DE3016391C2

DE3016391C2 - Enzym-Immunoassay und Vorrichtung zum Durchführung desselben

Info

Publication number: DE3016391C2
Application number: DE19803016391
Authority: DE
Inventors: Carl Herman Thomas Dr.med. Helsinki Adlercreuz; Matti Heikki Aleksi Dr.med. Espoo Härkönen
Original assignee: ORION-YHTYMAE 00101 HELSINKI FI Oy
Current assignee: ORION-YHTYMAE 00101 HELSINKI FI Oy
Priority date: 1979-04-30
Filing date: 1980-04-29
Publication date: 1983-04-07
Also published as: SE8003206L; GB2049185B; DE3016391A1; FI58839C; FI58839B; FR2455742A1; GB2049185A

Description

nicht proteingebundene Hormone in biologischem Material zu messen.

Die aus zwei Röhrchen bestehende erfindungsgemä-3e Vorrichtung dient nicht nur als mikrochemischer Behälter für unterschiedliche Inkubationsvolumina, sondern auch als fluorometrische Küvette. Die beiden Röhrchen gestatten das Messen von Gemischen bei unterschiedlichen Empfindlichkeitspegeln. Die konische Form des Reagenzröhrchen macht es möglich, das Inkubationsvolumen zwischen 0,1 und 1,0 ml zu wählen. Das zweite Röhrchen ist eine fluorometrische Küvette. Alle Verfahrensschritte des erfindungsgemäßen Enzym-Immunoassays können in diesen beiden Röhrchen durchgeführt werden.

Das Reagenzröhrchen kann aus Nylon hergestellt werden, welches in bekannter Weise behandelt worden ist. um an ihm ein Antigen oder einen Antikörper anbringen zu können (W. E. Hornby und L Goldstein in »Methods in Enzymology« XLIV, K. Mosbach, Ets, Academic Press, New York, 1976, 118). Bei dieser Behandlung wird das Reagenzröhrchen in Methanol getaucht, das 18,8% CaCI₂ und 18,6% H₂O enthält und auf einer Temperatur von 50 bis 6O⁰C (321 bis 331 K) durch Mischen mit einem magnetischem Rührwerk gehalten wird. Durch diese Behandlung wird amorphes Nylon gelöst und die zu benetzende Oberfläche vergrößert und ihre Benetzbarkeit verbessert. Das gelöste Nylon wird durch Eintauchen in Wasser für mehrere Stunden weggewaschen. Danach wird das Reagenzröhrchen bei 50 bis 6O⁰C in 3,7 M HCI eingetaucht, wobei ein magnetischer Rührer verwendet wird. Nach der Behandlung wird das Reagenzröhrchen gewaschen, bis der pH-Wert neutral ist.

Das vorhandene Reagenzröhrchen wird durch Eintauchen in 5% Glutaraldehyd in einer 0,5 M Phosphat- x Pufferlösung, pH-Wert 5,0, für eine Stunde bei Raumtemperatur aktiviert. Danach wird das Reagenzröhrchen einige Male in einer Acetat-Pufferlösung, pH-Wert 5,0, und einer Phosphat-Pufferlösung, pH-Wert 7,0, gewaschen. Das so aktivierte Reagenz- *o röhrchen wird in mit Phosphat-Pufferlösung verdünntes Antiserum eingetaucht und darin drei Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Nach dieser Inkubation wird das Reagenzröhrchen mit einer 0,9% NaCI-Lösung, die ein Netzmittel, 0,05% TWEEN-20, enthält, gewaschen « und danach nochmals mit einer 0,133 M Borat-Pufferlösung, pH-Wert 8,0, gewaschen. Das Reagenzröhrchen kann dann in kaltem Äther eingetaucht in einer Borat-Pufferlösung, welche 0,02% Bovinserum Albumin (BSA) enthält, gelagert oder nach der Behandlung mit BSA-Borat-Pufferlösung geleert und gefriergetrocknet werden.

Die Reagenzröhrchen können in großen Mengen behandelt werden, wodurch eine quantitativ gleichförmige Beschichtung für jedes Röhrchen gerantie't wird. Durch die vorstehend genannte Behandlung wird sowohl die Innenfläche als auch die Außenfläche der Reagenzröhrchen behandelt. Die Immunoreaktion findet jedoch nur an der Innenfläche des Reagenzröhrchens statt, die bei der späteren Handhabung nicht angekratzt oder sonstwie beschädigt wird.

In der Zeichnung ist ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung für die Durchführung des Enzym-Immunoassays darstellt, und zwar zeigt

Fig. 1 einen senkrechten Schnitt durch ein Reagenz- ^b5 röhrchen und

Fig. 2 einen ähnlichen Schnitt wie in Fig. 1, wobei jedoch auf das Reagenzröhrchen ein zweites Röhrchen aufgesteckt ist.

