pour un bon résultat thérapeutique. L'appel à des donneurs multiples augmente les risques d'iso-immunisation et de transmission d'une maladie. Afin d'obtenir suffisamment de plaquettes en provenance d'un seul donneur, il faut appliquer la technique de plasmaphérèse comportant le recyclage dans la circulation sanguine du donneur d'un plasma pauvre

en plaquettes (PPP) et des globules rouges (GR) regroupés.

Le mode opératoire couramment utilisé pour une centrifu- gation à faible vitesse à l'aide de l'équipement de routine se trouvant dans n'importe quelle banque du sang est malcommode prend beaucoup de temps et donne des plaquettes fortement contaminées par des globules blancs (GB) et des globules rouges, tout en n'assurant qu'un faible taux de récupération des plaquettes. Une amélioration considérable dans le domaine de-l'obtention des plaquettes a été réalisée à l'aide d'un équipement spécLaisé de traitement du sang, "Haemonetics-30", qui permet de collecter sur un seul donneur deux à quatre flacons ou unités de concentré de plaquette. Dans ce mode opératoire, connu sous le nom d'enlèvement des plaquettes, le sang est pompé directement du donneur par un joint rotatif dans un bol en matière plastique de centrifugeuse. Les constituants du sang sont séparés en

formant des bandes concentriques qui débordent succes-

sivement du bol ou cuvette selon leur densité spécifique.

Cependant, cette technique ne permet de recueillir en moyenne que 46 % des plaquettes du sang circulant dans le bol. Pour collecter les 4 x 101l plaquettes nécessaires pour une transfusion thérapeutiquement efficace, il faut traiter au moins six litres de sang, ce qui prend de 2 à 3 heures du temps du donneur. L'opération demande beaucoup de temps et elle est onéreuse. De même, il faut un gros investissement initial en capital pour l'achat d'un équipement onéreux. Les plaquettes collectées selon cette technique sont fortement contaminées par des globules rouges et des globules blancs. L'administration de concentrésde plaquettes contaminés par des globules blancs peut susciter de graves complications chez des

patients. Les plaquettes et les globules blancs contien-

nent des antigènes HL-A (antigènE de leucocytes humains ou d'histocompatibilité) qui sont plus immunogènes sur

des globules blancs que les antigènes des plaquettes.

Il en résulte qu'une contamination par des globules blancs peut provoquer une allo-immunisation chez des patients entraînant à son tour, à chaque transfusion successive, une diminution progressive de l'efficacité hémostatique des plaquettes et, dans des cas plus graves, conduisant à de la thrombocytopénie se révélant après une transfusion. Il peut également se produire dans les minutes qui suivent l'achèvement d'une transfusion de

plaquettes des réactions systémiques ou générales consis-.

tant en des frissons et de la fièvre. Des anticorps des leucocytes de contamination sont impliqués dans ces réactions. En raison de ces effets secondaires, il est fortement recommandé d'enlever, par centrifugation différentielle, les globules blancs du concentré des

plaquettes, ce qui complique encore le mode opératoire.

Il est clair qu'il faut améliorer la technique de collecte des plaquettes en la rendant plus sûre et plus efficace afin de permettre de collecter avec un plus

grand rendement des concentrés de plaquettes ne compor-

tant pas de globules blancs et obtenus par une technique demandant moins de temps et qui est moins onéreuse que

les techniques actuellement offertes.

L'invention vise notamment à proposer - un système ou appareil complet, comme décrit ci-dessus, destiné à une collecte efficace du plasma

riche en plaquettes en provenance de sang entier, pro-

venant de préférence du même donneur, ne comportant pas d'autres globules sanguins et que l'on obtient en une quantité et une qualité compatibles avec les exigences en pratique dans les banques du sang et dans des hôpitaux; - un système peu onéreux, totalement étanche, pouvant être jeté après usage, et qui consiste en trois poches interconnectées et extensibles en matière plastique, maintenues ensemble dans un support rigide monté dans un godet de centrifugeuse; - plus particulièrement, un système de trois poches consistant en une poche centrale, ayant de

préférence une forme conique, remplie de sang et jouant-

le rôle d'une chambre de séparation, une poche inférieure contenant de la solution saline physiologique normale destinée à déplacer le plasma riche en plaquettes de la poche centrale, et une poche supérieure destinée à recevoir le plasma riche en plaquettes (PRP) déplacé de la poche centrale; et - un système stérile et dont la manutention peut s'effectuer de manière aseptique pendant toutes les

étapes de traitement.

