DE2921975A1 - Verfahren und reagens fuer die biolumineszenz - Google Patents
Verfahren und reagens fuer die biolumineszenzInfo
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- DE2921975A1 DE2921975A1 DE19792921975 DE2921975A DE2921975A1 DE 2921975 A1 DE2921975 A1 DE 2921975A1 DE 19792921975 DE19792921975 DE 19792921975 DE 2921975 A DE2921975 A DE 2921975A DE 2921975 A1 DE2921975 A1 DE 2921975A1
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Description
Verfahren und Reagens für die Biolumineszenz
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Adenosintriphosphatkonzentrationen
durch Inkontaktbringen der zu untersuchenden Probe mit einem Biolumineszenzreagenz auf Basis vonD-Luciferin , Luciferase
und Magnesiumionen oder bestimmten anderen Metallionen zum Herbeiführen einer Reaktionen der das Adenosintriphosphat und D-Luciferin
unter Lichtemision an die Luciferase gebunden werden,und Messen
der ein Maß für die Adenosintriphosphatkonzentration darstellenden Intensität des emittierten Lichts. Die Erfindung betrifft auch ein Reagens
für die Biolumineszenz zur Verwendung bei der Bestimmung von Adenosintriphosphatkonzentrationen,
auf Basis von D-Luciferin, Luciferase und Magnesiumionen oder bestimmten anderen Metallionen.
Anwendungszweck der Erfindung ist die Bestimmung von Konzentrationen
des Adenosintriphosphats, im nachfolgenden als ATP bezeichnet, z.B. bei ATP-Umwandlungsreaktionen oder ATP umwandelnden Systemen.
Von ATP abhängige Biolumineszenzreagenzien sind an sich bekannt. Diese Reagenzien basieren auf ein Enzym, die Luciferase, und eines der
beiden Substrate, nämlich D-Luciferin und Magnesiumionen und bestimmte
andere Metallionen, an die das andere Substrat, ATP, in komplexer Weise gebunden werden muß, damit eine Reaktion stattfindet. Wenn das
ATP mit dem Reagens in Kontakt gebracht wird, findet eine Reaktion oder, richtiger gesagt, eine Reihenfolge von Reaktionen statt, die durch
die Luciferase katalysiert werden und die in schematisch vereinfachter und zum Teil hypothetischer Form in der Fig. 1 dargestellt sind. Die
Reaktionen 1 bis 3 sind im einzelnen an Luciferase aus dem gemeinen amerikanischen Glühwürmchen Photinus pyralis untersucht worden und
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diese Reaktionen stellen den Stand der Technik dar. Im Verlauf der letzten
Jahre sind mehrere Übersichtsaufsätze veröffentlicht worden; siehe
M. DeLuca, (1976), "Advance in Enzymology", (A. Meister, Verfasser), Band 44, Seiten 37-68, John Wiley & Sons, New York, sowie W.D.
McElroy, H.H. Seliger und M. DeLuca, (1974), "The Physiology of Insecta", 2. Auflage, (M. Rockstein, Verfasser), Band 11, Seiten 411-460,
Academic Press, New York.
Bei der Reaktion 1 wird aus Luciferase (E), ATP und D-Luciferin (LH,,)
freies Pyrophosphat (PPi) und enzymgebundenes Luciferyladenylat gebildet. Diese Reaktion begrenzt nicht die Geschwindigkeit der vollkommenen
Reaktion. Der entstehende Enzym-Luciferyladenylat-Komplex unterliegt
zwei Vorgängen, welche die Emissionsrate des anfangs enittierten Lichts begrenzen, nämlich einer Konformationsänderung und demEntzug
eines Protons aus dem Luciferyladenylat (s. M. DeLuca und W.D. McElroy, (1974), Biochemistry, Band 13, Seiten 921-925). Bei der Reaktion
2 wird Luciferyladenylat mit Sauerstoff oxidiert, unter Bildung von Adenosinmonophosphat, das nachfolgend als AMP bezeichnet wird, und
angeregtes Oxyluciferin (P*), welche beide enzymgebunden bleiben, und Kohlendioxid. In der Reaktion 3 geht das Oxyluciferin unter Emission
eines Photons in den Grundzustand über. Die zur Emission des Photons erforderliche Energie entstammt der Oxidation des Luciferins und nicht
dem Aufspalten der Pyrophosphatbindung im ATP.
Der bei der Reaktion 3 entstehende Enzym-Oxyluciferin-AMP-Komplex
ist stabil und kann durch Gelfiltration isoliert werden, wenn die Reaktion
in Gegenwart von Pyrophosphatase durchgeführt wird (B.J.Gates und M. DeLuca, (1975), Arch., Biochem, Biophys., Band 169, Seiten
616-621). In Abwesenheit von Pyrophosphatase wird ein Enzym-Oxyluciferin-Komplex
ohne AMP isoliert, der die gleiche Aktivität wie ein freies Enzym aufweist (s. den zuletzt genannten Aufsatz von Gates und
DeLuca).