Das in Fig. 1 und 2 dargestellte Keagenzröhrchen 1 hat einen zylindrischen oberen Abschnitt 2 und einen konischen unteren Abschnitt 3. Wegen dieser konischen Form ist es möglich, kleine Inkubationsvolumina zu verwenden, die beispielsweise 10 μΙ und mehr betragen. Der zylindrische obere Abschnitt 2 des Reagenzröhrchens 1 hat auf seiner Außenseite eine ringförmige Schulter 4 und zwei ringförmige, jedoch dünnere Vorsprünge 5, die elastisch sind und somit als Dichtungsringe wirken. Die Anzahl der Dichtungsringe kann unterschiedlich sein. Das Reagenzröhrchen muß aber wenigstens einen Dichtungsring 5 aufweisen. Die Schulter 4 ist hingegen nicht absolut notwendig und kann, falls erwünscht, auch weggelassen werden.

Aus F i g. 2 ist zu ersehen, daß das Reagenzröhrchen 1 an eine fluorometrische Cüvette 6 angeschlossen werden kann, indem es in diese Cüvette 6 eingesteckt wird. Die Einstecktiefe wird durch die Schulter 4 begrenzt, welche am äußeren Rand der öffnung der Cüvette 6 anliegt. Der Außendurchmesser des oberen Abschnittes 2 des Reagenzröhrchens 1 ist etwas geringer als der Innendurchmesser der Cüvette 6, jedoch ist der Außendurchmesser der Dichtungsringe 5 größer als der Innendurchmesser der Cüvette 6, so daß das Röhrchen 1 und die ebenfalls als Röhrchen ausgebildete Cüvette 6 dicht miteinander verbunden werden können.

Für die Durchführung des Enzym-Immunoassays werden das Enzym-Antigen oder der Enzym-Antikörper komplex und eine Standardlösung oder eine zu untersuchende Probe mit einer Pipette in das Reagenzröhrchen 1 eingegeben, beispielsweise in einem Geamtvolumen von 100 μΐ. Das Reagenzrörchen wird dann geschlossen und eine Immunoreaktion während einer Zeit von beispielsweise vierzehn Stunden bei 4°C (275 K) durchgeführt. Danach wird die Flüssigkeit durch Absaugen entfernt und das Reagenzröhrchen gewaschen, beispielsweise mit einer 0,1 M TRlS-HCl-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0. Nun wird 1 ml einer Substratlösung für das Markierenzym mit einer Pipette in die fluorometrische Cüvette 6 eingefüllt und dann das Reagenzröhrchen 1 in die Cüvette 6 gesteckt. Die zusammengesteckten Röhrchen werden umgedreht und die enzymalische Reaktion wird durch Drehen oder Schütteln der Röhrchen bei Raumtemperatur oder bei 37°C (308 K) für 10 bis 60 Minuten durchgeführt. Danach wird die enzymatische Reaktion gestoppt, indem man die Rörchen so umdreht, daß die Flüssigkeit in die Cüvette 6 fließt. Das Reagenzröhrchen 1 wird abgenommen und die Cüvette 6 in ein Fluorometer gesetzt, um die Fluoreszenz zu messen.

Wenn der Enzym-Immunoassay im Mikromaßstab durchgeführt wird, werden die zu untersuchende Probe oder die Standardlösung und das Enzym-Antigen oder der Enzym-Antikörperkomplex mittels einer Pipette in das Reagenzröhrchen eingegeben, beispielsweise in einem Gesamtvolumen von JO μΙ. Das Reagenzröhrchen wird dann geschlossen und die Reaktion in der oben beschriebenen Weise ablaufen gelassen. Danach wird die Flüssigkeit durch Absaugen entfernt und das Reagenzröhrchen gewaschen, wie oben beschrieben. Dann wird 15 μΐ einer Substratlösung für das Markierenzym in das Reagenzröhrchen mittels einer Pipette eingegeben und unter Schütteln während 10 bis 60 Minuten bei 37°C (308 K) einwirken gelassen. Dann werden mittels einer Pipette 2 μΐ von 0,1 mol/1 NaOH in das Reagenzröhrchen eingegeben und für zehn Minuten

bei 60⁰C (331 K) einwirken gelassen, um das Nikotin-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADP ⁺ ) zu zerstören. Danach werden 50 μΙ eines Pendelreagens in das Reagenzröhrchen eingegeben, um die Fluoreszens zu verbessern, und 60 Minuten lang bei 37°C (308 K) "> reagieren gelassen, woraufhin die fluorometrische Cuvette 6 fest auf das obere Ende des Reagenzröhrchens 1 aufgesteckt wird. Die zusammengekuppelten Röhrchen werden umgekehrt und das Ganze 2 Minuten lang gekocht, um die Enzyme zu zerstören und die in Pendelreaktion zu stoppen. Danach wird das Reagenzröhrchen f entfernt, 1 ml eines Indikatorreagens in die Cuvette 6 eingegeben und 20 Minuten bei Raumtemperatur einwirken gelassen. Schließlich wird die Cuvette in ein Fluorometer gesetzt und die Fluoroeszenz gemes- i-> sen.