L'invention vise également à proposer un moyen permettant de retarder durant une minute environ, au début de la centrifugation, le démarrage de l'écoulement du fluide afin de permettre le départ, au sommet de la chambre, des globules rouges et blancs du sang, comme décrit ci-dessus. On y parvient à l'aide d'une bague torique élastique fixée autour du plongeur et d'une gorge ménagée sur la paroi interne du cylindre et qui retient

la bague torique en place jusqu'à ce que la force centri-

fuge atteigne une certaine valeur prescrite, ou bien en installant une valve chargée par un ressort et qui ne

s'ouvre qu'à une certaine force centrifuge prescrite.

L'invention concerne également, de façon générale, la séparation par centrifugation de particules solides finement divisées. Plus particulièrement, l'invention concerne un nouveau procédé et un appareil pour la séparation par centrifugation de particules solides qui diffèrent par leur taille et/ou leur densité, comme des plaquettes et autres globules du sang ou

divers types de particules et perles de synthèse.

L'art de séparer des particules solides finement divisées et différentes se fonde dans une large mesure

sur la sédimentation différentielle par centrifugation.

Les principaux problèmes liés à ce procédé sont un emprisonnement partiel des petites particules par des grosses et l'absence d'une nette indication de la fin de la séparation au cours d'une sédimentation. Cela oblige les utilisateurs à admettre une situation de compromis o, afin d'augmenter le rendement en particules séparées,

on doit admettre une moindre pureté, ou inversement.

En tenant compte de ce qui précède, la présente invention vise notamment à proposer un nouveau procédé et un appareil pour séparer des particules solides finement divisées, qui diffèrent par leur taille et/ou leur densité, tout en permettant d'obtenir à la fois le rendement maximal et la meilleure pureté des particules séparées. Pour y parvenir, le procédé et l'appareillage existants sous le nom de centrifugation à contre- courant (CC) ou d'élutriation ou séparation de décantation par centrifugation (EC) ont été sensiblement modifiés pour

les adapter tous deux à cette nouvelle utilisation.

Dans le procédé et l'appareillage de EC, mis au point par Beckman Company, la séparation des particules est réalisée dans une chambre de séparation au sein du rotor du séparateur ("Elutriator"). La tendance des particules à sédimenter dans un champ de centrifugation est contre-balancée dans la chambre par un écoulement

de liquide s'effectuant dans le sens opposé. En augmen-

tant le débit d'écoulement du liquide, on entraîne par lavage de plus petites particules cependant que des particules plus grosses ou plus denses restent dans la chambre. Pour réaliser la séparation des particules, on fait passer dans la chambre de séparation un grand volume de liquide se déplaçant à un débit relativement élevé. Le pompage du liquide pour l'introduire dans le rotor et lui faire traverser la chambre de séparation est réalisé à l'aide d'un joint rotatif. L'appareillage de Beckman et le mode opératoire correspondant sont utilisés avec succès pour séparer des globules du sang comme les granulocytes, les monocytes et de jeunes globules rouges, mais cet appareillage et ce mode opératoire ne conviennent pas pour la séparation des plaquettes. L'invention vise également à proposer un nouveau modèle de chambre de séparation permettant de

séparer efficacement des particules largement dissem-

blables, comme des plaquettes et autres globules du sang, ainsi qu'un nouveau mode opératoire pour la réalisation d'une telle séparation. Une étude expérimentale de chambres présentantdes configurations différentes a permis d'établir qu'une chambre de forme conique et de plus gros volume que la chambre de Beckman, qui a 10,5 ml au lieu de 4,5 ml, s'avère convenir le mieux pour la séparation des plaquettes. Cela est dû au fait que la chambre conique, présentant un angle au sommet d'environ 400, assure un gradient prononcé et efficace de vitesse du fluide, dirigée à l'opposé du gradient de la force centrifuge, ce qui permet de maintenir dans la chambre> en équilibre constantles globules du sang sous forme d'une dense suspension de globules ayant une nette limite supérieure et qui présente les caractéristiques physiques d'un lit de particules fluidisées. Ce lit fluidisé de globules sanguins joue le rôle d'un filtre profond laissant librement passer les plaquettes tout en retenant dans la chambre tous les autres globules du sang. Une différence importante entrec-m et celui de 3,5 ml 8 ml pour d'autres 2481614 iation lettes, car il provoque fréquemment une agglomération issement des globules sanguins, donnant une hémolyse ing s'accompagnant d'une libération de ADP. Ce dernier )sé provoque apparemment une aggrégation des plaquettes