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Die Stabilität des Enzym-Oxyluciferin-AMP-Komplexes führt dazu, daß
die Mischung aus Luciferase, D-Luciferin und ATP eher einen Lichtblitz als eine konstante Lichtemission ergibt . Die maximale Lichtintensität
wird innerhalb einer Sekunde erreicht und nimmt danach auf ein gleichbleibendes Niveau ab, bei dem die Regenerierung von freiem
Enzym im wesentlichen bei der gleichen Rate stattfindet wie die Emission des Lichts. Aufgrund der Tatsache, daß die freien Produkte die Reaktionen
inhibieren, ist das gleichbleibende Niveau jedoch nicht vollkommen konstant.
Die Bestimmung von ATP wurde üblicherweise so ausgeführt, daß die Probe mit einer unbekannten ATP-Konzentration mit dem Luciferase,
D-Luciferin und Magnesiumionen enthaltenden Biolumineszenzreagens vermischt wurde. Zur Erzielung einer maximalen Zuverlässigkeit der
Analyse sollte dabei das Vermischen in geeigneter Weise bei einer vorgegebenen Reaktionsgeschwindigkeit und in einer solchen Meßlage erfolgen,
daß die anfängliche Charakteristik des Meßlichtes aufgenommen werden kann (siehe A. Lundin und A. Thore, (1975), Anal. Biochem.,
Band 66, Seiten 47 - 63). Nach Aufnahme der bei der Bestimmung entstehenden Lichtintensität wird die Analyse mit einer Probe , die eine bekannte
ATP-Konzentration enthält,und mit einer Leerprobe ohne ATP wiederholt. Die unbekannte ATP-Konzentration wird aus diesen drei
Messungen bzw. Bestimmungen berechnet. Falls die Probe Stoffe enthielt, welche bei der Analyse störend wirken konnten, wurde eine interne
Standadisie r te chnik angewendet, d.h., die Probe wurde mit und ohne Zugabe einer bekannten ATP-Konzentration analysiert.
Bereits im Jahre 1952 wurden ATP-abhängige Biolumineszenzsysteme als zur Verfügung stehend aufgezeigt, und zwar nicht nur zur Bestimmung
des ATP, sondern im Prinzip auch zur Bestimmung jeglicher Substanz, die an ATP-Umwandlungsreaktionen teilnimmt (B. L. Strehier
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undJ.R. Totter, (1952), Arch. Biochem. Biophys., Band 40, Seiten
28-41). Die Möglichkeit, ein Biolumineszenzreagens zu einem ATP-Umwandlungssystem
zuzugeben, um die ATP-Konzentration kontinuierlich durch Messung der Lichtintensität zu verfolgen, hat jedoch sehr geringe
praktische Bedeutung erlangt. Die Ursache hierfür beruht zum Teil auf der Tatsache, daß die Aktivität der Luciferase während der Reaktion
infolge der vorstehend beschriebenen Produktinhibierung abnahm und zum Teil auf der Tatsache, daß die Luciferasereagenzien durch
ATP-Umwandlungssysteme verunreinigt wurden. Das Interesse an dem Verfahren vergrößerte sich jedoch, als es möglich wurde, durch Verwendung
von gereinigtem Luciferase und bei synthetischer Herstellung des Luciferins während einer Reaktionszeit von mehreren Minuten
eine vernachlässigbare Abnahme der Lichtintensität sowie der ATP-Konzentration zu erzielen (A. Lundin und A. Thore (1975), Anal. Biochem. 66,
Seiten 47 -63). Geeignete Bedingungen für die Analyse wurden untersucht und das Verfahren erwies sich als brauchbar für ATP-Konzentra-
—fi
tionen bis zu 10 M (A. Lundin, A. Rickardsson und A. Thore, (1977), Anal. Biochem. Band 75, Seiten 611-620). Trotz wiederholter Versuche ließ sich jedoch ein Reagens mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften in nur sehr wenigen Fällen herstellen.
tionen bis zu 10 M (A. Lundin, A. Rickardsson und A. Thore, (1977), Anal. Biochem. Band 75, Seiten 611-620). Trotz wiederholter Versuche ließ sich jedoch ein Reagens mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften in nur sehr wenigen Fällen herstellen.
Dennoch ist es möglich gewesen, die analytische Verwendbarkeit eines
Reagens mit den vorstehend angegebenen Eigenschaften für kinetische Bestimmungen von Substraten und Enzymen, Endpunktbestimmungen
von Substraten, Überwachungen von Photophosphorylation und verfolgende Beobachtung von lytischen Reaktionen aufzuzeigen (A. Lundin,
A. Rickardsson und A. Thore, (1976), Anal. Biochem. Band 75, Seiten 611-620; A. Lundin, A. Rickardsson und A. Thore, (1977),
"Proceedings of the 2nd Bi-Annual ATP Methodology Symposium, SAI
Technology Company, San Diego; A. Lundin, A. Thore und M. BaItscheffsky,
(1977), FEBS Lett. Band 79, Seiten 73-76; A. Lundin (1978),
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"Methods in Enzymology"(M. DeLuca, Verfasser), Band 57, Academic
Press, New York; A. Lundin und M. Baitscheffsky, (1978), "Methods
in Enzymology"(M. DeLuca, Verfasser), Band 57, Academic Press,
New York; A. Lundin und I. Styrelius, (1978), Clin.Chem. Acta und A. ThoreundA.C. Eriksson, (1977), FOA-report).
