DE2921380A1 - Verfahren zur abtrennung von glukoseisomerase - Google Patents

Verfahren zur abtrennung von glukoseisomerase

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DE2921380A1 DE19792921380 DE2921380A DE2921380A1 DE 2921380 A1 DE2921380 A1 DE 2921380A1 DE 19792921380 DE19792921380 DE 19792921380 DE 2921380 A DE2921380 A DE 2921380A DE 2921380 A1 DE2921380 A1 DE 2921380A1
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dipl
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Satoshi Mitsuda
Shigeyasu Nabeshima
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Extrahieren von Glukoseisomerase; insbesondere betrifft die Erfindung ein verbessertes Verfahren zum Extrahieren von Glukoseisomerase aus Mikroorganismen, welche in ihren Zellen Glukoseisomerase-Aktivität aufweisen.
Glukoseisomerase ist die übliche Bezeichnung für ein Enzym, das die reversible, gegenseitige Umwandlung zwischen Glukose und Pruktose katalysiert.
München: R. Kramer Dipl.-Ing. . W. Weser Dipl.-Phys. Dr. rer. nat. · H.P. Brehm Dipl.-Chem. Dr. phil. nat. Wiesbaden: P. G. Blumbach Dipl.-Ing. · P. Bergen Dipl.-Ing. Dr. Jur. . G. Zwirner Dipl.-Ing. Dipl.-W.-Ing.
909840/0953
Glukoseisomerase stellt ein intracelluläres Enzym dar, tritt in verschiedenen Mikroorganismen auf und wird bereits in industriellem Maßstab zur Isomerisierung von Glukose eingesetzt, um einen fruktosereichen Zuckersaft aus Getreide, insbesondere Mais, zu erhalten. Nach bekannten Vorschlägen zur praktischen Anwendung des Enzyms ist zumeist ein absatzweise arbeitendes Verfahren vorgesehen worden, bei dem die das Enzym produzierenden Mikroorganismen direkt oder zumindest nach einer Wärmebehandlung der Zellen in das Reaktionsgefäß eingebracht worden sind, um zu verhindern, daß Enzymkomponenten aus den Zellen freigesetzt werden. Nach diesem Verfahren ist die Reaktionsdauer lang; es wird ein farbiges Produkt erhalten; und die Zellen können lediglich einige wenige Einsätze verwendet werden. Um diese Nachteile zu überwinden, ist kürzlich ein Verfahren vorgeschlagen worden, bei welchem die Isomerisierungsreaktion kontinuierlich durchgeführt wird, wobei nach verschiedenen Verfahren unbeweglich gemachte Glukoseisomerase eingesetzt wird. Die Maßnahmen zum Unbeweglichmachen von Glukoseisomerase können grob gesprochen in zwei Gruppen von Verfahren eingeteilt werden; nach der einen Gruppe werden die das Enzym erzeugenden Mikroorganismen unbeweglich gemacht; bei der anderen Gruppe wird die aus den Mikraorganismenzellen extrahierte Glukoseisomerase unbeweglich gemacht. Obwohl beide Verfahrensarten nicht völlig frei von Nachteilen sind, erweist sich das letztere Verfahren als zweckmäßiger, da ein Enzym mit höherer Aktivität pro Gewichtseinheit unbeweglich gemachtes Enzym erhalten werden kann; das extrahierte Enzym beständig Istj und ein höhere Produk-
