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Verfahren zur Synthese von biologischen Peptid-
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wirkstoffen Vorliegendes Verfahren dient der Synthese von Peptidwirkstoffen,
wie z.B. niedermolekularen Regulationsstoffen des Synthesestoffwechsels in Form
von Inhibitoren, Repressoren oder Stimulatoren, wie auch von hormonähnlichen Stoffen.
Dabei ist eine Aufklärung der chemischen Struktur des Moleküls nicht erforderlich.
Vielmehr werden nach bekannten Verfahren isolierte Moleküle als Muster für die Gewinnung
von Stoffen mit ähnlichen biologischen Eigenschaften verwendet, vergleichsweise
wie bei den Isoenzymen, bei denen die Wirkgruppe, weniger aber die Gesamtstruktur
des Moleküls für die bestimmte Wirkung verantwortlich ist. Der Nachweis der biologischen
Wirkung erfolgt durch Bioassay; die Erzeugung dieser funktionell ähnlichen Stoffe
durch bekannte immunbiologische Methoden, die hier in besonderer Verfahrensweise
und Reihenfolge verwendet werden. Es werden dabei die isolierten Peptidwirkstoffe
als Antigen verwendet zur Gewinnung eines primären Antikörpers mit einem antikörpererzeugenden
Organismus (vgl. Hans Schmidt: Die Grundlagen der spezifischen Therapie: Immunisierung
der Tiere, Bruno Schulz Verlag, Berlin 1940) oder aber in einem in vitro System
zur Erzeugung von Antikörpern in Lymphozyten oder Hybridzellen-Kulturen (vgl. A.
Bussard: Cellular hybridisation in immunology: Vortrag beim 4. Europäischen Immunologie-Meeting,
Budapest 12. - 14.4.1978). Die in vitro Gewinnung von Antikörpern hat den Vorteil,
daß hier nur sehr geringe Antigenmengen erforderlich sind und das Antikörperspektrum
durch klonale Antikörpersynthese eingeschränkt wird. Falls die Peptidwirkstoffe
nicht ausreichend immunogen sind, kann ihre Spezifität
durch bekannte
Verfahren der Komplettierung durch Konjugation mit einem Carrier oder durch Verwendung
von Adjuvantien verstärkt werden (vgl. C. Steffen: Allgemeine und experimentelle
Immunologie und Immunpathologie: Georg Thieme Verlag: Herstellung konjugierter Antigene
S. 560). Zur Reinigung und Isolierung der so gewonnenen Immunglobuline können die
Verfahren, die ebenfalls in C. Steffen S. 562 u.f. angegeben sind, verwendet werden.
Auch lassen sich daraus Antikörperfragmente, wie leichte und schwere Ketten und
das Fab-Fragment, wie auch monovalente Antikörper gewinnen (vgl. C. Steffen: S.
571 u.f.), die den Ausgangsstoff spezifisch blockieren und für solche Zwecke unmittelbar
eingesetzt werden können, d.h. also die Aufhebung einer Inhibition oder Repression
wie auch andererseits des stimulierenden Effekts.
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Die Isolierung des ursprünglichen Peptidwirkstoffes zur Gewinnung
solcher Immunglobuline kann nach bekannten Methoden erfolgen, wie sie K. Letnansky
verwendet hat (Charakterisier!in eines tumorspezifischen Inhibitors aus dem mütterlichen
Anteil der Rinderplazenta: Österreichische Zeitschrift f. Onkologie Vol. 4 Nr. 2
- 3 S. 42-45, 1977; vgl. auch Einheitsprüfung für Antigene bei C. Steffen S. 594).
Die antideterminanten Gruppen bzw. die Antikörperfragmente werden nun selbst als
Immunogen zur Bildung eines zweiten Antikörpers entweder in vivo oder auch in vitro
nach entsprechenden Verfahren wie bei der Gewinnung des ersten Antikörpers verwendet.
Dieser Anti-Isotyp-Antikörper, und besonders seine determinante reaktive Gruppe
in Form von leichten und schweren Ketten oder dem Fab-Fragment haben dieselbe biologische
Wirkung, wie der primär als Antigen verwendete Peptidwirkstoff.
