DE2820267A1 - Verfahren zur beschleunigung der geschwindigkeit der cellulosefermentation durch cellulose verdauende mikroorganismen - Google Patents

Verfahren zur beschleunigung der geschwindigkeit der cellulosefermentation durch cellulose verdauende mikroorganismen

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Description

Unsere Nr. 21 951 Ka/La
Chevron Research Company San Francisco, CaI., V.St.A.
Verfahren zur Beschleunigung der Geschwindigkeit der Cellulosefermentation durch Cellulose verdauende Mikroorganismen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beschleunigung der Geschwindigkeit der Celluloseverdauung durch Cellulose verdauende Mikroorganismen.
Der Effekt chemischer Zusätze bei Mikroorganismenfermentationen wurde intensiv studiert. Zum Beispiel wird von P.P. Williams et al, App. Microbiology, 11, 517 (1963) die Reaktion von Bakterien und Protozoen auf Insektizides Substrat, von J.J. O'Connor et al, J. Animal Sei., 33, (1971) der in vivo-Effekt von chemischen Zusätzen auf die Produktion von flüchtigen Fettsäuren durch Pansen-Mikroorganismen und von L.W.Varner et al, J. Animal Sei., 33, 1110 (1971) der Einfluß von Ammoniumsalzen auf die Pansenfermentation bei Ochsen und von T.W. Dowe et al, J. Animal Sei., 16, 93 (1957) der Effekt von mit Fungiziden (N-Trichlormethylthio-Δ -tetrahydrophthalimid) behandeltem Mais auf das Mästen von Ochsen beschrieben.
In der US-PS 2 553 778 werden parasitizide Perchlormethylessigsäureester beschrieben und die US-PSn 3 ^42 9^1» 3 595 915, 3 629 313 und 3 718 687 offenbaren pestizide Polyhalogenethylalkancarbonsäuren. Obgleich die Verbindungen dieser Druckschriften den erfindungsgemäßen Verbindungen strukturell verwandt sind, wurde gefunden, daß die Ver-
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_ ti _
bindungen dieser Druckschriften bei der Erhöhung der Geschwindigkeit der CelluloseVerdauung durch Mikroorganismen unwirksam sind.
Die erfindungsgemäßen, die Cellulosefermentation beschleunigenden Verbindungen sind 2-(Chlormethyldithio)essigsäure, 2-(Dichlormethyldithio)essigsäure und 2-(Trichlormethyldithio) essigsäure. Die bevorzugte Verbindung ist 2-(Trichlormethy ldithio) essigsäure.
Die Menge der Verbindung, die erfindungsgemäß angewandt wird, hängt zum Teil von der Art des Cellulosematerials
\n) ten;
und dem'besonderen angewandten Mikroorganismus/ab. Im allgemeinen sind Gewichtsverhältnisse der Verbindungen zu dem Cellulosematerial im Bereich von etwa 1:10 bis 1:1 000 wirksam, obgleich Gewichtsverhältnisse im Bereich von etwa 1:100 bis 1:10 000 bevorzugt werden.
Bei in vitro stattfindenden Cellulosefermentationsverfahren wird die Verbindung im allgemeinen direkt dem Fermentationsprozeß zugesetzt. Bei der in vivo-Celluloseverdauung kann die Verbindung oral dem Tier zusammen mit dem Cellulose- oder cellulosehaltigen! Futter verabreicht werden. Alternativ kann das Cellulose- oder cellulosehaltige Futter mit einer wirksamen Menge der Verbindung vor dem Verabreichen an das Tier vorbehandelt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist im allgemeinen auf in vivo- oder in vitro-Cellulosefermentation durch Mikroorganismen anwendbar. Beispiele für in vitro stattfindende Cellulosefermentation durch Mikroorganismen sind die aerobe und/oder anaerobe Zerstörung von Celluloseabfällen in Kläranlagen (sewage plants), die Umwandlung von Cellulose in Zucker durch Mikroorganismen,wie Trichoderma viride, die umwandlung
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von Cellulose in Monozellenproteine (single-cell proteins) durch Mikroorganismen, wie Bacteriodaceae, Cellulomonas sp. (ATCC Nr. 486 und 21681) und Alcaliginis sp. (ATCC Nr. 15173 und 17697) und der Bioabbau von Lignin-cellulosehalti@=m Pflanzenmaterial. Beispiele für in vivo-Permentation durch Mikroorganismen sind die Celluloseverdauung durch Pansen-Mikroorganismen von Wiederkäuern, Cecum-Mikroorganismen von tierischen Eingeweiden und anderen.cellolytischen.Organismen in den Verdauungstrakten von Pflanzenfressern.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird geeigneterweise für alle Arten von Cellulose oder cellulosehaltigem Material, wie Papier, kommunalen Abfällen und Pflanzenprodukten, z.B. Holz, Baumwolle, Stroh, Zuckerrohrrückstände, Reishülsen, usw.angewandt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Erhöhung der Verdauungsgeschwindigkeit von Cellulose durch Pansen-Mikroorganismen und zur Erhöhung der Fermentationsgeschwindigkeit von Cellulose-Abfallprodukten durch Abwasser-Mikroorganismen nützlich. Mikroorganismen, die gewöhnlich im Klärschlamm von Kläranlagen vorliegen, umfassen.anaerobe und aerobe Bakterien, wie Escherichia coli (ATCC Nr. 133 und 435O), Lactobacillus fermentans (ATCC Nr. 14931),Alcaligenes viscosus, Pseudomonas fluoresceus, Aziobachus chroococcum (ATCC Nr. 9043), Salmonella (ATCC Nr. IOO718) und Streptococcus (ATCC Nr. 4782).