Die Schwierigkeiten bei der reproduzierbaren Herstellung eines Reagens
mit den oben angegebenen Eigenschaften lassen jedoch vermuten, daß die vorstehend angegebenen Verwendungen nicht außerhalb derjenigen
Laboratorien zum Einsatz gekommen sind, an denen die Verfahrensweisen entwickelt worden sind.
Aufgabe der Erfindung ist es somit, ein entsprechend verbessertes, gattungsgemäßes
Verfahren zur Bestimmung von ATP aufzuzeigen, bei dem ein zuverlässig meßbarer, stabiler Verlauf des Lichtintensitätpegels
entsteht, sowie ein in reproduzierbarer Weise herstellbares, zuverlässiges Reagens der gattungsgemäßen Art vorzusehen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man bei der Bestimmung
einen oder mehrere konkurrierende Inhibitoren der Reaktion in Form von Analogverbindungen des D-Luciferins verwendet. Ferner
wird die Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das Reagens zusätzlich einen oder mehrere konkurrierende Inhibitoren in Form von
Analogverbindungen des D-Luciferins enthält.
Gemäß der Erfindung führen die einen ATP-abhängigeη Biolumineszenzreagens
zugegebenen Zusätze zu einer Lichtemission, die während der gesamten Meßzeit denselben Proportionalitätsfaktor in Bezug auf die
ATP-Konzentration aufweist. Da das Biolumineszenzreagens selbst nur geringe Mengen an ATP verbraucht, ergeben Proben mit einer konstanten ATP-Konzentration eine konstante Lichtemission, welche die Ver-
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wendung des Reagens zu ATP-Bestimmungen erleichtert. Ferner läßt
sich ein Reagens mit den oben angegebenen Eigenschaften anderen ATP-Umwandlungssystemen
zugeben, so daß es in einfacher Weise ermöglicht werden kann, Änderungen der ATP-Konzentration durch kontinuierliche
Messung der Lichtintensität zu verfolgen und zu überwachen. Als ATP-Umwandlungssysteme
kommen z.B. Kombinationen von Enzymen und möglicherweise ein Substrat, das in einer Reaktion eine Bindung oder
ein Aufbrauchen von ATP ergibt, in Frage. Die analytische Verwendung des Reagens umfaßt die Bestimmung von ATP und Substanzen und Enzymen, die an ATP-Umwandlungsreaktionen teilnehmen, innerhalb, der
Gebiete der klinischen Chemie und der klinischen Microbiologie und bei der biochemischen und biologischen Forschung, insbesondere auf dem
Gebiet der Bioenergetik.
Vor der Anwendung der Erfindung ergab sich in verschiedenen Reagenzien
ein Variationsbereich der Stabilität des Lichtpegels, der sich von einer wenige Prozent pro Minute betragenden Abschwächung der Lichtintensität
bis zu einer Abnahme auf die Hälfte der ursprünglichen Lichtintensität nach 1 Minute erstreckte. Erfindungsgemäß wird jedoch aufgezeigt,
daß es die Zugabe eines D-Luciferinanalogs ermöglicht, in . reproduzierbarer Weise ein Reagens herzustellen, das die gewünschten
Eigenschaften, d.h. einen stabilen Lichtemissionspegel aufweist. Die Wirkung des D-Luciferinanalogs auf die Stabilität des Lichtpegels wurde
bisher nicht beobachtet und bei analytischen Anwendungen dürfte es nahegelegen
haben, die Gegenwart derartiger Analoge zu vermeiden, weil diese bekanntlich, mit dem D-Luciferin konkurrierend, die lichterzeugende
Reaktion inhibieren (J. L. Denburg).
Unter einem D-Luciferinanalog werden im Zusammenhang mit der Erfindung
Substanzen verstanden, welche die vorstehend beschriebene Luciferasereaktion
inhibieren, wobei diese Inhibierung in Bezug auf D-Lu-
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eiferin konkurrierend erfolgt. Die spezifischen D-Luciferinanaloge, welche
zum erwünschten Ergebnis führen, werden mit Leichtigkeit ermittelt, indem sie in inhibierender Konzentration dem Reagens zugegeben
werden und die Stabilität des Lichtpegels nach Zugabe von ATP bestimmt wird.
Obwohl die Erfindung nicht durch irgendeine spezifische Theorie bezüglich
der Reaktionsmechanik bei der Zugabe eines D-Luciferinanalogs
eingeschränkt ist, könnte eine derartige Zugabe zur Folge haben, daß ein geringerer Teil der gesamten Luciferasemenge als inaktiver Enzym-Produkt-Komplex
vorkommt. Da die freie Enzymkonzentration infolge der Bildung eines Enzym-Produkt-Komplexes abnimmt, wird der
Enzym-Luciferinanalog-Komplex wahrscheinlich unter Bildung von freiem
Enzym dissoziiert, wie dies durch die Reaktion 5 in der Fig. 1 gezeigt ist, in der E das D-Luciferinanalog darstellt. Durch Verwendung des
D-Luciferinanalogs, d.h. des konkurrierenden Inhibitors, läßt sich die Luciferasemenge ohne entsprechende Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit
vergrößern. Dieses trifft zu, unabhängig davon, ob das D-Luciferinanalog mit ATP gemäß Reaktion 1 reagiert oder, gemäß Reaktion 5,
einen Enzym inhibierenden Komplex bildet. Die wesentliche Voraussetzung ist lediglich, daß die Reaktionen umkehrbar und schneller als
die Reaktionen 2 bis 4 sind (die Reaktion 4 wird nachstehend im einzelnen erörtert).