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Dies läßt sich ebenfalls durch Bioassay testen. Die Synthese dieses
Anti-Isotyp-Antikörpers kann in vitro kontinuierlich in Hybridzellen aus einem Plasmocytom
und Lymphozyten erfolgen, wobei die Immunglobuline aus dem Medium der Zellkultur
abgeschöpft werden und dieses Medium erneuert wird. Die Isolierung dieses zweiten
Antikörpers und die Gewinnung der antideterminanten Gruppe erfolgt nach den oben
beschriebenen, bei Steffen angegebenen, Verfahren. Es ist auch möglich, die Syntheseinformation
für
diesen Anti-Isotyp-Antikörper in vitro analog dem Verfahren von D. Jachertz (Flow
of information and gene activation during antibody synthesis. Ann. N.Y. Acad. Sci.
207 (1973) 122 - 144) als informative RNS zu gewinnen und diese zur spezifischen
Sensibilisierung von Antikörper-produzierenden Individuen zu verwenden. Der Vorteil
dieser Methode liegt in der Wirksamkeit geringster Mengen dieser informativen RNA.
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Auch kann diese informative RNA direkt therapeutisch verwendet werden
zur Behandlung von Krankheiten, bei denen eine Insuffizienz in der Synthese der
biologischen Peptidwirkstoffe besteht. Es besteht die Möglichkeit, daß bei genetischen
Defekten über eine reverse Transkriptase diese Syntheseinformation auch in somatische
Zellen aufgenommen werden kann, so daß dadurch der Defekt überbrückt wird.
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1. Beispiel Synthese von Tumorhemmstoffen, die aus dem maternen Anteil
der Rinderplazenta durch Fraktionierung gewonnen wurden (vgl. K. Letnansky: Österreichische
Zeitschrift f. Onkologie (1977) S. 42 - 45) und die nur in sehr geringen Mengen
aus dem Gewebe isoliert werden können, so daß die Aufklärung der chemischen Struktur
und deren Synthese auf Schwierigkeiten stößt. Es wird dabei die durch Bioassay getestete
biologische Fraktion mit dem niedrigsten Molekulargewicht als Immunogen zur Sensibilisierung
Antikörper-erzeugender Tiere, z.B. Kaninchen, Schafe, Hühner u.a. verwendet und
falls das Antigen nicht in ausreichender Menge zur aktiven Immunisierung mit Boosterung
zur Verfügung steht, als Immunogen zur Sensibilisierung von Lymphozyten-Zellkulturen
bzw. Hybrid-Zellkulturen.
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Der entstehende Antikörper wird durch Bioassay auf seine Fähigkeit
zur Blockierung der biologischen Wirkung des ursprünglichen Antigens bzw. des Peptid-Haptens,
das zum Vollantigen komplettiert wurde, getestet. Durch Absorption und Absättigungsmethoden
wird der spezifische Antikörper rein gewonnen und seine antideterminante
Gruppe
in Form von Antikörperfragmenten isoliert und als Antigen verwendet. In vitro können
iRNA mit der Syntheseinformation gegen diese Isotyp-Gruppe gewonnen werden.
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Diese lassen sich direkt therapeutisch verwenden, ebenso aber auch
zur Sensibilisierung von Antikörper-spendenden Individuen zur Erzeugung eines Anti-Isotyp-Antikörpers.
Die Antikörpersynthese kann ebenfalls in vitro erfolgen, insbesondere auch in Hybridzellen
z.B. aus Plasmocytom-Zellen und Lymphozyten.
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Der gebildete Anti-Isotyp-Antikörper wird durch Adsorption bzw. Absättigung
nach bekannten Verfahren isoliert und seine antideterminante Gruppe bzw. die entsprechenden
Antikörperfragmente, die diese enthalten, gewonnen. Die biologische Wirkung des
zweiten Antikörpers bzw. der daraus gewonnenen Antikörperbruchstücke werden durch
Bioassay in gleicher Weise wie ursprünglich der Peptidwirkstoff getestet. Die biologischen
Wirkungen müssen mit diesem übereinstimmen, jedoch nicht die chemische Struktur.
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2. Beispiel Es sollen biologische Regulationsstoffe mit analoger
Wirkung wie Interferon, Chalone, Wachstumsfaktoren, Wuchsstoffe wie auch Releasing
und andere Peptidhormone gewonnen werden. Das praktische Vorgehen entspricht jeweils
dem Beispiel 1.