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 1 Baumwollverdauung durch Bacteroides succinogenes
Der Mikroorganismus Bacteroides succinogenes wurde von der ATCC,No. I9169, erhalten.
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Nährstoffquelle:
Bacto-fluid-Thioglycolat
(29 g Pormulierung/Liter HpO)
Bacto-Casitone (pankreat.Digest von Casein) 15,0 g Bacto-Hefe-Extrakt (wasserlösl. Teil von
autolys. frischer Hefe) 5,0 g
Bacto-Dextrose (Dextrose) 5,0 g
NaCl 2,5 g
1-Cystin, Difco 0,5 g
Thioglycolsäure 0,3 ml
Bacto-AgarOlgar-Agar) 0,75 g
Resazurin , geprüft (certified) 0,001 g
+) 7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-on-10-oxid
Die Geschwindigkeit der Baumwollverdauung in Gegenwart von verschiedenen Testverbindungen in der vorstehend genannten Nährstoffbrühe mit Bacteroides succinogenes wurde nach dem folgenden Verfahren bestimmt:
100 mg Baumwolle wurden in mit Schraubverschluß versehene Röhrchen gebracht. In diese Teströhrchen wurde 1 /ig der Testverbindung und 20 ml der Nährstoffquelle gebracht, um das Röhrchen vollständig zu füllen.
Die Röhrchen wurden anschließend sterilisiert, gekühlt und mit dem Mikroorganismus (eine Schlaufe der Inokulationsnadel) inokuliert, ihre Verschlüsse wurden verschlossen und anschließend wurde in einem Wasserbad bei etwa 400C inkubiert. Die Röhrchen wurden während der Inkubation gerührt und die Verschlüsse wurden in den ersten 18 Stunden alle 2 Stunden und anschließend alle 6 Stunden gelockert, um die durch die Fermentation gebildeten Gase austreten zu lassen. Nach 70-stündiger Inkubation hatten die meisten der Fermentationsverfahren nachgelassen, wie durch Aufhören der Gasakkumulation festgestellt wurde.
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Nach verschiedenen InkubationsPerioden wurden die Röhrchen auf vorher gewogenes Filterpapier ausgeleert. Das Filterpapier wurde mehrfach gewaschen und auf ein konstantes Gewicht getrocknet. Das Gewicht der nichtverdauten Baumwolle wurde durch Differenz bestimmt. Die Ergebnisse der Celluloseverdauung sind in der Tabelle I zusammengestellt. Die Ergebnisse basieren auf durchschnittlich 48 Versuchen und die Analyse betreffend die mittlere quadratische Abweichung (standard deviation analysis) zeigte, daß die Ergebnisse für 1 % Level significant sind.
Tabelle I
Testverbindung Baumwoll- Beschleunigung
verdauung
Kontrolle 38,6
Z-(Trichlormethyldithio)essig-
säure 43,6 13
2-(1,1,2,2-Tetrachlorethyldi-
thio)essigsäure 38,0 O
Beispiel 2 Baumwollverdauung durch Bacteroides succinogenes
Die Geschwindigkeit der Baumwollverdauung mit Bacteroides succinogenes in Gegenwart von verschiedenen Testverbindungen wurde durch ein Verfahren bestimmt, das mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren identisch war. Die Testverbindungen und die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.
