FI58839C - Saett att utfoera enzym-immunbestaemning och foer utfoerande av saettet avsett reagensroer - Google Patents

Description

R2Kr*l ΓβΊ m**UULUTUSjULKAISU COQTft flgSA lBJ (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 0 00 C /^jv Patentti myönnetty ΙΟ 04 1981 yTM Patent meddelat ^ (51) Kv.lk?/krt.CI.3 G 01 N 33/5^

SUOMI —FINLAND (21) Ptt*ottlh«k*mu« — PauMameknins T9139T

(22) HkktmispUvf — AnaOknlngsdag 30.0U.79 ^ ^ (23) Alkupllvi—Glttlghacadag 30. OU. 79 (41) T11H1K (nlklMicri —BUvk offwcllf 31.10.80 P^rtti- j. rekisterihallitut ,. k»«L,«.w»n pv«, -

Patent· och reglsterstyrelsen v ' Araekan utlafd ech utUkrtfcan publlcarad 31.12.80 (32)(33)(31) Pyydetty «tuotkau·—{Uglrd prloritat (71) Orion-yhtymä Oy, Nilsiänkatu 10-lU, 00510 Helsinki 51,

Carl Herman Thomas Adlercreuz, Käätypolku 5A, 00950 Helsinki 95,

Matti Heikki Aleksi Härkönen, Harjuviita lUc, 02100 Espoo 10,

Suomi-Finland(FI) (72) Carl Herman Thomas Adlercreuz, Helsinki, Matti Heikki Aleksi Härkönen, Espoo, Suomi-Finland(Fl) (7U) Berggren Oy Ab (5U) Tapa suorittaa entsyymi-immuunimäÄritys ja tavan suorittamiseksi tarkoitettu reagenssiputki - Sätt att utföra enzym-immunbestämning och för utförande av sättet avsett reagensrör Tämä keksintö kohdistuu tapaan suorittaa sen tyyppisiä entsyymi-immuunimäärityksiä, joissa reagenssiputkeen, jonka ainakin sisäpinta on päällystetty antiseerumilla tai antigeenillä, pannaan tutkittavan näytteen tai standardin liuos yhdessä merkkiaineena käytetyn entsyymi-antigeeni- tai entsyymi-vasta-ainekompleksin kanssa ja annetaan niiden reagoida päällysteenä olevan antiseerumin tai antigeenin kanssa, minkä jälkeen saatetaan päällyste ja siihen kiinnittyneet aineet reagoimaan entsyymin substraattiliuoksen kanssa, ja lopuksi mitataan reaktiossa syntynyt aine kvantitatiivisesti.

Tunnetaan aikaisemmin entsyymi-immuunimääritysmenetelmiä, jotka ovat kuvanneet Schuurs, A.H. ja van Weeman, B.K., Clinica Chimica Acta JM, 1-40, 1977. Tällaisia menetelmiä on edelleen kuvattu mm. suomalisissa patenteissa 52 154, 53 894, 54 033 ja 54 034.

Tämän keksinnön tarkoituksena on saada aikaan uusi, tunnettuja menetelmiä herkempi ja käytännöllisempi tapa suorittaa entsyymi-immuuni-määrityksiä, joka tapa mahdollistaa määritysten yksinkertaisen suorittamisen suurella tarkkuudella sekä mikromittakaavassa että makro- 58839 2 mittakaavassa.

Keksinnön mukainen tapa on tunnettu siitä, että kun tutkittava näyte tai standardi on reagoinut reagenssiputken päällysteen kanssa, poistetaan liuos ja reagenssiputki sovitetaan suu alaspäin tiiviisti toisen, substraattiliuosta sisältävän putken suulle, yhteen liitettyjä uutkia ravistelemalla tai pyörittämällä saatetaan subs uraattiliuos reagoimaan reagenssiputken päällysteen ja siihen kiinnittyneiden aineiden kanssa, reaktion päätyttyä käännetään yhteen liitetyt putket niin, että neste joutuu toiseen putkeen, minkä jälkeen reagenssiputki poistetaan ja kvantitatiivinen mittaus suoritetaan fluorometrisesti, jolloin merkkiaineena käytetään antigeeniin tai vasta-aineeseen kiinnitettyä hiivaglukoosi-6-fosfaatti-dehydrogenaasia tai muuta entsyymiä, joka käyttää pyridiininukleo-tidia koentsyyminä.

Toisena putkena käytetään edullisesti fluorometrin kyvettiput-kea.