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tivität gewährleistendes unbeweglich gemachtes Enzym erhalten werden kann. Daraus folgt Jedoch, daß ein erhebliches, auch wirtschaftliches Interesse der Fachwelt daran besteht, ein Verfahren zu entwickeln, nach dem große Mengen der Enzyme innerhalb kurzer Zeit extrahiert werden können. Es sind eine Reihe von Verfahren zum Aufbrechen von Mikroorganismenzellen zur Gewinnung des aktiven Enzyms entwickelt worden; zu solchen bekannten Verfahren gehören die Behandlung mit Ultraschallwellen, das Gefrieren und Auftauen der Zellen, die AutoDigestion bzw. Autolyse der Zellen, eine Schleifbehandlung, die Einwirkung von hohem Druck und dessen Verminderung, eine Behandlung mit Lysozym sowie mechanisches Schütteln mit Abriebkörpern. Alle diese Verfahren sind grundsätzlich zum Extrahieren von Glukoseisomerase geeignet.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind umfangreiche Untersuchungen über die Eignung dieser Verfahren zum Aufbrechen von Mikroorganismenzellen zum Extrahieren aktiver G-lukos ei some rase angestellt worden (vgl. Tabelle 1). Als Ergebnis ist festgestellt worden, daß die Entspannung von hohem Druck, verbunden mit Schlag- oder Stoßeinwirkung, wobei im einzelnen eine Suspension der Mikroorganismenzellen unter hohem Druck durch eine Öffnung geführt wird, so daß ein plötzlicher Druckabfall erfolgt und daraufhin eine Stoßeinwirkung vorgesehen wird, ein Verfahren darstellt, daß in kurzer Zeitspanne die Behandlung der Mikroorganismenzellen erlaubt, dabei eine hohe Beibehaltung der Enzymaktivität gewährleistet fBeibehaltung der Enzymaktivi-
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tat (%) = (Gesamtaktivität des Überstandes aus den Mikroorganismenzellen nach 10 min langem Zentrifugieren des homogenisierten Extraktes "bei 10 000 G)/Gesamtaktivität der Suspension der Mikroorganismenzellen vor der Homogenisierung) χ 100}; ferner erlaubt dieses Verfahren die Verarbeitung großer Mengen an Mikroorganismenzellen in industriellem Maßstab. Als Ergebnis weiterer umfangreicher Untersuchungen zu
diesem Verfahren ist festgestellt worden, daß der Wirkungsgrad der Extraktion von Glukoseisomerase stark von der Konzentration der Mikroorganismenzellen in der Suspension und von dem angewandten Druck abhängt, so daß eine rohe Enzymlösung von Glukoseisomerase erhalten werden kann, die 100% oder mehr beibehaltene Aktivität aufweist, sofern die Konzentration der Suspension und der Druck geeignet ausgewählt werden; weiterhin lassen sich die Mikroorganismenzellen nach der Extraktion leicht abtrennen. Die vorliegende Erfindung beruht auf der Ergebnissen dieser Untersuchungen. Das heißt, mit der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Extrahieren von Glukosisomerase aus diese enthaltenden Mikroorganismenzellen bereitgestellt, wobei die Konzentration der Suspension der Mikroorganismenzellen auf einen Wert zwischen 0,5 bis 10 Gew.-% (bezogen auf die Trokkensubstanz) eingestellt wird und der Druck auf einen Wert zwischen 39,2 und 68,6 MPa (400 bis 700 at) eingestellt wird, was eine wirksame Extraktion von Glukoseisomerase gewährleistet.
Die nachfolgende Tabelle 1 bringt einen Überblick über verschiedene bekannte Verfahren im Vergleich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Extrahieren von Glukosisomerase aus Mikroorganismenzellen, wobei jeweils das Mittel der Enzymaktivität <*) angegeben ist. 909848/0953
'Tabelle 1
Verschiedene untersuchte Extraktionsverfahren
Verfahren Gerät/Mittel Bedingungen 4 sonstige
Bedingungen		 beibehal.
(Hersteller) Suspensions- Behandl.