Tabelle II
Testverbindung Baumwoll- Beschleunigung
verdauung : %
Kontrolle 37,1
2-(Trichlormethyldithio)-methyl-
acetat 36,2 0
2-(1,1,2,2-Tetrachlorethyldi-
thio)-methylacetat 36,7 O
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Beispiel 3 Pflanzencelluloseverdauung durch Bacteroides succinogenes
Lignin-Celluloseraaterial von Krautpflanzenfutter wurde durch Bacteroides succinogenes in einem gereinigten Medium in Gegenwart von 2-(Trichlormethyldithio)essigsäure in einer Konzentration von 10 yug/ml nach einem Verfahren verdaut, das mit dem in Beispiel 1 beschriebenen identisch war. Nach 70-stündiger Inkubation betrug die prozentuale Baumwollverdauung 5*1,3 %. In einem unbehandeltem Kontrollversuch betrug die prozentuale Baumwollverdauung 41,1 %.
Dieses Beispiel veranschaulicht die in vitro-Trennung von Cellulose von Lignin-Cellulosematerial durch biologischen Abbau der Cellulose.
Beispiel h Baumwollverdauung; durch Rumiococcus albus
Ruminococcus albus wurde von der ATCC (America Type Culture
Collection) erhalten. Er wurde an Pseudomonas medium, das die folgenden Bestandteile (pro 1 destilliertes Wasser) ent hielt:
Nitrilotriessigsäure 1,91 g
K2HPO4 8,71 g
Na2SO4 0,57 g
MgSO4 0,25 g
PeSO4 0,5 mg
Ca(NO3)2 0,5 mg
Agar 1 g
gezüchtet.
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Etwa 20 ml des Mediums und 0,1 g Baumwolle wurden in jedes von 48 mit Schraubverschluß versehenen Röhrchen gebracht und sterilisiert. Die Röhrchen wurden anschließend mit einer Schlaufe (loopful) des Mikroorganismus inokuliert. Die Hälfte der Röhrchen wurde mit ausreichend 2-(Trichlormethyldithio) essigsäure versetzt, um eine Konzentration von 10 ;ug/ml zu erzielen. Die Röhrchen wurden anschließend verschlossen und in einem Wasserbad bei 40°C 70 Stunden inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurde das Gewicht der nicht verdauten Baumwolle bestimmt.
Die behandleten Röhrchen (durchschnittlich 2k) ergaben 29,8 %-ige Baumwollverdauung, die Kontrollröhrchen (durchschnittlich 2k) ergaben 23»2 %lge Verdauung zur Kontrolle.
Beispiel 5
Baumwollverdauung durch Bacteroides succinogenes in Pansenflüssigkeit (rumen fluid)
Die Geschwindigkeit der Baumwo11verdauung in Gegenwart von 2-(Trichlormethyldithio)essigsäure in sterilisierter Pansenflüssigkeit in Bacteroides succinogenes wurde durch ein Verfahren bestimmt, das mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren identisch war. Nach 70-stündiger Inkubation betrug die prozentuale Baumwollverdauung k6,6 %. Bei einer unbehandelten Kontrollprobe betrug die Baumwollverdauung 39,8 %.
Beispiel 6 Verdauung von Solka Floc in Pansenflüssigkeit
Der Effekt von 2-(Trichlormethyldithio)-essigsäure auf die in vitro-Verdaubarkeit von Soka Floc, d.h. pulverförmigen Cellulose-
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-IG-
produkten, die durch mechanische Zerkleinerung von gereinigter Holzpulpe erhalten wurden., wurde unter Verwendung einer Modifikation des 2-Stufen-Verdauungsverfahrens (Tilley und Terry, J. Brit. Glassl. Sc, 18:104-111, I963) bestimmt. Das Substrat (dreifache Ausfertigung), wurde mit entweder 0, 40, 60, 80, 100 oder 150 ppm der Testverbindung behandelt und 24 Stunden mit gepufferter Pansenflüssigkeit inkubiert und anschließend 24-stündiger Pepsinverdauung unterworfen. Die in vitro-Verdaubarkeit wurde am Ende der Inkubation mit gepufferter Pansenflüssigkeit (ruminale Verdauung) und am Ende der Pepsinverdauung (Gesamtverdauung) gemessen.
Die Pansenflüssigkeit wurde vom Spendetier erhalten, das bei Alfalfa-Heu-Getreide-Mineral-Zusatzernährung bei Aufrechterhaltung zusätzlich zugeführter Menge (plus level of intake) gehalten wurde. Die Testverbindung wurde dem Solka-Floc auf Trockenmaterialbasis zugesetzt.
Tabelle III Konzentration der $. ruminale % Gesamtver-
1 9 2
Testverbindung Verdaub arkeit daub arkeit
0 ppm 10,34 26,50
40 ppm 13,96 (35,01) 29,53 (11,43)
60 ppm 12,73 (23,11) 30,00 (13,21)
80 ppm 13,18 (27,47) 29,93 (12,94)
100 ppm 12,91 (24,85) 29,l6 (10,04)
150 ppm 11,96 (15,67) 28,26 ( 6,64)
Die in Klammern angegebenen Werte stellen die prozentuale Erhöhung dar.