Mittauksen herkistämiseksi fluoresenssiä voidaan vahvistaa sinänsä tunnetulla tavalla käyttämällä joko entsyymisyklausta (Lowry, O.H., Passoneau, J.V., Schulz, D.W. ja Rock, M.K., J.Biol.Chem. 236, 2746-2755, 1961, sekä Kato, T., Berger, S.J., Carter, J.A. ja Lowry, O.H., Anal. Biochem. 5_3, 86-97, 1973) tai lisäämällä sub-straattiliuokseen natriumhydroksidia (Lowry, O.H., Roberts, N.R. ja Kapphahn, J.I., J.Biol.Chem. 224, 1047-1064, 1957).

Keksintö tarkoittaa myös reagenssiputkea keksinnön mukaisen tavan suorittamiseksi, jonka putken ainakin sisäpinta on päällystetty antiseerumilla tai antigeenillä, ja keksinnön mukainen reagenssiputki on tunnettu siitä, että pienen tilavuuden omaavassa reagens-siputkessa on terävän kartiomainen kärkiosa ja että toiseen putkeen sisään työnnettävässä päässä on ainakin yksi ulkopuolinen rengasmainen, joustava tiiviste-elin. Keksinnön mukaisen reagenssiputken edullisen sovellutusmuodon mukaan toiseen putkeen liitettävässä päässä on ulkopuolinen olake, jota vasten toisen putken pää on tarkoitettu asetettavaksi putkia sisäkkäin työnnettäessä.

3 58839

Keksinnön mukaisen tavan suorittamiseksi tarkoitettu putki tehdään edullisesti nylonista, joka käsitellään antigeenin tai vasta-aineen tiimittiaiseksi sinänsä tunnetulla tavalla (Hornby, W.E. ja Goldstein, L., Methods in Enzymology XLIV, K. Mosbach, Academic Press, Mew York 1976, s. 118). Tämän käsittelyn mukaan putki upotetaan metanoliin, joka sisältää 18,8 % CaC^ ja 18,6 % 1^0, joka pidetään 50-60°C:n lämpötilassa ja sekoitetaan magneettisekoittajal-la. Tällä käsittelyllä saadaan amorfista nylonia liuotettua ja täten käytettävissä oleva pinta-ala suurenee ja sen kostumiskyky paranee. Liuonnut nylon pestään pois hautomalla vedessä useita tunteja.

Tämän jälkeen putki upotetaan 3,7 M suolahappoon 50-60°C:ssa käyttäen magneettista sekoittajaa. Käsittelyn jälkeen putki pestään kunnes pesuveden pH pysyy neutraalina.

Esikäsitelty putki aktivoidaan upottamalla se 5 % glutaarialdehydiin 0,5 M fosfaattipuskurissa, pH 5,0, tunnin ajaksi huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen putki pestään peräkkäin asetaattipuskurilla, pH 5,0, ja fosfaattipuskurilla, pH 7,0. Näin aktivoitu putki upotetaan fosfaattipuskurissa olevaan laimeaan antiseerumiin ja inkuboidaan huoneen lämpötilassa kolme tuntia. Inkuboinnin jälkeen putki pestään 0,9 % NaCl-liuoksella, joka sisältää kostutusainetta, 0,05 % TWEEN-20, ja vielä 0,133 M boraattipuskurilla, pH 8,0. Käsitelty putki säilytetään kylmässä, upotetaan boraattipuskuriin, joka sisältää 0,02 % naudan seerumialbumiinia (BSA), tai kun se on käsitelty BSA-boraattipuskurilla se tyhjennetään, kylmäkuivataan ja varastoidaan kylmässä.

Reagenssiputkia voidaan käsitellä suurina erinä, jolloin saadaan yhdenmukainen päällyste kaikkiin putkiin. Esitetyllä käsittelyllä putket tulevat kokonaan päällystetyksi sekä sisäpuolelta että ulkopuolelta. Immuunireaktioon käytetään kuitenkin vain putken sisäpintaa, joka ei naarmuunnu tai muulla tavoin vaurioidu käsittelystä johtuen.

Oheisessa piirustuksessa kuva 1 esittää keksinnön mukaista reagenssi-putkea ja kuva 2 samaa putkea liitettynä fluoronetrin kyvettiputkeen.

4 58839

Putkessa 1 on lieriömäinen yläosa 2 ja terävästi kartiomainen kärkiosa 3. Tämän kartiomuodon ansiosta putkessa voidaan käyttää hyvin pieniä nestetilavuuksia, esimerkiksi noin 10 ^ul:sta ylöspäin. Reagenssiputken lieriömäisen yläosan 2 ulkosivussa on toisaalta rengasmainen rajoitinuloke 4 ja toisaalta kaksi samoin rengasmaista, mutta ohuempaa uloketta 5, jotka ovat taipuisia ja täten toimivat tiivisteinä. On selvää, että tiivisterenkaiden lukumäärä voi vaihdella, mutta vähintään yksi tiivisterengas tulee putkessa olla. Sen sijaan rajoitinuloke 4 ei ole välttämättä tarpeellinen, joten se voidaan haluttaessa jättää pois.