Die Erfindung wird nachstehend noch anhand eines Beispiels erläutert.

Beispiel

Immunoassay von Testosteron in Plasma.

20 μΙ einer Testosteron-Standardlösung oder eines Testosteron-Probenextraktes wurden in ein Reagenzröhrchen (Fig. 1) eingegeben, das mit Testosteron-11-Succinyl-BSA-Antiserum beschichtet war und eine r> Lösung aus 0,133 mol/l von Borat-Pufferlösung, pH-Wert 8,0, 0,02% Gelatine enthält, und dann gleichzeitig oder nach einer gewissen Zeit die

Testosteron-S-Carboxymethyloxim-Glucose-e-Phosphate-Dehydrogenase (Markier-Testosteron) zugegeben. Die Röhrchen wurden über Nacht bei 4°C (275 K) liegen gelassen. Dann wurde die Flüssigkeit durch Absaugen entfernt, und die Röhrchen wurden drei Mal mit einer 0,1 M TRIS-HCl-Pufferlösung, pH-Wert 8,0, gewaschen. Mittels einer Pipette wurde 1 ml der Substratlösung für Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase ^;n die fluorometrische Cuvette eingegeben. Die Zusammensetzung dieser Lösung war 0,1 tnol/l TRIS-HCl-Pufferlösung, pH-Wert 8.0, 5 mmol/l MgCI₂, 0,01% BSA, 0,2 mmol/l NADP⁺ und 1 mmol/l Glucose-6-Phosphat. Das leere Reagenzröhrchen wurde fest auf die fluorometrische Cuvette gedrückt, woraufhin die zusammengekuppelten Röhrchen umgekehrt wurden und die enzymatische Reaktion unter Schütteln während 60 Minuten bei 37°C(308 K) stattfand. Die Reaktion verlief wenigstens 90 Minuten lang linear. Danach wurde die Enzymreaktion gestoppt, indem man die Röhrchen umdrehte, damit die Inkubationslösung in die Cuvette floß, woraufhin das Reagenzröhrchen abgenommen und die Fluoreszenz mit einem Fluorometer gemessen wurde. Mit diesem Verfahren ist es möglich, Testosteron-Konzentrationen im Bereich von 0,2 bis 50 mmol/l zu bestimmen, ohne eine Fluoreszenzverstärkung vornehmen zu müssen.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Enzymimmunoassay, bei dem eine zu untersuchende Probe oder eine Standardlösung zusammen mit einem Markierenzym in Form eines Enzym-Antigen- oder Enzym-Antikörperkomplexes in ein Reagenzröhrchen, von dem wenigstens die Innenfläche mit einem Antiserum oder einem Antigen beschichtet ist, eingegeben und die Lösung mit der Beschichtung reagieren gelassen wird, woran anschließend die Beschichtung und die an ihr hängenden Verbindungen mit einer Substratlösung für das Markierenzym reagieren gelassen werden und die durch die Reaktion gebildete Verbindung durch Fluorimetrie quantitativ gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß nach Beendigung der Reaktion der zu vntersuchenden Probe oder der Standardlösung mit der Beschichtung des Reagenzröhrchens die Lösung aus dem Reagenzröhrchen entfernt und das Reagenzröhrchen mit seiner öffnung nach unten dicht und fest an ein zweites Röhrchen, das die Subsiratlösung enthält, angeschlossen wird, daß die Substratlösung mit der Beschichtung des Reagenzröhrchens und den daran hängenden Verbindungen reagieren gelassen wird und daß nach Beendigung der Reaktion die miteinander verbundenen Röhrchen umgedreht werden, damit die Lösung in das zweite Röhrchen fließt, woraufhin das Reagenzröhrchen entfernt und die quantitative Untersuchung durch Fluorometric durchgeführt wird, wobei Hefe-Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase als Markierenzym verwendet und durch fluorimetrische Messung des gebildeten NADPH bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Röhrchen eine fluorometrische Cuvette ist und die quantitative Untersuchung in dieser durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenz durch enzytnatische Pendelung oder durch Zugabe von Natriumhydroxid verstärkt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Pendelung in dem Reagenzröhrchen durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Natriumhydroxid der Lösung in dem zweiten Röhrchen zugegeben wird.