X- De dl On pn -éri-rn1iSart au Dréa-

2481614i centrifuge (EC) de Beckman, il faut des débits de 15 à ml par minute et des volumes de milieu de 700 à 1000 ml. De même, une séparation des plaquettes par ce procédé demande environ 2 minutes pour s'achever, alors que la séparation des autres globules du sang demande de 40 à 60 minutes. Il en résulte que le procédé de séparation de la présente invention peut se caractériser

comme étant un procédé de déplacement combiné à la fil-

tration, dans lequel un faible volume de solution saline déplace rapidement PRP du sang entier. Au contraire, une séparation des globules par le procédé de EC implique un gradient des vitesses et une sédimentation par lavage avec de grands volumes de milieu. La preuve expérimentale de l'existence de l'action de filtration dans un tel lit fluidisé de globules sanguins contenus dans la chambre de séparation est donnée par des essais effectués sans succès en vue d'enlever des globules blancs et des globules rouges contaminant les préparations de PRP collectées à l'aide de l'appareil "Haemonetics-30" de traitement du sang. Apparemment, la présence d'un nombre bien plus réduit de globules du sang dans cette préparation de PRP, en comparaison du nombre existant dans du sang entier, n'a pas permis au lit fluidisé de globules sanguins d'atteindre une phase d'auto-stabilisation et une action de filtration, ce qui a provoqué le déplacement d'un grand nombre de globules rouges et de globules blancs avec

le plasma riche en plaquettes (PRP).

Plus particulièrement, l'invention vise à proposer un nouveau procédé pour une séparation efficace du PRP et du sang entier, en préchargeant de sang la chambre de séparation à l'extérieur du rotor plutôt qu'en chargeant la chambre au cours de la centrifugation comme dans le mode opératoire de Beckman. Le mode opératoire de Beckman, consistant à charger ou introduire du sang, s'est avéré totalement inadéquat pour la séparation des plaquettes, car il provoque fréquemment une agglomération de tassement des globules sanguins, donnant une hémolyse du sang s'accompagnant d'une libération de ADP. Ce dernier composé provoque apparemment une aggrégation des plaquettes qui en empêche la séparation. En introduisant au préalable du sang dans la chambre, on élimine complètement

ce problème.

Le nouveau mode opératoire de l'invention vise également à permettre le départ initial, au sommet de la chambre, des globules sanguins par centrifugation durant une minute sans faire débuter la circulation à contre-courant de la solution saline. Cela évite une élution immédiate des globules sanguins du sommet de la chambre, ce qui pourrait, sinon, contaminer le circuit

de sortie et empêcher la collecte de PRP pur.

L'invention vise également à proposer un

système ou appareil complet pour la séparation de par-

ticules solides dissemblables, sans que l'on doive pour cela utiliser le rotor du séparateur "Elutriator" de Beckman. On y parvient en remplaçant le dispositif de pompage externe de Beckman par un dispositif interne comportant une pompe à piston incorporée au module contenant-la chambre. Ce module sert d'élément à insérer

dans une centrifugeuse comportant des godets oscillants.

Dans le module, la pompe fonctionne sous l'effet de la force centrifuge et assure dans la chambre de séparation l'écoulement nécessaire du fluide dans un sens opposé à celui de la force centrifuge. Le débit d'écoulement

est commandé par une soupape à pointeau.

Des exemples nullement limitatifs de l'inven-

tion et de sa mise en oeuvre seront maintenant décrits plus en détail en regard des dessins annexés sur lesquels la figure l est une section verticale, le long de l'axe central vertical, de la version à plus grande échelle de l'appareil et elle montre le dispositif consistant en trois poches extensibles insérées dans le godet de la centrifugeuse; la figure 2 est une section verticale de l'appareil le long de son axe central et elle montre le dispositif démonté et avec des poches vides; la figure 3 est une section verticale de l'appareil le long de son axe central vertical et elle montre l'appareil sous forme partiellement assemblée et comportant deux poches emplies; la figure 4 est une section verticale de l'appareil le long de son axe central vertical et elle

montre l'appareil inséré dans le godet de la centri-

fugeuse et fixé à la position supérieure de ce godet la figure 5 est une section verticale de l'appareil le long de son axe central vertical et elle montre l'appareil en position inférieure dans le godet de la centrifugeuse; la figure 6 est une section verticale, le