Die Testverbindung wurde dem Substrat auf Trockenmaterialbasis zugesetzt.
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Beispiel 7 Baumwollverdauung durch Abwasserbakterien
Die Geschwindigkeit der Baumwol!verdauung in Gegenwart von 2-(Trichlormethyldithio)essigsäure in einer Bacto-Fluid-Dithioglycolat-Nährstoffbrühe durch anaerobe Abwasserbakterien wurde nach dem folgenden Verfahren bestimmt.
Eine Nährstoffbrühe wurde durch Rekonstitution einesflüssigen Thioglycolat-Gemisches ( die gleiche Zusammensetzung wie das in Beispiel 1 beschriebene Gemisch) mit überstehendem Wasser, das aus einem Gemisch von destilliertem Wasser (70 %) und rohem Abwasser (30 %), das von einem Schlammzersetzungstank einer kommerziellen Kläranlage entnommen wurde, erhalten wurde, hergestellt. 20 ml der Nährstoff lösung, die 10 ,ug der Testverbindung und 100 mg Baumwolle enthielt, wurde in mit Schraubverschluß versehene Röhrchen (24 Wiederholungen) gebracht. Die Röhrchen wurden mit Abwasserbakterien durch Zusetzen von 0,5 ml rohem Klärschlamm aus der Kläranlage zu dem Röhrchen inokuliert.
Die Röhrchen wurden verschlossen und in einen Schüttler gebracht, wobei ein Wasserbad, das bei 35 C gehalten wurde, angewandt wurde. In den ersten 6 Stunden der Inkubation wurden die Verschlüsse alle 2 Stunden und danach periodisch in etwa 6-stündigen Intervallen zur Freisetzung der akkumulierten Fermentationsgase gelockert.
Nach 48-stündiger Inkubation wurden die Röhrchen auf vorher gewogenes Filterpapier entleert. Das Filterpapier wurde mehrfach gewaschen und auf Gewichtskonstanz getrocknet. Das Gewicht der nichtverdauten Baumwolle wurde durch Differenz bestimmt.
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Der Versuch (mit 24 Röhrchen) wurde mit 6 verschiedenen Proben von Abwasserbakterien, die alle 2 Wochen aus der Kläranlage erhalten wurden, durchgeführt. Die Ergebnisse der 6 Versuche ist in Tabelle IV zusammengestellt. Die Fermentationsgeschwindigkeit wurde in Gegenwart der Testverbindung um durchschnittlich 6 O ? erhöht.
Tabelle IV Cellulosefermentation durch Abwasserbakterien
Konzentration der Versuch Nr. Testverbi ndung
12 3^56 Durchschnitt
50,5% 53,Οί 49,5% 52,0? 52,8? 50,2* 51,1* 82,7% 82,7? 79,8* 81,3? 82,5? 84,0? 82,2?
Für: Chevron Research Company
San Francisco, Ca., V.St.A,
Dr.H.J.Wolff Rechtsanwalt
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Claims (10)

BEIL, WOLFF Ä 5EJL 05. Mai 1S78 RECHTSANWÄLTE ADELONSTRASSE 58 2820267 FRANKFURT AM MAIN 80 Patentansprüche:
1. Verfahren zur Beschleunigung der Geschwindigkeit der Cellulosefermentation durch Cellulose verdauende Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation in Gegenwart einer die Geschwindigkeit beschleunigenden Menge von 2-(Chlormethyldithio)essigsäure, 2-(Dichlormethyldithio)essigsäure oder 2-(Triehlormethyldithio)essigsäure durchführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation in vitro durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Cellulose cellulosehaltig Abfallprodukte verwendet .
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Abwasserbakterien verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als die Fermentation beschleunigende Verbindung 2-(Trichlormethyldithio)essigsäure verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Cellulose cellulosehaltiges Tierfutter verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Pansenbakterien verwendet.
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8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung zur Celluloseverdauung in dem Pansen der Lebewesen oral an Wiederkäuer verabreicht.
9. 2-(Chlormethyldithio)-essigsäure, 2-(Dichloraethyldithio)· essigsäure oder 2-(Trichlormethyldithio)-essigsäure.
10. 2-(Trichlormethyldithio)-essigsäure, als Verbindung nach Anspruch 9.
S0 98^7/0799
DE19782820267 1977-05-11 1978-05-10 Verfahren zur beschleunigung der geschwindigkeit der cellulosefermentation durch cellulose verdauende mikroorganismen Withdrawn DE2820267A1 (de)

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