6. Vorrichtung zum Durchführen des Enzym-Immunoassays nach einem der Ansprüche 1 bis 5, mit einem Reagenzröhrchen, von dem wenigstens die Innenfläche mit einem Antiserum oder Antigen beschichtet ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenzröhrchen (I) einen konischen unteren Abschnitt (3) hat, der in einer scharfen Spitze endet, und daß wenigstens ein ringförmiges, nachgiebiges Dichtungselement (5) auf der Außenseite des an ein zweites Röhrchen (6) anzuschließenden Endes des Reagenzröhrchens(i) vorgesehen ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenzröhrchen (1) eine ringförmige Schulter (4) am Außenumfang seines an das zweite Röhrchen (6) anzuschließenden Endes aufweist.

Die Erfindung betrifft ein Enzym-Immunoassay mit den Merkmalen des Oberbegriffs des Anspruchs 1. Außerdem betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum Durchführen dieses Verfahrens.

Bei einem bekannten Enzym-Immunoassay dieser Gattung (Clin. Chem, VoL 22, No. 8, 1976, S. 1243 — 1255) werden fluorogenische Substrate eingesetzt oder vom Markierungs-Enzym gebildete Glucose mit dem Hexokinase-Verfahren und mit Fluorometric ίο des NADPH (Ishikawa) gemessen, d.h. es sind zwei enzymatische Verfahrensschritte erforderlich. Dadurch gestaltet sich dieses bekannte Verfahren verhältnismäßig umständlich und zeitraubend.

Für Untersuchungen von Flüssigkeiten ist es bekannt, ein Reagenzröhrchen zu benutzen, bei dem wenigstens die Innenfläche mit einem Antiserum oder Antigen beschichtet ist. Ferner ist es bekannt (US-PS 36 84 455), zum Vermischen von Flüssigkeiten zwei zusammenschraubbare Röhrchen zu benutzen, die nach vollständigern Zusammenschrauben gegeneinander offen sind.

Für Radio-Immunoassays ist es schließlich bekannt, Reagenzröhrchen mit konischem Ende zu benutzen (DE-AS 22 41 646).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen empfindlicheren bzw. genauer arbeitenden und praktischer durchführbaren Enzym-Immunoassay zu schaffen, mit dem sehr leicht äußerst genaue Messungen sowohl im Mikro- als auch im Makromaßstab durchgeführt werden können.

J₀ Diese Aufgabe wird mit einem Enzym-Immunoassay der eingangs genannten Gattung gelöst, welcher nach den Merkmalen des kennzeichnenden Teiles des Anspruchs 1 arbeitet. Vorteilhafte Ausgestaltungen dieses Verfahrens sind Gegenstand der Ansprüche 2 bis 5. Außerdem wird diese Aufgabe mit einer Vorrichtung zum Durchführen des erfindungsgemäßen Enzym-Immunoassays gelöst, welche die Merkmale des Anspruches 6 aufweist. Eine vorteilhafte Ausgestaltung dieser Vorrichtung ist Gegenstand des Anspruches 7.
Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Enzym-Immunoassays ist nur ein einziger enzymatischer Verfahrensschritt vorgesehen. Daher läßt sich der Enzym-Immunoassay sehr einfach und trotzdem äußerst genau durchführen.

Bei dem erfindungsgemäßen Enzym-Immunoassay wird als Markierenzym Hefe-Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase verwendet. Der Endpunkt der Reaktion wird durch Fluoreszenz des Co-Enzyms Ges Markierenzyms gemessen. Dabei sind drei unterschiedliche Empfindlichkeitspegel für die Messung möglich, nämlich durch direkte Messung der Fluoreszenz des Co-Enzyms (Pyridinnucleotid), durch Messung nach zehnfacher Verstärkung der Fluoreszenz durch Zugabe eines starken Alkali und durch Messung nach 10 000 bis lOOOOOfacher Verstärkung der Fluoreszenz durch enzymatische Pendelung. Die Verstärkung der Fluoreszenz durch Zugabe einer starken Natrium-Hydroxid-Lösung ist bekannt (O. H. Lowry, N. R. Roberts und J. I. Kapphan in ). Biol. Chem. 224, 1047-1064, 1957), ebenso die Verstärkung der Fluoreszenz durch enzymatische Pendelung (O. H. Lowry, J. V. Passoneau, D. W. Schulz und M. K. Rock in J. Biol. Chem. 236, 2746-2755, 1961, und T. Kato, S. J. Berger, J. A. Carter und O. H. Lowry in Anal. Biochem. 53,86 -97,1973).
b5 Der erfindungsgemäße Enzym-Immunoassay ist das einzige nicht isotopische Verfahren, das nach Verstärkung der Fluoreszenz durch enzymatische Pendelung eine ausreichende Empfindlichkeit hat, um freie, d. h.