volumen dauer
(ml)x (h)		 24 100 rag,
400C		 Aktivi
tät xx
(%)
lysozymbehandlung 3x kristallisiertes
Eiweißlysozym
(Tokyo Kasei)		 1.000 10
0,33		 über Nacht bei
15-2O0C aufbew.		 91,0
Autodigestion Toluol 500 1,0 900 U/min
500 g Perlen
ca. 50 g Seesand		 46,6
CO
O		 mechanisches
Schütteln
in		 Kugelmühle
Waring-Mischer		 500
50		 1,0 ca.100 g Seesand 99,5
41,7
CO
OO
■fc-		 Abriebkörpern Mischer (Nippon
Seiki Seisakusho)		 100 0,25 Schleifstein
abstand: 0,2 mm		 95,6
60/8 Vermählen rotierender
Schleifstein
(Tokushukika Kogyo)		 1.000 0,02 9 KHz 95,9
01 Ultraschall
well enb ehan dlung		 Ultras challgenerator
(Kubota Shoji)		 100 Druck 53,9 MPa
(550 at)		 118,6
Entspannung nach
Hoch-druckeinwirkung
und Stoßeinwirkung
(gem.d.Erfindung)		 Gaulin-Homogenisator
(Gaulin Corp.)		 1,000 106,0
Der Mikroorganismenzellen-Anteil der Suspension betrug in allen Fällen 5 Gew.-%
/"Beibehaltene Enzymaktivität (%) = (Ge samt aktivität des Überstandes aus den
Mikroorganismenzellen nach 10 min langem Zentrifugieren des homogenisierten Extraktes bei 10 000 G)/Gesamtaktivität der Suspension der Mikroorganismenzellen
vor der Homogenisierung) χ 10Oj
CJ CO O
Nachfolgend werden Grundlagen der Erfindung im einzelnen beschrieben.
Eine Suspension der Mikroorganismenzellen mit einem Mikroorganismenzellen-Anteil von 0,5 bis 10 Gew.-% der Trockensubstanz wird unter einem Druck von 39,2 bis 68,6 MPa (400 bis 700 at) in die Ventilzone eines Ventiles eingebracht. Die Druckkraft öffnet das auf einen bestimmten Druck einstellbare Ventil, und die Suspension tritt durch die Ventilöffnung hindurch, wobei ein plötzlicher Druckabfall (innerhalb einer Zeitspanne von weniger als 10 ;is) auf einen Wert von weniger als 98 066 Pa (1 at) eintritt, was zu einer Scherwirkung und Cavitationsblasen führt, wodurch die Zellteilchen in Partikel mit wesentlich geringerer Teilchengröße zerbrochen werden. Das erhaltene Suspensionsprodukt prallt daraufhin mit einer Geschwindigkeit von mehr als 15 km/min auf einen Schlagring, was dank der Schlag- oder Stoßwirkung zu einer weiteren Zertrümmerung der Partikel führt. Auf diese Weise wird die Suspension der Mikroorganismenzellen wirksam homogenisiert und erlaubt die Extraktion von Glukoseisomerase bei einer Beibehaltung der Enzymaktivität von 100% oder mehr unter einigen Verfahrensbedingungen. Die homogenisierte Suspension wird unter einem Druck abgegeben, der die Portbewegung der Suspension gewährleistet. Die Tatsache, daß eine beibehaltene Enzymaktivitat (wie sie oben definiert worden ist) von 100% oder mehr erhalten werden kann, ist ein Hinweis auf die vorteilhafte Extraktion des Enzyms für die industrielle Verwendung von Glukoseisomerase. Sofern die Mikroorganismenzellen-Suspension eine größere Verdün-
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nung aufweist, dann kann das Enzym bei einem relativ niedrigeren Druck extrahiert werden. Jedoch werden die Extraktmengen zu groß, so daß eine lange Zeitspanne erforderlich ist, um die Mikroorganismenzellen abzutrennen und eine konzentrierte, rohe Enzymlösung zu erhalten. Die Einwirkung von Hochdruck auf eine verdünnte Suspension führt zu einem Zerbrechen der Zelle in unnötig kleine Partikelchen, so daß die Abtrennung der zerteilten Mikroorganismenzellen erhebliche Schwierigkeiten bereitet und offensichtlich auch eine geringere spezifische Aktivität des extrahierten Enzyms auftritt. Sofern andererseits eine hochkonzentrierte Suspension der Mikroorganismenzellen verwendet wird, kann eine ausreichende Extraktion des Enzyms nicht durchgeführt werden, sofern nicht die Einwirkung von außerordentlich hohem Druck vorgesehen ist, oder die oben genannten Behandlungsechritte vielmals wiederholt werden. Mit anderen Worten ausgedrückt, soll die Konzentration der Mikroorganismenzellen in der Suspension und der angewandte Druck gegenseitig abgestimmt und gut ausgeglichen werden. Die oben angegebenen Bereiche für die Konzentration der Suspension und für den Druck sind nach umfangreichen Untersuchungen so ausgewählt worden, daß wirtschaftlich vorteilhafte Bedingungen resultieren. Insbesondere ist vorzugsweise vorgesehen, die Konzentration der Suspension an Mikroorganismenzellen bei einem Wert zwischen 1,5 und 6 Gew.-%, sowie den angewandten Druck bei einem Wert zwischen 44,1 und 58,8 MPa (450 bis 600 at) zu halten, wodurch es möglich wird, in einem kontinuierlich arbeitenden Verfahren mit gutem Wirkungsgrad bei einmaliger Abfolge der Druckeinwirkung, Druckentspannung und Stoßeinwirkung eine G-lukoseisomeraselösung mit einer beibehaltenen Akti-
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vität von 100% oder mehr zu erhalten.