long de son axe central vertical, du godet de la centri-

fugeuse contenant une poche insérée et cette figure montre la séparation du plasma pauvre en plaquettes (PPP) et du concentré de plaquettes (CP) dans la poche; la figure 7 est une section verticale, le long de l'axe central-vertical, de la poche conique et de sa poche satellite et elle montre les deux poches en position inversée avec connexion de la tubulure de réinfusion du sang au donneur D; la figure 8 est une section centrale verticale fragmentaire agrandie de l'orifice capillaire d'admission et d'un obturateur sphérique au fond de la poche conique; la figure 9 est une section verticale, le long de l'axe central vertical, d'une autre version à plus grande échelle de l'appareil de séparation des plaquettes et elle montre des organes destinés à réguler

le débit et à déconnecter une poche extensible et démon-

table;

la figure 10 est une coupe schématique frag-

mentaire, le long de la ligne X-X de la figure 9, d'un module rapporté comportant une soupape à pointeau pour la régulation du débit et un raccord; la figure Il est une coupe fragmentaire d'un module rapporté comportant une soupape à pointeau pour la régulation du débit et la soupape chargée par ressort et activée par la force centrifuge la figure lia est une vue en élévation du module rapporté de la figure il; la figure 12 est une vue de dessus de la chambre de séparation présentée sur la figure 13; la figure 13 est une section verticale, le long de la ligne XIII-XIII, de la chambre de séparation de la figure l; la figure 14 est une section verticale, le long de l'axe central vertical, de l'appareil montrant le plongeur en position supérieure; et la figure 15 est une section verticale, le long de l'axe central vertical, de l'appareil montrant le

plongeur en position basse.

L'appareil représenté sur les figures 1 à 8 est une version spécialement agrandie pour utilisation clinique. Elle comporte un dispositif, conçu pour être

jeté après usage et qui consiste en trois poches exten-

sibles, complètement fermées et permettant de maintenir

la stérilité pendant toutes les étapes de leur utilisation.

Ainsi, le dispositif est destiné à répondre aux exigences réglementant la sécurité pour utilisation pour les êtres humains, notamment les exigences de l'administration

américaine réglementant les aliments et les médicaments.

Ce dispositif consiste en une poche conique 1 jouant le rôle de chambre deséparation maintenue dans un support rigide 2 divisé en deux moitiés (figure 2) et comportant une cavité conique. Sous la poche conique l est fixée une poche satellite 3 emplie du milieu d'élution, comme une solution saline physiologique normale. La poche satellite 3 est reliée à la pbche conique l par un court tube capillaire 4 (figures l et 8) recouvert d'une petite bille 5 jouant le rôle d'obturateur sphérique. Un dispo- sitif de bouchage 6, permettant l'infusion stérile du milieu dans la poche 3, est placé d'un côté de la poche satellite 3. Le support rigide 2 maintient également une

poche collectrice 7 placée au-dessus de la poche conique 1.

Les poches conique 1 et collectrice 7 comportent toutes deux des raccords du type perforateur, 8 et 9, permettant la liaison et la déconnexion aseptiques de ces poches à l'aide d'une aiguille stérile 10 de raccord ouverte à ses deux extrémités. Afin de maintenir en place le raccord perforateur 8, le support rigide 2 comporte une bride annulaire de serrage 15 de sorte que, lorsque les deux moitiés sont assemblées, le racçord 8 est maintenu fixé pendant les étapes de fonctionnement subséquent. Les deux moitiés du support rigide 2 sont maintenues ensemble par une bague torique il jouant également le rôle de bague élastique s'enclenchant dans la gorge 12 de la paroi interne du godet 13 de la centrifugeuse et maintenant le support rigide 2 dans sa position supérieure au sein de ce godet 13. La configuration échancrée 14 représentée à l'extrémité inférieure du support rigide 2 est destinée à éviter le pincement de la poche 3 lorsque le support 2

coulisse vers le bas et comprime la poche 3.

Les étapes de fonctionnement servant à la séparation des plaquettes à l'aide de cet appareil et de

ce dispositif sont illustrées schématiquement sur les-

figures 2 à 8. La figure 2 montre une section verticale du dispositif sous forme démontée. Les trois poches 3,1 et 7 sont toutes représentées vides et affaissées,

cependant que la poche collectrice supérieure 7 est décon-

nectée. La figure 3 montre l'amorçage de la poche conique 1, destinée à recevoir du sang provenant du donneur D, à l'aide d'une solution saline et d'un plasma pauvre en plaquettes (PPP). On voit la poche conique 1 insérée dans une moitié du support rigide 2. La figure 4 montre un dispositif assemblé et positionné à l'intérieur du godet 13 de la centrifugeuse. La bague torique 11, qui maintient ensemble les deux moitiés du support 2, maintient également le support assemblé dans la position supérieure