Insofern freies AMP und freies Oxyluciferin bei der Reaktion gebildet
werden, ist es von Interesse zu untersuchen, ob dies auch die Inhibierung des Produkts beeinflußt. Wenn z.B. 1O~ M ATP zur Erzeugung
—fi —fi
von 10 M AMP und 10 M Oxyluciferin führen würden, so würde die Inhibierung des AMP die Aktivität der Luciferase um weniger als 0, 5 %
-4
beeinflussen, weil K für AMP 2, 4 χ 10 M beträgt (siehe R. T. Lee,
beeinflussen, weil K für AMP 2, 4 χ 10 M beträgt (siehe R. T. Lee,
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J. L. Denburg und W.D. McElroy, (1970), Arch. Biochem. Biophys.
Band 141, Seiten 38-52). Dagegen würde die Bildung von Oxyluciferin,
für das der K.-Wert 2, 3 χ 1O-7M beträgt (T. Goto, I. Kubota, N. Suzuki
und Y. Kishi, (1973), "Chemiluminiscence and Bioluminiscence" (Verfasser:
M. J. Cormier, D.M. Hercules und J. Lee), Seiten 325 - 335, Plenum Press, New York), die Luciferaseaktivität beträchtlich herabsetzen.
Folglich kann es unter bestimmten Bedingungen von Wichtigkeit sein, der Auswirkung der Erzeugung von freiem oxyluciferin entgegenzuwirken.
Durch Zugabe eines D-Luciferinanalogs wird die anfängliche Inhibierung der Luciferase so groß, daß die zusätzliche Inhibierung durch
das Oxyluciferin, welches bei der Reaktion kontinuierlich gebildet wird, vernachlässigbar ist. Die Zugabe von inhibierenden Konzentrationen
eines D-Luciferinanalogs wird folglich den Lichtpegel stabilisieren.
Bei der Durchführung der Analyse sollte die Konzentration des D-Luciferins
sättigend sein, d.h., so hoch, daß eine geringe Konzentrationsänderung die Reaktionsgeschwindigkeit nicht beeinflußt. Dies ist von
Wichtigkeit, weil andernfalls geringe Volumenänderungen die Reaktionsgeschwindigkeit
beeinflussen würden. Ferner können Bestandteile biologischer Proben die zur Luciferasereaktion verfügbare Konzentration
des D-Luciferins beeinflussen und auf diese Weise diese Reaktion inhibieren. Eine befriedigende Genauigkeit der Analyse könnte folglich nur
durch Verwendung von Sättigungskonzentrationen des D-Luciferins erzielt werden.
Durch die Zugabe eines D-Luciferinanalogs zum D-Luciferin läßt sich
anscheinend eine Sättigung bei einer niedrigen Konzentration des D-Luciferins erreichen, ohne daß die Genauigkeit der Analyse auf irgendeine
andere Weise als durch eine Reduzierung der Empfindlichkeit beeinflußt
wird. Dies stellt einen zusätzlichen Vorteil der Erfindung dar, weil das
D-Luciferin eine teure Substanz ist, die nur in Ausnahmefällen in Sättigungskonzentrationen
zugegeben werden kann.
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Die infolge der Zugabe eines Analogs verringerte Luciferaseaktivität
ist durch eine Erhöhung der Luciferasekonzentration kompensierbar. Es kann somit das Verhältnis von Luciferin zu Luciferase optimal eingestellt
werden, z.B. in Bezug auf die Kosten der Reagensherstellung, ohne daß dadurch die Empfindlichkeit der Analyse beeinträchtig wird.
Die diesbezügliche Wichtigkeit der Erfindung geht aus der Tatsache hervor, daß auf dem Weltmarkt für nur eine der entwickelten Anwendungen
der Bedarf zur Durchführung von etwa 5 Mill. Analysen pro Jahr besteht. Eine Verringerung der Kosten des Reagens um weniger als 1 Cent pro
Analyse würde somit zu erheblichen Kostenverkleinerungen führen. Dies bedeutet, daß die Erfindung auch in dieser Hinsicht einen sehr wesentlichen
Beitrag zur Praxis auf diesem Gebiet liefert.