Aus den gezüchteten Mikroorganismenzellen kann ohne irgendeine "besondere Behandlung die Suspension erzeugt werden; andererseits können die Mikroorganismenzellen aus der Kulturbrühe abgetrennt werden und daraufhin einer Gefrier- oder Wärmebehandlung ausgesetzt werden, bevor sie in die Form der Suspension gebracht werden. Das zum Suspendieren der Mikroorganismenzellen verwendete Wasser kann entweder Leitungswasser, deionisiertes V/asser oder destilliertes Wasser sein. Zur Stabilisierung des Enzyms wird vorzugsweise deionisiertes oder destilliertes Wasser verwendet. Zur Einstellung des pH-Wertes der Suspension kann eine Pufferlösung verwendet werden; vorzugsweise werden Magnesiumionen in einem Anteil von 1 χ 10 M bis 5 x 10 M zugesetzt, was die Stabilität und Aktivität des Enzyms verbessert. Die Suspension wird zumeist auf einen pH-Wert vor. 6,0 bis 10,0, vorzugsweise auf einen pH-Wert von 7,0 bis 9,0 eingestellt. Die Extraktion wird zweckmäßigerweise bei einer Temperatur von 10 bis 600C durchgeüirt.
Industriell verwertbare Glukoseisomerase wird hauptsächlich in Zellen gefunden, die zu Mikroorganismen der Gattung Streptomyces gehören. Das erfindungsgemäße Extraktionsverfahren kann auf Mikroorganismen der Gattung Streptomyces angewandt werden, welche Glukoseisomerase zu erzeugen vermögen; hierzu gehören Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces albus, Streptomyces roseochromogenus, Streptomyces wedmorensis,
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Streptomyces flavovirens, Streptomyces achromogenes und ähnliche Streptomycesstämme.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine handelsübliche Homogenisiervorrichtung verwendet werden, welche die Anforderungen an die erfindungsgemäße Extraktion von
Glukoseisomerase erfüllt; beispielsweise kann hierzu ein sog. (von Gaulin Corporation vertriebener) Gaulin-Homogenisator verwendet werden. Mittels diesem Homogenisator ist es möglich, zum Extrahieren von Glukoseisomerase pro Stunde ungefähr 50 bis 9000 1 Mikroorganismenzellen—Suspension zu homogenisieren, wobei die erfindungsgemäße Abfolge von Behandlungsschritten durchgeführt wird, nämlich
(1) die zu behandelnde Suspension wird angesaugt;
(2) auf die Suspension wird Druck ausgeübt;
(3) der ausgeübte Druck wird plötzlich abgesenkt;
(4) es erfolgt die Schlag- oder Stoßeinwirkung;
(5) das homogenisierte Produkt wird abgezogen;
wobei ein Druck von 39,2 bis 68,6 MPa (400 bis 700 at) vorgesehen ist, welcher durch Veränderung der leistung eines Motors erzeugt wird.