du godet de la centrifugeuse, la bague torique Il s'en-

clenchant dans la gorge 12 du godet 13. Cette fixation permet de soumettre le dispositif à une centrifugation à faible vitesse, par exemple à 500 tours par minute, durant une minute environ afin de débarrasser le sommet

de la chambre des globules du sang. La vitesse de centri-

fugation est ensuite augmentée et portée à 2000 tours par minute environ. A cette vitesse, la bague torique Il sort de la gorge 12 et le support 2 commence à coulisser vers le bas et vers la poche satellite 3, ce qui refoule la solution saline (et du plasma pauvre en plaquettes, PPP) par le tube capillaire 4 dans la poche conique 1. Cette action déplace du plasma riche en plaquettes (PRP) de l'échantillon du sang dans la poche collectrice supérieure 7, comme illustré sur la figure 5. La poche collectrice 7 est ensuite déconnectée, placée dans un godet plus petit d'une autre centrifugeuse (figure 6) et centrifugée à grande vitesse afin d'obtenir un culot de centrifugation qui est du concentré de plaquettes (CP) et du plasma pauvre en plaquettes (PPP) surnageant. Le PPP est ensuite mélangé au sang restant dans la poche conique 1 (figure 7), et le sang contenant à la fois de la solution saline physiologique et du PPP est réinfusé au donneur D. La figure 8 montre à plus grande échelle une section du raccord capillaire 4 et de l'obturateur sphérique 5

montés entre la poche satellite 3 et la poche conique 1.

L'appareil représenté sur les figures 9 et 10 est une version à plus grande échelle de l'appareil -14 représenté sur la figure 1, mais ce système ne comporte qu'une poche extensible et démontable 3 contenant de la solution saline, cependant qu'une chambre conique de séparation 17 est logée à l'intérieur du corps cylindrique 18, qui peut se déplacer sous l'effet de la force cerntri- fuge à l'intérieur du godet 13 de la centrifugeuse et

exercer une pression sur la poche extensible et compres-

sible 3. Une bague torique 20 assure l'étanchéité de la liaison d'une chambre 19 de réception du plasma riche en plaquettes (PRP) avec le corps cylindrique 18 au-dessus de la chambre 17 de séparation. Le dispositif comporte également une soupape à pointeau 21 (voir également la figure 10) pour la régulation du débit, disposée à l'intérieur d'un module rapporté 22 comportant un raccord

pour assurer la liaison avec la poche compressible 3.

Les figures 11 et lla montrent un module rapporté constituant une version possible d'un dispositif destiné à retarder l'écoulement du liquide pendant le démarrage de la centrifugation jusqu'à ce que la force

centrifuge maximale fasse fonctionner une soupape 23.

Le module comporte également une soupape à pointeau 21

destinée à commander et réguler le débit.

Le dispositif représenté sur les figures 12 et 13 montre la chambre 102 de séparation réalisée en vue de son utilisation dans le rotor du séparateur "Beckman JE-6 Elutriator" et dans la centrifugeuse de préparation Beckman J-21. Le corps principal de la chambre 102 comporte une cavité conique 103 et un couvercle 104 dont une bague torique 105 assure l'étanchéité. Le couvercle comporte deux orifices, l'un central 106 est l'orifice d'admission, cependant que l'orifice excentrique 107 est l'orifice de sortie. Les deux orifices sont fermés de manière étanche par des bagues toriques 108 et 109. Un tube 110 est inséré dans l'orifice central 106 et débouche très près du fond de la chambre 103. Le couvercle 104 comporte une entaille

^ -

111 servant à placer en position appropriée la chambre

102 dans le rotor du séparateur "Beckman Elutriator"'.

Les figures 12 et 13 montrent un modèle optimal

de chambre pour séparer les plaquettes du sang entier.

On est parvenu à la conception de ce modèle de chambre après des essais expérimentaux poussés de nombreuses chambres ayant des formes géométriques différentes, notamment plusieurs chambres coniques d'un angle au sommet différent, des chambres paraboliques dont l'extrémité large était ou non évasée, ainsi que la chambre du séparateur Beckman. Cette dernière s'est avérée complètement inefficace pour la séparation des plaquettes. Le mode opératoire développé par la Beckman