Zusammenfassend ist zu folgern, daß die erfindungsgemäße Verwendung
des Luciferinanalogs es ermöglicht, das Verhältnis Luciferin/Luciferase optimal zu gestalten, z.B. in Bezug auf Herstellungskosten des Reagens,
sowie auch in Bezug auf eine Erhöhung der Stabilität des Lichtpegels. Eine geeignete Konzentration des D-Luciferins ist diejenige, die zu einer
Inhibierung der Luciferasereaktion und somit der Lichtintensität von mindestens 25 % führt, weil bei geringerer Inhibierung die Auswirkung
auf die Stabilität des Lichtpegels und die zur Sättigung benötigte Konzentration
des D-Luciferins zu klein ist, um bei der Analyse von wirtschaftlicher Bedeutung zu sein. Ein besonders bevorzugter Bereich beträgt
50 bis 90 %. Eine Inhibierung der Intensität von mehr als 90 % führt
u.a. dazu, daß unnötig große Anforderungen an die Meß- und Registriergeräte gestellt werden müssen und erfordert auch eine solche Erhöhung
der einzusetzenden Luciferase menge, daß die Analyse unwirtschaftlich
wird. Ferner entsteht bei großen Luciferasemengen leicht eine Störung der Analyse.
Gemäß einer spezifisch bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der oben erwähnte konkurrierende Inhibitor zusammen mit Pyro-
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phosphat dem Reagens zugegeben. Es ist an sich bekannt, daß Pyrophosphatkonzentrationen,
welche die Luciferasereaktion inhibieren, auch der Abnahme der Lichtintensität entgegenwirken (W.D. McElroy, J.W.
Hastings, J. Coulombre und V. Sonnenfeld (1953), Arch. Biochem. Biophys. Band 46, Seiten 399-416). Dies ist bisher jedoch nicht zur Verbesserung
der Analysebedingungen bei der Bestimmung von ATP verwendet worden.
Es wurde in überraschender Weise festgestellt, daß die kombinierte Verwendung
von Pyrophosphat in viel geringerer Konzentration als vorher
-4 üblich war, vorzugsweise in einer Höchstkonzentration von 10 M und
insbesondere in einer Konzentration von nicht mehr als 10 M, zusammen mit einem konkurrierenden Inhibitor in der vorstehend angegebenen
Konzentration zu einem sehr stabilen Lichtpegel führt. Durch diese Kombination
wird eine Stabilität des Lichtpegels erhalten, wie sie ansonsten nur durch erheblich größere Inhibierung der Luciferase unter Verwendung
von entweder Pyrophosphat oder einem D-Luciferinanalog erreichbar ist. Bei einer konkurrierenden Inhibierung mit einem D-Luciferinanalog
von etwa 50 % und einer Pyrophosphatkonzentration von 10 M ist es auf diese Weise möglich gewesen, einen Abfall der Lichtintensitätskurve
herbeizuführen, der weniger als 3 % beträgt. Bei einer Inhi-
—fi bierung von etwa 75 % und einer Pyrophosphatkonzentration von 10 M
ist es möglich gewesen, einen in der Größenordnung von 1 % liegenden Abfall der Lichtintensitätskurve zu erhalten. Eine derart stabile Lichtintensität
erlaubt es natürlich, viel weniger aufwendige Meß- und Registriergeräte einzusetzen, und sie stellt vor allem eine sehr gute Voraussetzung
für die kontinuierliche Analyse bei ATP umwandelnden Reaktionen dar. Bei der Erfindung sind die üblicherweise verwendeten Pyrophosphate
einsetzbar.
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Die Art der hier auftretenden Reaktion soll durch keine spezifische Theorie
der Reaktionsmechanik festgelegt werden. Es ist jedoch möglich,
daß das Pyrophosphat mit AMP imEnzym-Oxyluciferin-AMP-Komplex
gemäß der Reaktion 4 der Fig. 1 reagiert. Zur Bildung von ATP aus Pyrophosphat und AMP wird Energie benötigt. Diese Energie ergibt sich
wahrscheinlich durch die Rückumwandlung von Enzym zur ursprünglichen Konformation aus der vor der Oxidations reaktion bestehenden Konformation
(Reaktion 2 der Fig. 1). Das Auftreten einer Änderung der Konformation würde eine Erklärung dafür bieten, daß die Produktinhibierung
nicht konkurrierend ist (J. J. Lemasters und CR. Hacknebrock, (1977), Biochemistry , Band 16, Seiten 445-447), während Oxyluciferin ein konkurrierender
Inhibitor ist (siehe Goto und Mitarbeiter, (1973), a.a.O.). Die Reaktion mit Pyrophosphat würde somit eine starke,nicht konkurrierende
Inhibierung (siehe Goto und Mitarbeiter, (1973), a.a.O.) in eine schwächere, konkurrierende Inhibierung umwandeln. Der Auswirkung
der konkurrierenden Inhibierung auf den Lichtpegel kann erfindungsgemäß durch Zugabe eines D-Luciferinanalogs entgegengewirkt werden
(siehe oben). Gemäß der Reaktion 4 der Fig. 1 führt die Luciferasereaktion in Gegenwart von Pyrophosphat insgesamt zulanem Aufbrauchen
von ATP. Dies würde zur Stabilisierung des Lichtpegels beitragen.
