DE3501705A1

DE3501705A1 - Verfahren zur herstellung von kuenstlichen, biomimetischen haptenen bzw. antigenen

Info

Publication number: DE3501705A1
Application number: DE19853501705
Authority: DE
Inventors: Karl Prof Dr Med Theurer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1985-01-19
Filing date: 1985-01-19
Publication date: 1986-07-24
Also published as: DE3613848A1

Description

Verfahren zur Herstellung künstlichen biomimetischen
Haptenen bzw. Antigenen als Zusatz zu P 3437757.3 Beschreibung: Das Verfahren ist ein Zusatz zum Verfahren von P 3437757.3 zur Herstellung von künstlichen biomimetischen Haptenen bzw. Antigenen, welche die Wirkung der natürlichen Moleküle imitieren. Es werden dabei biomimetisch wirkende antideterminante Bezirke von Anti-Idiotyp-Antikörpern gegen Flaptene bzw. Antigene nach konventionellen Verfahren in vivo oder in vitro aus Zellkulturen gewonnen. Bezüglich der Ausgangsstoffe, den Ideotypen, gibt es jeweils ein ganzes Spektrum verschiedener Anti-Antikörper mit biomimetischer Wirkung des Ausgangsstoffes.
Das vorliegende Verfahren führt zu einer Verbesserung und Verstärkung dieser biomimetischen Effektivität durch die chemische Konjugation von mindestens zwei Faktoren der verschiedenen Einzelkomponenten. Die Wirksamkeit wird auch verstärkt durch die Konjugation mit Träger-Stoffen. Diese können Proteine, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate oder Lipide sein (vgl. P 3417022.7-44 Träger- und Begleitstoffe für biologische Wirk- und Regulationsfaktoren aus Zellen und Geweben und deren Anwendung). Die Priorität dieses Verfahrens wird mitbeansprucht. Es werden dabei hoch- und makromolekulare Bestandteile aus biologischen Zellen (t-likroorganismen und/oder tierischen oder pflanzlichen Geweben) sowie Blut, insbesondere nichtlösliche Rückstände aus Extrakten durch chemische und/ oder enzymatische Spaltung in Polypeptide, Peptide und Nukleotide mit einem Molekulargewicht von 500 bis 50.000 Dalton fragmentiert, und diese einzeln nach Stoffgrup»en oder als Mischung, je nach Indikation mit biologischen Wirkstof£en, insbesondere Regulationsfaktoren aus Zellen und Geweben, wie auch anderen Pharmaka, einzeln oder in Kombination konjugiert.
Vorliegendes Verfahren kann also allgemein zur Gewinnung von biologischen bzw. therapeutischen biomimetischen Wirkstoffen, welche die Wirkung von natürlichen Stoffen imitieren, versçendet werden.
Es lassen sich alle geeigneten und bekannten Verfahren der chemischen Konjugation von Peptiden und Proteinen, wie auch die Konjugation derselben mit Nukleinsäuren, Kohlenhydraten und Lipiden sowie deren Untereinheiten bzw. Bestandteilen anwenden. Dabei sollte die Stereospezifität des Konjugats dem Idiotyp-Molekül entsprechen, sodaß eine Bindung mit dem jeweiligen natürlichen Rezeptor-Q4olekül möglich ist. Das Verfahren eignet sich deshalb für die Partialsynthese von Molekülen mit bestimmten biologischen Wirkungen und zur Synthese von Arzneimitteln. Die biologisch aktiven Bezirke, insbesondere der Anti-Idiotyp-Antikörperfragmente müssen deshalb nach außen gerichtet sein.