Company pour la séparation par centrifugation de différen-

tes cellules, particules et globules s'est également avéré

ne pas convenir au but ici vis Voici un nouveau mode opératoire pour séparer les plaquettes, ou plus

spécifiquement du plasma riche en plaquettes (PRP), du sang entier. Une nouvelle chambre de séparation (figures 12 et 13) est insérée dans le rotor du séparateur "Elutriator" et l'appareil Beckman est amorcé par introduction d'une solution saline et il est purgé d'air. Le rotor est ensuite mis sur le côté, sans déconnecter son joint rotatif du circuit externe de circulation, et la chambre est soigneusement retirée sans laisser de l'air entrer dans le circuit de circulation externe. La chambre est ensuite vidée de la solution saline

et remplie de sang humain entier additionné d'un anti-

coagulant. Les orifices d'entrée et de sortie sont recou-

verts d'une bande de matière plastique en feuille qui a été au préalable enduite de graisse de silicone. La chambre est ensuite insérée dans le rotor du séparateur "'Elutriator" et la bande de matière plastique arrachée. En recouvrant

les orifices de la chambre par la bande de matière plas-

tique, on évite à la fois des éclaboussures de sang, qui constitueraient un gaspillage, et l'entrée de l'air dans le circuit. On règle la vitesse de la centrifugeuse à 2500 tours par minute et, une minute après le début de la centrifugation, on commence la séparation par élutriation à un faible débit du sang de 3,5 ml par minute. Il est nécessaire de maintenir le débit d'élutriation durant une minute pour libérer le sommet de la chambre de séparation par une sédimentation partielle des globules rouges et des

globules blancs afin d'éviter que ces globules ne conta-

minent le plasma riche en plaquettes. Après 2 minutes de

centrifugation, on commence à collecter les plaquettes.

Les deux premiers millilitres ne contiennent que du plasma pauvre en plaquettes, cependant que les 6 à 8 ml de plasma riche en plaquettes (PRP) provenant de la suite de l'élution contiennent environ 90 % des plaquettes totales

du sang.

Les plaquettes collectées par ce mode opératoire ne contiennent pas de globules blancs et ils ne comportent qu'un très faible nombre de globules rouges. Du point de vue fonctionnel, les plaquettes semblent normales si l'on se fonde sur leur morphologie, leur aptitude à s'agréger, à absorber de la sérotonine et sur leur temps de survie dans la circulation du sang des animaux. Leur aptitude à secréter de 1'ATP (adénosine-triphosphate) pendant l'agrégation est supérieure en moyenne de 32 % à celle de plaquettes-témoins obtenues par centrifugation à faible vitesse, ce qui suggère qu'elles sont même plus intactes, du point de vue

fonctionnel, que les plaquettes-témoins.

L'appareil représenté sur les figures 14 et 15 est un dispositif complet de séparation des plaquettes, fonctionnant indépendamment du séparateur Beckman par élutriation et pouvant être inséré dans n'importe quelle

centrifugeuse comportant des godets oscillants. Le disposi-

tif de l'appareil comporte une pompe consistant en un piston 112 et un cylindre 113 et fonctionnant sous l'effet

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de la force centrifuge. Une chambre conique 114, comportant

un orifice d'admission 115 ménagé dans sa partie infé-

rieure et un orifice de sortie 116 à sa partie supérieure est ménagée à l'intérieur du piston 112. Une bague torique 117 entoure le piston 112 et assure l'étanchéité nécessaire de la liaison de ce piston avec le cylindre 113. Une gorge annulaire 118, ménagée sur la paroi interne du cylindre 113, sert à retenir la bague torique 117 et à maintenir le piston plongeur 112 en position supérieure (figure 14) pendant la première minute de la centrifugation initiale à environ 500 tours par minute. Cela assure à l'action de

pompage le retard nécessaire pour permettre une sédimenta-

tion partielle du sang afin d'éviter que le sang ne contamine

une chambre collectrice supérieure 119.

Le mode opératoire pour séparer les plaquettes à l'aide du dispositif de l'appareil représenté sur les figures 14 et 15 commence en introduisant dans la partie inférieure du cylindre 113, par un orifice d'admission , un volume de liquide de déplacement représentant de 0,2 à 2 fois le volume du plasma présent dans le sang à traiter. Ainsi, on introduit par exemple par l'orifice 120, ml d'une solution saline physiologique tamponnée, puis on ferme une valve ou soupape 121. On introduit ensuite 21 ml de sang entier, additionné d'un anti-coagulant circulant, dans la chambre conique 114. Puis l'on place le dispositif dans le godet oscillant de la centrifugeuse et l'on fait tourner à environ 500 tours par minute durant une minute pour éliminer les globules sanguins de la partie supérieure de la chambre. On porte ensuite la vitesse de la centrifugeuse à environ 2000 tours par minute. La force centrifuge supérieure ainsi exercée fait sortir la bague torique 17 de la gorge 118, et le plongeur 112 commence alors à descendre en amorçant son action de pompage. Une soupape à pointeau 122 permet un ajustement préalable du débit à une valeur inférieure à environ