Zusätzlich zur Mitwirkung bei der Abspaltung des Enzyms aus dem Enzym-Oxyluciferin-AMP-Komplex
könnte das Pyrophosphat in inhibierenden Konzentrationen dazu beitragen, die Reaktion 1 in Fig. 1 in Rückwärtsrichtung
zu treiben. Durch Zugabe von Pyrophosphat könnte somit die gesamte Enzymkonzentration erhöht werden, ohne eine entsprechende
Vergrößerung der Lichtintensität. Ein kleinerer Anteil der gesamten Enzymkonzentration wird dadurch in Form eines inaktiven Enzymproduktkomplexes
gegenwärtig sein. Inhibierende Pyrophosphatkonzentrationen würden somit zur Stabilisierung des Lichtpegels beitragen.
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Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird
dem Biolumineszenzreagens Coenzym A zugegeben, d.h. entweder in Kombination nur mit dem konkurrierenden Inhibitor oder in Kombination
mit dem konkurrierenden Inhibitor und Pyrophosphat. Es hat sich auch gezeigt, daß die Zugabe von Coenzym A den Lichtpegel stabilisiert. Die
Tatsache, daß sich eine Erhöhung der Lichtintensität durch Zugabe von nur Coenzym A erreichen läßt, ist an sich bekannt (siehe die Veröffentlichung
von R. L. Airth, W. C. Rhodes und W.D. McElroy, (1958), Biochem. Biophys. Acta, Band 27, ab Seite 519), jedoch ist die Verwendung
von Coenzym A zur Verbesserung der analytischen Bedingungen bei der Bestimmung von ATP bisher nicht vorgeschlagen worden.
Die Reaktionsmechanik des Coenzym A besteht wahrscheinlich darin,
daß die Verbindung mit Oxyluciferin im Enzym-Oxyluciferjn-AMP-Komplex
gemäß der Reaktion 4 in der Fig. 1 reagiert (in der das Coenzym A mit CoA bezeichnet ist). Die Reaktion zwischen dem Coenzym A
und dem Oxyluciferin ändert die nicht konkurrierende Produktinhibierung des Enzyms und des Gxylucifain-AMP-Komplexes zu einer schwachen
Konkurrierenden Inhibierung durch AMP, die unter normalen analytischen Bedingungen nicht vernachlässigbar ist.
Das Coenzym A übt somit seine Wirkung aus, ohne die Luciferasereaktion
zu hemmen. Hier ergibt sich ein Unterschied zu D-Luciferinanalogen
und, in bestimmten Fällen, auch zu Pyrophosphat. Die mit D-Luciferinanalogen
und Pyrophosphat erhaltene Inhibierung ist jedoch bei vielen analytischen Anwendungen ohne Wichtigkeit, weil die Empfindlichkeit
des Luciferaseverfahrens im allgemeinen sogar nach der Inhibierung zufriedenstellend ist. Wenn dies nicht der Fall ist, kann die Konzentration
der Luciferase erhöht werden, vorausgesetzt daß das Luciferasepräparat keinen hohen Anteil an Verunreinigungen aufweist, die bei der
Analyse stören. Bei bestimmten Anwendungen der Erfindung kann es so-
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mit von speziellem Interesse sein, ein hochgereinigtes Luciferasepräparat
zu verwenden. Verschiedene Verfahren zur Reinigung von Luciferase sind an sich bekannt und alle diese Verfahren lassen sich in den
meisten Fällen einsetzen. Wenn die Anforderungen an Reinheit sehr hoch sind, besteht eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung in der
Verwendung eines Reagens, das Luciferase enthält, die mittels der isoelektrischen
Fokussierung gereinigt worden ist. Luciferase läßt sich ferner gegen unspezifische Aktivierung dadurch schützen, daß die richtigen
Reaktionsbedingungen gewählt und schützende Substanzen, wie z.B. Rinderserumalbumin, Thiolverbindungen und/oder Äthylendiamintetraessigsäure
hinzugegeben werden.
Bei bestimmten biologischen Proben ist die Verwendbarkeit von Pyrophosphat
und Coenzym A durch das Vorkommen von Enzymsystemen begrenzt, welche diese Substanzen degradieren. In diesen Fällen läßt sich
die Wirkung derartiger Enzyme dadurch verhindern, daß ein Inhibitor zugegeben wird, der die Luciferasereaktion nicht beeinflußt. Die Pyrophosphataseaktivität
läßt sich z.B. durch Mangan- oder Fluoridionen inhibieren. Wird die synthetische Natur der Luciferinanaloge in Betracht
gezogen, ergibt sich, daß diese in den biologischen Proben vermutlich keiner enzymatischen Degradierung unterliegen.
Bei der Herstellung eines Biolumineszenzreagens mit gewünschten Eigenschaften muß die Auswahl an Substanzen oder an der Kombination
von Substanzen aus der Gruppe bestehend aus D-Luciferinanalogen,Pyrophosphatenund
Coenzym A je nach der Verwendung bestimmt werden. Dies beruht auf dem Umstand, daß die Anforderungen verschiedener
Verwendungen in Bezug auf Empfindlichkeit, Probenzusammensetzung, auftretenden StörreaKtionen, Preisniveau · des Reagens, Lagerstabilität
usw. variieren. Wird in Betracht gezogen, daß die Erfindung es
ermöglicht, eine Auswahl aus einer großen Gruppe von Substanzen zu
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treffen, dürften sich für den Fachmann keine Schwierigkeiten beim Auffinden
einer geeigneten Reagenzzusammensetzung für jeden einzelnen Anwendungszweck ergeben.