Kuvassa 2 on esitetty miten reagenssiputki 1 on liitetty yhteen fluorometrin kyvettiputken 6 kanssa työntämällä sen sisään. Tällöin reagenssiputki pysähtyy kun sen rajoitinuloke 4 osuu kyvettiputken 6 suuhun. Reagenssiputken 1 yläosa 2 on mitoitettu niin, että sen ulkoläpimitta on kyvettiputken 6 sisäläpimittaa pienempi, mutta tiivisterenkaiden 5 läpimitta on kyvettiputken sisäläpimittaa suurempi, joten ne saavat aikaan putkien nestetiiviin tiivistyksen.

Immuunimäärityksen suorittamista varten entsyymillä merkittyä antigeeniä tai vasta-ainetta ja standardinäyte tai tutkittava näyte pipe-toidaan reagenssiputkeen esimerkiksi 100 ^ul tilavuuteen, putki suljetaan ja immunoreaktio suoritetaan esimerkiksi 14 h 4°C:ssa.

Tämän jälkeen neste imetään pois ja putki pestään esimerkiksi 0,1 M TRIS-HCl-puskurilla, pH 8,0. Fluorometrin kyvettiputkfeen pipetoi-daan 1 ml merkkiaineena käytetyn entsyymin substraattiliuosta, ja reagenssiputki sovitetaan tiiviisti kyvettiputken päälle. Yhteen-liitetyt putket käännetään ylösalaisin ja entsyymireaktion annetaan tapahtua pyörittämällä tai ravistelemalla putkia huoneen lämpötilassa tai 37°C :ssa 10-60 minuuttia. Tämän jälkeen entsyymireaktio keskeytetään kääntämällä yhteen liitetyt putket niin, että neste valuu kyvettiputkeen, reagenssiputki poistetaan ja kyvettiputki sijoitetaan fluorometriin ja fluoresenssi mitataan.

Suoritettaessa immunomääritys mikromittakaavassa reagenssiputkeen pipetoidaan tutkittava näyte tai standardinäyte ja entsyymillä merkittyä antigeeniä tai vasta-ainetta esimerkiksi 10 ^ul tilavuuteen, putki suljetaan jainkuboidaan kuten edellä on selostettu, minkä jälkeen neste imetään pois ja reagenssiputki pestään, samoin kuten edellä on selostettu. Tämän jälkeen reagenssiputkeen pipetoi- 5 58839 daan 15 yUl merkkiaineena käytetyn entsyymin substraattiliuosta ja inkuboidaan heikosti ravistellen 10-60 minuuttia 37°C:ssa. Reagens-siputkeen pipetoidaan sitten 2 ,ul 0,1 mooli/1 NaOH ja inkuboidaan O ' 10 minuuttia 60 C:ssa nikotiiniamidiadeniininukleotidifosfaatin (NADP+) hävittämiseksi. Reagenssiputkeen lisätään tämän jälkeen 50 /Ui syklausreagenssiä fluoresenssin vahvistamiseksi ja inkuboidaan

' O

60 minuuttia 37 C:ssa, minkä jälkeen fluorometrin kyvettiputki sovitetaan tiiviisti reagenssiputken päälle. Tämän jälkeen yhteen liitetyt putket käännetään ylösalaisin ja keitetään 2 minuuttia entsyymien hävittämiseksi syklausreaktion keskeyttämistä varten. Reagenssiputki poistetaan, kyvettiputkeen lisätään 1 ml indikaatto-rireagenssiä ja inkuboidaan 20 minuuttia huoneen lämpötilassa. Lopuksi kyvettiputki sijoitetaan fluorometriin ja fluoresenssi mitataan.

Keksinnön havainnollistamiseksi esitetään seuraava esimerkki.

Esimerkki

Testosteronin määritys plasmasta.