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1,0 ml de solution saline par minute et par ml de sang traité. Ainsi, la soupape à pointeau 122 règle le débit de la solution saline à environ 0, 35 ml par minute par ml de sang traiter et règle notamment ce débit à environ 5 ml par minute de sorte qu'en 3 minutes environ la totalité de la solution saline, correspondant au volume du plasma de l'échantillon de sang à traiter, est refoulée du cylindre 113 dans la chambre de séparation 114 (figure ) et déplace ainsi la totalité du plasma riche en plaquettes (PRP) du sang, ce PRP passant dans la chambre collectrice supérieure 119. Pour permettre le nettoyage cette chambre collectrice 119 est démontable. Le remontage s'effectue en vissant la chambre 119 à l'extrémité du piston plongeur 112, une bague torique 123 assurant

l'étanchéité de la liaison avec la chambre conique 114.

Les plaquettes collectées à l'aide du dispositif de l'appareil représenté sur les figures 14 et 15 sont même plus pures que celles obtenues à l'aide d'un mode opératoire antérieur impliquant l'utilisation du rotor du séparateur "'Elutriator" et de la chambre représentée sur les figures 12 et 13. Ainsi, l'examen par analyse au microscope de plus de 106 plaquettes ou thrombocytes n'a pas permis de trouver un seul globule blanc ou rouge. Ce dispositif permet également de récolter près de 90 % des plaquettes totales du sang. Les plaquettes isolées à l'aide de cet appareillage sont juste aussi fonctionnelles que celles isolées à l'aide du dispositif décrit à propos

des figures 12 et 13.

Il va de soi que, sans sortir du cadre de l'invention, de nombreuses modifications peuvent être apportées à l'appareil, au dispositif à triple poche et au procédé pour séparer par centrifugation des plaquettes,

ou un plasma riche en plaquettes, du sang.

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Claims (15)

REVENDICATIONS

1. Appareil pour séparer des particules solides, comme des plaquettes, d'un échantillon liquide comme du sang, appareil caractérisé en ce qu'il comprend, en combinaison, au moins: (a) un corps (13, 113) destiné à être soumis à l'action de la force centrifuge et qui contient une cavité destinée à recevoir un certain volume de liquide de déplacement; (b) un piston (2, 18, 112), monté dans le corps (13, 113) de façon à se déplacer sous l'effet de la force centrifuge pour pénétrer plus avant dans la cavité de ce corps, ce piston contenant une chambre (17, 114) présentant des extrémités interne (115) et externe (116) et contenant l'échantillon dont les particules sont à séparer, ainsi qu'un conduit d'injection permettant le mouvement d'un liquide de déplacement partant de la cavité pour parvenir à l'extrémité de sortie (116),dans le sens de l'action de

la force centrifuge, de la chambre sous l'effet du mouve-

ment de pénétration du piston dans la cavité du corps (13, 113); (c) un conduit de sortie (10, 116) à l'extrémité, interne,dans le sens d'action de la force centrifuge, de la chambre pour la sortie du liquide riche en particules et qui est refoulé par suite de l'injection du liquide de déplacement dans la chambre; et (d) des organes permettant d'éviter que le liquide de déplacement ne s'écoule de la cavité vers la chambre

avant la stratification, sous l'effet de la force centri-

fuge, les globules sanguins dans cette chambre.

2. Appareil selon la revendication 1, caracté-

risé en ce qu'il comporte également des organes de régulation destinés à éviter un mouvement de pénétration du piston (2, 18, 112) dans la cavité du corps (13, 113) tant qu'une force centrifuge minimale n'est pas appliquée

à ce piston.

3. Appareil selon la revendication 2, carac-

térisé en ce que les organes de régulation comprennent une bague torique (11, 117) montée sur le piston (2, 18, 112) et qui s'enclenche dans une gorge (12, 118) de la paroi de la cavité.

4. Appareil selon la revendication 2, caracté-

risé en ce que les organes de régulation comprennent au moins une valve ou soupape (4, 5; 21, 22; 23; 122), montée dans le conduit d'injection et actionnée par la

force centrifuge.

5. Appareil selon la revendication 1, caracté-

risé en ce que la valve ou soupape est montée dans le

conduit d'injection pour y commander le débit d'écoulement.

6. Appareil selon la revendication 1, carac-

térisé en ce qu'un échantillon de sang est introduit dans la chambre et un volume de solution saline tamponnée est

introduit dans la cavité.