Zusätzlich zur vorstehenden Beschreibung der Vorteile und Anwendungen
der Erfindung ist hinzuzufügen, daß kontinuierliche Messungen und Beobachtungen von ATP umwandelnden Reaktionen mit dem erfindungs ge mäßen,
verbesserten Biolumineszenzreagens eine Empfindlichtkeit aufweisen,
die üblicherweise um mehrere Zehnerpotenzen größer ist, als die Empfindlichkeit des entsprechenden spektralphotometrischen Verfahrens.
Die analytische Verfahrensweise ist jedoch sehr ähnlich der Verfahrensweise
bei gedoppelter spektralphotometrischer Analyse, die z.B. auf der Grundlage der NAD+/NADH-Umwandlung durchgeführt wird. Bei der
Bestimmung von ATP in ATP nichtumwandelnden Systemen, d.h. in Proben mit konstanter ATP-Konzentration, weist ein Reagens mit den oben
angegebenen Eigenschaften auch ersichtliche Vorteile auf. Da das Licht konstant ist, werden keine Anforderungen an die Geschwindigkeit der
Vermischung von Reagens und Proben gestellt. Das Vermischen muß nicht in der Meßposition stattfinden und die Lichtmessung kann während
des Verlaufs einer beliebigen Zeitdauer durchgeführt werden. Hierdurch
wird die Empfindlichkeit und auch die Reproduzierbarkeit vergrößert. Bei der Bestimmung von ATP in Zellensystemen weist das erfindungsgemäße
Reagens auch große Vorteile auf, weil es die Messung der Konzentration
von extrazellulären!und intrazellulärem ATP in derselben Probe
ermöglicht. Zuerst wird die Konzentration von extrazellulären ATP gemessen, wonach ein lytisches Reagens, welches das Luciferasesystem
nicht beeinflußt, hinzugegeben und die der Konzentration von intrazellulären
ATP entsprechende Verstärkung des Lichts gemssen wird.
Obwohl die einzelnen Bestandteile des erfindungs ge mäße η Biolumineszenzreagens
der Einfachheit halber als Teile des Reagens beschrieben
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worden sind, ist es selbstverständlich möglich, diese getrennt zuzugeben.
Es lassen sich folglich eine oder mehrere der Komponenten zusammen mit den zur Erzielung des gewünschten pH-Werts erforderlichen
Puffers hinzugeben.
Anhand der nachstehenden, nicht einschränkenden Beispiele, wird die
Erfindung näher erläutert.
Dieses Beispiel, das sich auf die Fig. 2 bezieht, erläutert, wie D-Luciferinanaloge
(in diesem Falle L-Luciferin) und Pyrophosphat zusammen verwendet werden können, so daß ein Reagens mit stabilem Lichtpegel
bei bereits annehmbarer Inhibierung erhalten werden kann. Die im Beispiel verwendete Luciferase wurde mittels der isoelektrischen Fokussierung
gereinigt. In der Fig. 2 ist die Lichtintensität als Funktion der Zeit nach der Zugabe von ATP. in einer endgültigen Konzentration von
10~ M zur Reaktionsmischung gezeigt. In der Reaktionsmischung (endgültiges
Volumen ImI) ist in allen Fällen Luciferase, D-Luciferin
(100 pg/ml), Magnesiumacetat (10 mM), Rinderserumalbumin (0,1 %),
Äthylendiamintetraessigsäure (2 mM), und 0,1 M tris (Hydroxymethyl)
aniinomethanpuffer, der unter Verwendung von Essigsäure auf einen pH-Wert von 7, 75 eingestellt worden war, enthalten.
Die Fig. 2a zeigt die ohne weitere Zusätze erhaltene Lichtkurve . Ein
Reagens mit abfallendem Pegel gemäß der Fig. 2a ist zur kontinuierlichen Messung bei ATP umwandelnden Systemen nicht verwendbar. Die
Fig. 2b zeigt die Wirkung des Zusatzes von L-Luciferin (10 μg/ml), der
zu einer Inhibierung von etwa 70 % führt. Die Abnahme bzw. Abnahmecharakteristik
der Kurve ist annehmoar, jedoch können aufgrund der anfänglichen Spitzenwerte die Reagenzien bei hohen ATP-Konzentratio-
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nen zu kontinuierlichen Messungen in ATP umwandelnden Systemen nicht
verwendet werden. Werden höhere Konzentrationen des Zusatzes eingesetzt und dabei größere Inhibierungen erhalten, so ergeben sich jedoch
dabei geradelinige Lichtkurven und brauchbare Reagenzien. In der Fig. 2c ist die Wirkung von Pyrophosphat (10~ M) gezeigt. Der Abfall der Lichtkurve
ist immer noch zu groß und es ergibt sich anfangs in geringem Ausmaße ein Spitzenwert. Bei höheren und mehr inhibierenden Konzentrationen
des Zusatzes nähert sich die Lichtkurve mehr einer Geraden. Die Fig. 2d zeigt die Wirkung von L-Luciferin (10 pg/ml) und Pyrophosphat
(10 M). In diesem Fall sind der Abfall der Kurve sowie auch der anfängliche Spitzenwert fast vollkommen verschwunden. DiesesReagens
ist somit zu analytischen Zwecken gut geeignet. Nur die Reagenzien, die
L-Luciferin (2b und 2d) enthalten, wobei ans cheinaxi eine Sättigung in Bezug
auf Luciferin (D+L, siehe oben) gegeben ist, werden fol^icherweise
eine maximale Genauigkeit bei der Analyse ergeben.