Die Druckeinwirkung auf die Mikroorganismenzellen-Suspension erfolgt zumeist mittels einer Kolbenpumpe, so daß es
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relativ leicht ist, ein großes Volumen der Suspension in kurzer Zeit bei kontinuierlich ablaufender Betriebsweise zu homogenisieren.
Sofern die Konzentration der Mikroorganismenzellen in der
Suspension zwischen 0,5 und 10 Gew.-% (bezogen auf Trockensubstanz -Basis) gehalten wird, ist es möglich, G-luko sei somerase bei einer Enzymaktivität von 80% oder mehr im Verlauf
eines einzigen Durchganges der oben angegebenen Verfahrens schritte zu extrahieren; andererseits kann die Abfolge der gleichen Verfahrensschritte für die gleiche Suspension einige Male wiederholt werden. Es wird besonders bevorzugt, eine Suspension der Mikroorganismenzellen zu verwenden, deren Anteil 1,5 bis 6 Gew.-% (bezogen auf Trockensubstanzbasis) beträgt. Bei einmaliger, kontinuierlicher Vornahme der Abfolge von Behandlungsschritten unter Einhaltung eines Druckes von 44,1 bis 58,8 MPa (450 bis 600 at) kann innerhalb einer kurzen Zeitspanne eine große Menge G-lukoseisomerase bei einer Beibehaltung der Enzymaktivität von 100% oder mehr extrahiert werden.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne diese einzuschränken. In den Beispielen wurde die Aktivität der Glukoseisomerase, der Proteingehalt und der Pruktοsegehalt nach den nachstehend angegebenen Verfahren bestimmt :
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(1) Aktivi täfb e s timmung
Einer Glukoseisomeraselösung werden 0,1 M D-Glukoselösung, 0,05 M Phosphatpufferlösung und 0,005 M MgSO. χ 7 HpO-lösung zugesetzt« Unter Aufrechterhaltung eines pH-Wertes von 7,0 läßt man 1 h lang "bei 700C reagieren und bestimmt daraufhin den Anteil an gebildeter Fruktose. Die Aktivität wird in "Einheiten" ausgedrückt, wobei diejenige Enzymmenge, die 1 mg Fruktose unter diesen Bedingungen zu erzeugen vermag, als 1 Einheit definiert ist.
(-2) Messung des Fruktosegehaltes
Der Pruktosegehalt wird quantitativ aus dem Absorptionsvermögen einer 30 min bei 300C gehaltenen Cystein-Carbazol-Schwefelsäure-Lösung bei 560 nm bestimmt. Unter diesen Bedingungen beträgt die auf Glukose zurückführbare Verfärbung lediglieh ungefähr 1/200 der auf üfruktose zurückgehenden Verfärbung; daher ist die durch Glukose hervorgerufene Verfärbung vernachlässigbar.
(3) Quantitative Bestimmung des Proteingehältes
Die quantitative Bestimmung des Proteingehaltes erfolgt nach dem Lowry-Verfahren; vgl. Biochemistry Experiment Course, Band 5, Seite 27. Die Calibrierungskurve wurde mittels kristallisiertem Rinderserumalbumin (250 tig/ml lösung) aufgestellt.
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Beispiel 1:
5 kg, Glukoseisomerase enthaltende, gefrorene, feuchte Mikroorganismenzellen (Feuchtigkeitsgehalt 57%), nämlich Zellen von Streptomyces phaeochromogenes (vertrieben von Nagase Sangyo Co.) werden in 5 χ 10 M Phosphatpuffer-Lösung (pH-Wert 7,5, mit 5 x 10""* M Mg++-Ionen) suspendiert, so daß insgesamt 50 kg Mikroorganismenzellen-Suspension erhalten werden. Die Gesamtaktivität der Suspension der Mikroorganismenzellen beträgt 8,04 x 10 Einheiten. Dieee Suspension wird kontinuierlich mittels einem Gaulin-Homogenisator (Modell 15 M, vertrieben von Gaulin Co.) homogenisiert, um Glukoseisomerase aus den Zellen zu extrahieren. Die Gesamtaktivität des nach Zentrifugieren des Mikroorganismenzellen-Extraktes erhaltenenen Tiberstandes beträgt 8,44 x 10 Einheiten; d.h., die beibehaltenene Enzymaktivität (im Sinne obiger Definition) beträgt 105%. Zum Extrahieren wirkte auf die Mikroorganismenzellen-Suspension ein Druck von 53,9 MPa (550 at) ein; die erforderliche Dauer zur Homogenisierung der gesamten Suspension betrug ungefähr 55 min; die Homogenisierung wurde bei Raumtemperatur (ungefähr 200C) durchgeführt.