Kuvan 1 mukaiseen reagenssiputkeen, joka on päällystetty testosteroni-

11-sukkinyyli-BSA-antiseerumilla, lisätään 20 ^ul testosteroni-standardiliuosta tai näyteuutetta 100 ^ul:an immunoreaktioliuosta, jonka koostumus on 0,133 moolia/1 boraattipuskuria, pH 8,0, 0,02 % gelatiinia, sekä yhtäaikaa tai sen jälkeen testosteroni-3-karboksi-metyylioksiimi-glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasia (leimattua testosteronia) . Putkia inkuboidaan yli yön +4°C:ssa. Tämän jälkeen neste imetään pois ja putket pestään kolmasti 0,1 M Tris-HCl-puskurilla, pH 8,0. Fluorometrin kyvettiputkeen pipetoidaan 1 ml glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasin substraattiliuosta, jonka koostumus on 0,1 mooli/1 Tris-HCl-puskuria, pH 8,0, 5 mmooli/1 MgCl„, 0,01 % BSA

J- ^ 0,2 mmooli/1 NADP , 1 mmooli/1 glukoosi-6-fosfaattia. Tyhjä reagenssiputki sovitetaan tiiviisti fluorometrikyvetin päälle, yhteen liitetyt putket käännetään ylösalaisin ja entsyymireaktion annetaan tapahtua +37°C:ssa ravistellen 60 minuuttia (reaktio on lineaarinen ainakin 90 minuuttia). Tämän jälkeen entsyymireaktio keskeytetään kääntämällä yhteen liitetyt putket niin, että inkubaationeste valuu kyvettiputkeen, immunoreagenssiputki poistetaan ja fluoresenssi .mitataan f^gorome-trillä. '· ‘ * y * '

Claims (7)

58839 Tällä menetelmällä voidaan mitata plasman testosteronipitoisuuksia alueella 0,2-50 mmooli/1 tarvitsematta käyttää fluoresenssin vahvistusta.

1. Tapa suorittaa entsyymi-immuunimääritys siten, että reagens-siputkeen, jonka ainakin sisäpinta on päällystetty antiseerumilla tai antigeenillä, pannaan tutkittavan näytteen liuos tai standardi-liuos yhdessä merkkiaineena käytetyn entsyymiantigeeni- tai entsyy-mivasta-ainekompleksin kanssa ja annetaan niiden reagoida päällysteenä olevan antiseerumin tai antigeenin kanssa, sen jälkeen saatetaan päällyste ja siihen kiinnittyneet aineet reagoimaan entsyymin substraattiliuoksen kanssa ja lopuksi mitataan reaktiossa syntynyt aine kvantitatiivisesti, tunnettu siitä, että kun tutkittava näyte tai standardi on reagoinut reagenssiputken päällysteen kanssa, poistetaan liuos ja reagenssiputki sovitetaan suu alaspäin tiiviisti toisen, substraattiliuosta sisältävän putken suulle, yhteen liitettyjä putkia ravistelemalla tai pyörittämällä saatetaan substraattiliuos reagoimaan reagenssiputken päällysteen ja siihen kiinnittyneiden aineiden kanssa, reaktion päätyttyä käännetään yhteen liitetyt putket niin, että neste joutuu toiseen putkeen, minkä jälkeen reagenssiputki poistetaan ja kvantitatiivinen mittaus suoritetaan fluorometrisesti, jolloin merkkiaineena käytetään antigeeniin tai vasta-aineeseen kiinnitettyä hiivaglukoosi-6-fosfaattide-hydrogenaasia tai muuta entsyymiä, joka käyttää pyridiininukleoti-dia koentsyyminä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen tapa, tunnettu siitä, että toisena putkena käytetään fluorometrin kyvettiputkea.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen tapa, tunnettu siitä, että fluoresenssiä vahvistetaan sinänsä tunnetulla tavalla käyttäen entsymaattista syklausta tai lisäämällä natriumhydroksidia.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen tapa, tunnettu siitä, että entsymaattinen syklaus suoritetaan reagenssiputkessa.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen tapa, tunnettu siitä, että natriumhydroksidia lisätään kyvettiputkessa olevaan nesteeseen. 7 58839

6. Reagenssiputki patenttivaatimuksen 1 mukaisen tavan soveltamiseksi, jonka ainakin sisäpinta on ainakin osittain päällystetty antiseerumilla tai antigeenillä, tunnettu siitä, että pienen tilavuuden omaavassa reagenssiputkessa on terävän kartio-mainen kärkiosa (3) ja että toisen putken (6) sisään työnnettävässä päässä on ainakin yksi ulkopuolinen, rengasmainen, joustava tiiviste-elin (5).

7. Patenttivaatimuksen 7 mukainen reagenssiputki, tunnet-t u siitä, että sen toiseen putkeen (6) liitettävässä päässä on ulkopuolinen olake (4), jota vasten toisen putken pää on tarkoitettu asetettavaksi putkia sisäkkäin työnnettäessä.