Die chemische Konjugation der Anti-Idiotyp-Antikörperfragmente kann nach verschiedenen, bereits bekannten Verfahren erfolgen analog der Herstellung von künstlich zusammengesetzten Antigenen, Proteinen oder Proteiden. so z.B. durch Kupplung als Diazonium-Verbindung, die Behandlung mit Zyanaten, die Umsetzung mit Carbobenzoxy-Verbindungen, das Curtius'sche Azid-Verfahren, das Oxazolon-Verfahren, die Konjugation mit Polysacchariden nach W.J.T. blorgan, Verbindunglnitcarbohydraten, Pyridin-Eilfeiß-Verbindungen, Verbindungen von Sulfhydril-Grusnen zu Disulfid-Brücken u.a. (vgl. A. Schmidt: Fortschritte der Serologie, S. 67 u.f., Verlag Dietrich Steinkopf, Darmstadt, 1955; Helmut Friemel: Immunologische Arbeitsmethoden, S. 480 u.f., Gustav Fischer Verlag, 1984).
Die Anwendung der Konjugate erfolgt für diagnostische wie auch therapeutische Zwecke in Human- und Veterinärmedizin, wie auch zur Beeinflussung von Zellkulturen, Mikroorganismen und Pflanzen.
Der Nachweis der erfolgten Konjugation der Ausgangsstoffe wird durch bekannte chemisch-physikalische Vergleichsuntersuchungen geführt, wie z.B. die Bestimmung der Molekularaewichte, chromatographische und elektrophoretische Anftrennungen, insbesondere durch Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie u.a. Der Nachweis der Wirkung erfolgt durch Bioassay in vitro an Zell-und Gewebekulturen, an zellfreien Synthesesystemen oder pharmakologisch im Tierversuch.
Beispiel 1 Es werden nach DP 3119110 und P 3437757.3 nach konventionellen Dlethoden oder aus in vitro-Zellkulturen, aus Lymphozyten oder Hybridom-Zellen Anti- Idiotyp-Antikörper gewonnen (vgl.: Herwart Ambrosius: Antiserumgewinnung aus Tieren, S. 25 und S. Wichner: Antikörperbildung in der Zellkultur, S. 48 - in H. Friemel: Immunologische Arbeitsmethoden: Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1984)). Von den Anti-Idiotyp-Antikörpern werden die antideterminanten Fragmente enzymatisch abgespalten und chromatographisch isoliert. Bei Verwendung eines Proteins oder Proteids als Ausgangsstoff (Ideotyp-Molekül) z.B. einem bestimmten Enzym wie der GPT (Glutamat-Pyruvat-Transaminase) entstehen mehr als 10 verschiedene primäre Ideotyp-Antikörper gegenüber den verschiedenen Oberflächenbezirken des Moleküls. Von diesen Antikörpern werden die N-terminalen Bezirke bzw. antideterminanten Gruppen als Antigen für die Erzeugung von entsprechenden Anti-Ideotyp-Antikörpern verwendet. Die Gewinnung derselben erfolgt möglichst in einem autologen System bezüglich der primären Antiksrner, weil dort der Toleranzbruch gegenüber den varibalen Bezirken des primären Antikörpers und die Entstehung von Anti-Antikörpern mit Ideotyp-Eigenschaften gegenüber einem Toleranz bruch bezüglich der konstanten Bezirke, der nicht die funktionellen Gruppen betreffen würde, erleichtert ist. Von den isolierten antideterminanten, N-terminalen Bezirke der Anti-Ideotyp-Antikörper werden nun mindestens 2 loleküle miteinander konjugiert.
Wenn die Fragmentierung z.B. für die leichten und schweren Ketten der Antikörper durch Aufsnaltung mit Mercaptoäthanol an den Disulfidbrucken erfolgt und eine Rekombination bzw. Reagcr,reation durch bekannte Methoden verhindert wird, können die isolierten Fragmente durch Bindung der freien SH-Grunpen konjugiert werden.Ohne Bindeglied lassen sich auch Konjugate aus Polysacchariden gewinnen, die mit einer begrenzten Anzahl von Fettsäureresten substituiert sind. Diese adsorbieren sich direkt an den Proteinen bzw. Peptiden (Hämmerling, U., O. Westphal: Europ. J. Biochem. 1, 46 (1967) ).