Beispiel 2:
Gezüchtete, lebende Mikroorganismenzellen (178 g feuchtes Material bzw. ca. 85 g auf Trockensubstanzbasis) Streptomyces albus (hinterlegt unter der Bezeichnung ATCC Nr.21132
Ö098A8/0953
bzw. YT Wr. 5) wurden in deionisiertem Wasser suspendiert, das 5 x 10"^ M Mg++-Ionen enthielt; der pH-Wert wurde auf 7,3 eingestellt; es wurde ein Gesamtvolumen von 1280 ml erhalten. Die Gesamtaktivität der Suspension beträgt 2,5 x 10
Einheiten. Durch Homogenisierung dieser Suspension mittels einem Gaulin-Homogenisator (Modell 15 M) bei einem Druck von 54,9 MPa (560 at) wurde aus den Zellen Glukoseisomerase extrahiert. Die Behandlungsdauer betrug ungefähr 1,5 min. Von dem Extrakt wird eine Probe (ungefähr 10 ml) entnommen; diese Probe zentrifugiert, und an dem gebildeten Überstand der Proteingehalt und die Enzymaktivität gemessen; aus diesen Meßwerten wurde die Gesamtaktivität und die beibehaltene Aktivität be-rechnet. Daraufhin wurde das homogenisierte Material noch zweimal unter Yomahme der gleichen Maßnahmen unter den gleichen Bedingungen wie im Verlauf des ersten Homogenisierungszyklus homogenisiert; an jedem Überstand wurde der Proteingehalt und die Aktivität gemessen, aus denen wiederum die beibehaltene Aktivität berechnet wurde. Die ermittelten Ergebnisse sind nachfolgend in Tabelle 2 angegeben. Die Behandlung erfolgte bei Raumtemperatur (ungefähr 200C).
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Tabelle 2
Anzahl d. Enzym- Protein- spez. Gesamt beibehal.
Durchgänge aktivität gehalt Aktivität Aktivität Aktivität
(Einheiten/ml) (mg/ml) (Einheiten/ (Einheiten)
mg Protein)
1 174 2, 79 62 ,4 2 ,23 X 105 89, 0
2 203 3, 33 61 ,0 2 ,60 X 105 104
3 210 3, 90 53 ,8 2 ,69 X 105 108
In obigem Beispiel erfolgte die Züchtung von Streptomyces albus ■ nach einem üblichen Verfahren, wie es beispielsweise in der geprüften japanischen Patentpublikation 16352/1969 bechrieben ist.
Beispiele 3 und 4:
Es wurde eine gefrorene, feuchte Zellmasse (Peuchtigkeitsgrad 57%) der Mikroorganismen nach Beispiel 1 eingesetzt; die Mikroorganismenzellen wurden in 5 χ 10 M-Phosphatpuffer-Lösung mit 5 x 10 .M Mg++-Ionen suspendiert. Die Extraktion dieser Suspension erfolgte bei Raumtemperatur mittels einem Gaulin-Homogenisator (Modell 15 M) wobei der Behandlungszyklus lediglich einmal durchlaufen wurde. Die Behandlungsbedingungen und die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 3 angegeben.
'80984 8/09S3
Tabelle
CD CO OO *■* OO "^. O
OT Ci*
Beispiel
Suspension
Behandlungsbed.
kg Zellen/ Gesamt- Druck Behandlungs-
kg Suspension aktivität (MPa) dauer
der Zellen
(Einheiten) (min)
Ergebnisse
3 4
2/35,5 2/30 spez. Gesamt- beibehal.