Zur Frage der Terminologie bei dem in dieser Beschreibung verwendeten
Begriff "Analogverbindung des D-Luciferins" bzw. "D-Luciferinanalog"
wird auf den in der englischsprachigen Literatur verwendeten Ausdruck "luciferin analogue" hingewiesen, wie er z.B. im Auf satz von
Denburg, Lee und McElroy in Arch. Biochem. Biophys. (1969), 134, Seiten 381-394 vorkommt.
Zum Begriff "konkurrierender Inhibitor" wird hingewiesen auf Segel,
"Enzyme Kinetics", (1975), Verlag Wiley-Interscience", New York, wonach ein "konkurrierender Inhibitor" ein nichtmetabolisierbares
Analog oder Derivat des echten Substrats oder ein alternatives Substrat des Enzyms oder ein Produkt der Reaktion sein kann. Eine technologisch
äquivalente Wirkung liegt hier vor.
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Claims (16)
- LIEDL, NÖTR> ZEIYLE*Patentanwälte
8000 München 22 · Steinsdorfstraße 21-22 · Telefon 089 / 22 94 41LKB- PRODUKTER AB 16125 Brommal, SCHWEDENundARNE THORWALD LUNDIN Gaveliusgatan 6, 11641 Stockholm, SCHWEDENVerfahren und Reagens für die BiolumineszenzPatentansprüche:IJ Verfahren zur Bestimmung von Adenosintriphosphatkonzentra-tionen durch Inkontaktbringen der zu untersuchenden Probe mit einem Biolumineszenzreagenz auf Basis von D-Luciferin, Luciferase und Magnesiumionen oder bestimmten anderen Metällionen zum Herbeiführen einer Reaktion, in der das Adenosintriphosphat und D-Luciferin unter Lichtemision an die Luciferase gebunden werden,und Messen der ein Maß für die Adenosintriphosphatkonzentration darstellenden Intensität des emittierten Lichts, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Bestimmung einen oder mehrere konkurrierende Inhibitoren der Reaktion in Form von Analogverbindungen des D-Luciferins verwendet. - 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,daß man die D-Luciferinanalo@3· in einer Konzentration einsetzt, die zu einer Inhibierung von mindestens 25 %, vorzugsweise 50 bis 90 % der Lichtintensität führen.A9255-J/W 909849/0814
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als D-Luciferinanalog. L-Luciferin einsetzt.
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Bestimmung auch Pyrophosphat verwendet.
- 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daii man das Pyrophosphat in einer maximalen Konzentration von lo" M, vorzugsweise in einer maximalen Konzentration von 10 M einsetzt.
- 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man auch Coenzym A bei der Bestimmung einsetzt.
- 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Luciferase enthaltendes Reagens einsetzt, das durch isoelektrische Fokussierung gereinigt worden ist.
- 8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Luciferase enthaltendes Reagens mit einem Zusatz an Rinderserumalbumin, Thiolverbindungen und/oder Xthylendiamintetraessigsäure einsetzt.
- 9. Reagens für die Biolumineszenz zur Verwendung bei der Bestimmung von Adenosintriphosphatkonzentrationen, auf Basis von D-Luciferin, Luciferase und Magnesiumionen oder bestimmten anderen Metallionen, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen oder mehrere konkurrierende Inhibitoren in Form von Analogverbindungen des D-Luciferins enthält.9255 909849/08U
- 10. Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das D-Luciferinanalog in einer Konzentration vorliegt, die zu einer Inhibierung von mindestens 25 %, vorzugsweise 50 bis 90 % der Lichtintensität führt.
- 11. Reagens nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das D-Luciferinanalog L-Luciferin ist.
- 12. Reagens nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch ge kennzeichnet, daß es auch Pyrophosphat enthält.
- 13. Reagens nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,-4 daß das Pyrophosphat in einer maximalen Konzentration von 10 M,-5 vorzugsweise in einer maximalen Konzentration von 10 M vorliegt.
- 14. Reagens nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch ge kennzeichnet, daß es auch Coenzym A enthält.
- 15. Reagens nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es Luciferase enthält, die durch isoelektrische Fokussierung gereinigt worden ist.
- 16. Reagens nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es Luciferase mit einem Zusatz an Rinderserumalbumin, Thiolverbindungen und/oder Äthylendiamintetraessigsäure enthält.9255 90 9849/Ό8 U-
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