Bei den Mtikörperfragmenten kann auch die Tannin-Methode angewandt werden (Borduas, A., P. Grabar: Ann. Inst. Pasteur 84, 903 (1953); Stravitsky, A.: J. Immunol. 72, 360 (1954); Roitt, I. und Doniach, D.: IiHO-Book of immunologic techniques S. 20: World Health Organisation, Genf (1966) ).
Auch die Benzidin-Methode ist dazu geeignet (Gordon, J.; B. Rose, A. Sekon: J. exp. Med. 108, 37 (1958); Roberts, I., D. Doniach: TflHO-Book of immunologic techniques S. 1: World Health Oranisation, Genf (1966); Stavitsky, A., E. Arquilla: J. Immunol. 74, 306 (1955; Timpe, R., H.Furthmayr, I. Wolff: Int. Arch. Ailergy 32, 318 (1967) ).
Von J. Brock wurde die Konjugation durch Nitrobenzolsulfonat publiziert (vgl. Präparation von konjugierten Antigenen S. 481 in H. Friemel: Immunologische Arbeitsmethoden: Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1984) ). Nach Beendigung der Reaktion wird das DNP-Produkt durch Gel-Chromatographie an Sephadex gereinigt.
Die Konjugate werden als biomimetische Moleküle zur Imitation und Auslösung von Enzymreaktionen verwendet.
Beispiel 2 Es werden nach den benannten Methoden Konjugate aus einem Gemisch von antideterminanten Bezirken von Anti-Ideotyp-Antikörpern bezüglich dem somatotropen Hormon (Wachstumshormon) gewonnen.
Beispiel 3 Es werden Konjugate aus Anti-Ideotyp-Antikörperfragmenten mit der Wirkung des Enzyms Arginase hergestellt. Dazu werden als urspezifische Trägersubstanz das Kohlenhydrat Dextran mit einem Mol.gewicht kleiner als 10.000 verwendet.
In gleicher Weise können auch Sephadex-Ionenaustauscher für die Konjugation verwendet werden.
Beispiel 4 Zur Konjugation kommen Anti- Ideotyp-Antikörperfragmente mit Nukleotiden oder Desoxinukleotiden, gegebenenfalls in Kombination mit Kohlenhydraten und/oder Lipiden.
Beispiel 5 Zur Konjugation kommen Anti-Ideotyp-Antikörperfragmente mit Lipiden und Peptiden als Fragmenten von Organextrakten mit einem Mol.gewicht von 3.000 Dalten, die nach P 3417022.7-44 gewonnen wurden.

Claims

Verfahren zur Herstellung von künstlichen biomimetischen Haptenen bzw. Antigenen als Zusatz zu P 34ob757.3 Patenanspriche: 1. Verfahren zur Herstellung von künstlichen biomimetisch wirkenden Haptenen bzw. Antigenen als Zusatz zu P 3437757.3, wobei Haptene und Antigene, insbesondere Toxine, die nach Schädigung mit ionisierenden Strahlen und nach Verbrennungen entstehen, sowie Tumormarker als Ausganasstoffe für die Gewinnung von Anti-Idiotyp-Antikörper dienen, von denen man die antideterminante reaktive Bezirke durch Fragmentierun; gewinnt, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei Bestandteile des Spektrums der verschiedenen Anti-Idiotyp-AntikörDerfragmente welche die biologischen Wirkungen eines Ausgangsstoffes limitieren, gegebenenfalls zusammen mit biologischen Trägerstoffen, chemisch-kovalent konjugiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch aekennzeichnet, daÇ allgemein Ersatz stoffe für Proteine mit biologischen Wirkunden, insbesondere Enzyme, Hormone und Mediatoren des Zellstoffwechsels synthetisiert werden.