7. Appareil selon la revendication 6, carac-

térisé en ce que le volume de la solution saline représente de 0,2 à 2 fois le volume du plasma de l'échantillon de sang.

8. Appareil selon la revendication 1, caracté-

risé en ce qu'il comporte également une poche (3) extensible et compressible placée dans la cavité, qui entoure la masse de liquide de déplacement, laquelle est notamment la solution saline, et qui communique avec le conduit d'injection.

9. Appareil selon la revendication 8, caractérisé

en ce qu'il comporte également une seconde poche (l) con-

tenant l'échantillon de sang dans la chambre et communiquant avec la poche compressible (3) disposée dans la cavité, ainsi qu'une troisième poche (7), communiquant par un conduit de sortie (10) avec la seconde poche (1), pour recevoir et collecter du plasma riche en plaquettes (PRP). ,

10. Dispositif en forme de triple poche, destiné à être placé dans un appareil selon la revendication 9 pour séparer d'un échantillon de sang le plasma riche en plaquettes (PRP), ce dispositif étant caractérisé en ce qu'il comporte: (a) une partie centrale (1), de forme générale conique, avec une extrémité externe, dans le sens d'action de la force centrifuge, au sommet du cône et une extrémité interne, dans le sens d'action de la force centrifuge, à l'extrémité opposée de cette partie centrale, laquelle est destinée à contenir l'échantillon de sang à traiter (b) une partie compressible (3), destinée à contenir un volume de solution saline d'injection

inférieur au volume de la partie centrale (1) et commu-

niquant avec l'extrémité externe, dans le sens d'action de la force centrifuge, de la partie centrale pour permettre l'injection de la solution saline dans la partie centrale à mesure de la compression de la partie (3); et (c) une partie collectrice dilatable (7), communiquant avec l'extrémité, interne dans le sens d'action de la force centrifuge, de la partie centrale (1) et destinée à collecter du plasma riche en plaquettes (PRP)

déplacé de cette partie centrale (1).

11. Procédé pour séparer des plaquettes d'un échantillon du sang, par la mise en oeuvre de l'appareil

selon l'une quelconque des revendications l à 9 et

éventuellement du dispositif à poche triple selon la revendication 10, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte les étapes consistant à (a) placer l'échantillon de sang à traiter dans une chambre de centrifugation, comportant des extrémités interne et externe dans le sens de l'action de la force centrifuge; (b) soumettre cette chambre à l'action d'une force centrifuge initiale,d'une valeur au moins égale à un minimum prédéterminé,afin de stratifier les globules rouges de l'échantillon loin de l'extrémité interne de la chambre; et (c) soumettre la chambre à l'action d'une

seconde force centrifuge, tout en injectant dans l'ex-

trémité externe de la chambre, à partir d'une cavité, un volume de liquide de déplacement compris entre 0,2 et 2 fois le volume du plasma de l'échantillon, à un débit inférieur à environ 1,0 ml par minute par ml de

l'échantillon de sang, et tout en déplaçant de l'extré-

mité interne de la chambre, sensiblement en même volume et sensiblement au même débit, du plasma riche en plaquettes, à l'aide du liquide de déplacement éjecté de la cavité sous l'effet de la seconde force centrifuge

agissant sur l'échantillon de sang.

12. Procédé selon la revendication 11, carac-

térisé en ce que la chambre de centrifugation présente une section de forme générale conique, le liquide de déplacement est une solution saline tamponnée, et la chambre est soumise pendant l'injection à l'action d'une force centrifuge supérieure à celle

s'exerçant pendant la stratification.

13. Procédé selon la revendication 11, carac-

térisé en ce que le liquide de déplacement est injecté en un volume approximativement égal au volume de plasma de l'échantillon et à un débit d'environ 0,35 ml par

minute par ml de l'échantillon de sang.

14. Procédé selon la revendication 11, caracté-

risé en ce que l'étape consistant à injecter le liquide de déplacement dans la chambre est réalisée par l'introduction du liquide de déplacement dans une cavité servant de support et par propulsion et pénétration, sous l'effet de la force centrifuge, de la chambre contenant l'échantillon

de sang dans la cavité.

15. Procédé selon la revendication 11, carac-

térisé en ce qu'on assure la présence, dans la chambre, d'un nombre de globules sanguins suffisant pour former une suspension dense de globules jouant le rôle d'un lit fluidisé de particules fonctionnant comme un filtre profond laissant librement passer les plaquettes tout en maintenant dans la chambre, en un équilibre constant,

d'autres globules du sang.