Aktivität aktivität Aktivität
(Einheiten/
g Protein) (Einheiten) (%)
3,2 χ 3,2 χ 10*
49, O ca. 35 39, 2 4, 3 X 10" 134 V
49, O ca. 30 48, 9 3, 6 X 106 113 *■*
iß
CO OO CD

Claims (13)

BLUMBACH · WESER · BERGEN · KRAMER PATENTANWÄLTE IN MÜNCHEN UND WIESBADEN Patentconsuit Radeckestraße 43 8000 München 60 Telefon (089)883603/883604 Telex 05-212313 Telegramme Patentconsult Patentconsult Sonnenberger Straße 43 6200 Wiesbaden Telefon (06121) 562943/561998 Telex 04-186237 Telegramme Patentconsult SUMITOMO CHEMICAL COMPANY, LIMITED 79/8731 15, Kitahama 5-chome, Higashi-ku, Osaka, Japan Verfahren zur Abtrennung von Glukoseisomerase Patentansprüche:
1. Verfahren zum Extrahieren von Glukoseisomerase aus diese enthaltenden Mikroorganismenzellen, dadurch gekennzeichnet« daß
zur Durchführung der Extraktion eine kontinuierliche Homogenisierung erfolgt, wozu man
(a) eine Suspension der Mikroorganismenzellen ansaugt;
(b) auf die Supension Druck ausübt;
München: R. (Cramer Dipl.-Ing. · W. Weser Dipl.-Phys. Dr. rer. nat. · H.P. Brehm Dipl.-Chem. Dr. phil. nat. Wiesbaden: P.G. Blumbech Dipl.-Ing. · P. Bergen Dipl.-Ing. Dr. jur. . G. Zwirner Dipl.-Ing. Dipl.-W.-Ing.
909848/0959
(c) den Druck plötzlich auf einen Wert unierhalb
98 066 Pa (1 at) absenkt, indem man die Suspension durch eine Öffnung führt;
(d) die Suspensionsteilchen auf Wände aufprallen läßt; und
(e) das homogenisierte Produkt abzieht;
wobei der Mikroorganismenzellen-Anteil der Suspension zwischen 0,5 und 10 Gew.-% der Trockensubstanz gehalten wird; und der Druck zwischen 39,2 und 68,6 MPa (400 bis 700 at) gehalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der Mikroorganismenzellen-Anteil der Suspension zwischen 1,5
und 6 Gew.-% der Trockensubstanz gehalten wird; und
der Druck zwischen 44,1 und 58,8 MPa (450 bis 600 at) gehalten
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß
die Suspension der Mikroorganismenzellen zusätzlich Magnesiumionen in einem Anteil von 1 χ 10"4M bis 5 x 10"-5M enthält.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß
der pH-Wert der Mikroorganismenzellen-Suspension im Bereich zwischen 6,0 und 10,0 gehalten wird.
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5. "Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
der pH-Wert im Bereich zwischen 7,0 und 9,0 gehalten wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 Ms 5, dadurch gekennzeichnet, daß
die Extraktion bei einer Temperatur im Bereich zwischen 10 und 60OG erfolgt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß
Mikroorganismen der Gattung Streptomyees verwendet werden.
8. Verfahren nach Anspruch J9 dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen
Streptomyces phaeochromogenes,
Streptomyces albus,
Streptomyces roseochromogenes,
Streptomyces wedmorensis,
Streptomyces flavorirens, oder
Streptomyces achromogenes verwendet werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß
als Mikroorganismen Streptomyces phaeochromogenes oder
Streptomyces albus verwendet werden.
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10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Druck auf die Suspension mittels einer Kolbenpumpe ausgeübt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Druckabfall auf einen Wert unterhalb 98 066 Pa innerhalb einer Zeitspanne von weniger als 10 us erfolgt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Suspensionsteilchen auf die Wände mit einer Geschwindigkeit von mehr als 15 km/min aufprallen.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Folge der Homogenisierungsschritte für die gleiche Suspension zweimal oder öfters wiederholt wird.
909848/0953
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