DE2809257A1 - Verfahren zur bestimmung von zellen im blut - Google Patents
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Description
TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, N. Y., VStA
Verfahren zur Bestimmung von Zellen im Blut
Die Erfindung betrifft die kolorimetrische Bestimmung des Volumens an Erythrocyten in einer Blutprobe und
stellt insbesondere eine Verbesserung einer wohlbekannten Methode für eine derartige Bestimmung dar, die auf der
Verwendung eines Farbstoffes beruht, der nach seinem Zusatz zu einer Blutprobe von dem Zellenanteil nicht aufgenommen wird, sondern den Plasmaanteil färbt. Je größer die Farbdichte des Plasmaanteils in der Probe nach dem Zentrifugieren ist, um so größer ist der Volumenanteil der Zellen in der Probe, wie von Eric Ponder, Hemolysis and Related Phenomena, Grüne & Stratton, New York 1948, Seiten 51-33 beschrieben. Die von Ponder beschriebene kolorimetrische Methode besteht aus der Zugabe eines bestimmten Volumens eines Farbstoffes von bekannter Konzentration zu einem bekannten Volumen einer Blutprobe von unbekanntem Zellvolumen. Bei der Methode wird der flüssige oder Plasmaanteil von den Zellen durch Zentrifugieren der Probe abgetrennt, und die Farbstoffkonzentration im Plasma wird kolorimetrisch bestimmt. Wenn die Endkonzentration des Farbstoffs in dem Plasma sowie die Anfangskonzentration des Farbstoffes und die Volumina der Probe und des Farbstoffes feststehen, läßt sich das Volumen der Erythrocyten berechnen. Ein bedeutender Vorteil, der durch die vorliegende Erfindung erzielt wird, besteht darin, daß die Zentrifugierung der Probe vermieden werden kann.
Verwendung eines Farbstoffes beruht, der nach seinem Zusatz zu einer Blutprobe von dem Zellenanteil nicht aufgenommen wird, sondern den Plasmaanteil färbt. Je größer die Farbdichte des Plasmaanteils in der Probe nach dem Zentrifugieren ist, um so größer ist der Volumenanteil der Zellen in der Probe, wie von Eric Ponder, Hemolysis and Related Phenomena, Grüne & Stratton, New York 1948, Seiten 51-33 beschrieben. Die von Ponder beschriebene kolorimetrische Methode besteht aus der Zugabe eines bestimmten Volumens eines Farbstoffes von bekannter Konzentration zu einem bekannten Volumen einer Blutprobe von unbekanntem Zellvolumen. Bei der Methode wird der flüssige oder Plasmaanteil von den Zellen durch Zentrifugieren der Probe abgetrennt, und die Farbstoffkonzentration im Plasma wird kolorimetrisch bestimmt. Wenn die Endkonzentration des Farbstoffs in dem Plasma sowie die Anfangskonzentration des Farbstoffes und die Volumina der Probe und des Farbstoffes feststehen, läßt sich das Volumen der Erythrocyten berechnen. Ein bedeutender Vorteil, der durch die vorliegende Erfindung erzielt wird, besteht darin, daß die Zentrifugierung der Probe vermieden werden kann.
Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung einer verbesserten kolorimetrisehen Methode zur Bestimmung des
Volumens von Erythrocyten in einer Blutprobe unter Verwendung eines Farbstoffes und insbesondere die Schaffung einer
Methode der genannten Art, die sich auf die Flüssigkeitsprobenanalyse
vom kontinuierlichen Durchflußtyp anwenden läßt.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung eines Volumens an Erythrocyten in einer Blutprobe,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein bestimmtes Volumen der Blutprobe in einer Leitung entlangströmen läßt,
ein bekanntes Volumen eines Agglutinierungsmittels sowie ein bestimmtes Volumen eines Farbstoffes in die Leitung
einleitet, wobei der Farbstoff bei seiner Einführung in bekannter Konzentration vorliegt, die genannten Substanzen
zur Agglutinierung der Erythrocyten vermischt und die Konzentration des Farbstoffes in dem die Leitung entlangfließenden
Plasma kolorimetrisch mißt.
In einer bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die agglutinierten Erythrocyten
aus der Leitung durch Dekantieren entfernt. Das Agglutinierungsmittel besitzt vorzugsweise eine verhältnismäßig
hohe positive elektrische Ladung, und der Farbstoff ist vorzugsweise wasserlöslich, dringt nicht in die Zellen
ein und bildet mit dem Agglutinierungsmittel oder mit löslichen Bestandteilen der Probe keinen Niederschlag. Ferner
löst er die Zellen nicht auf und ändert auch nicht ihr Volumen.
Die Erfindung wird im folgenden an Hand der Zeichnung näher erläutert, worin die einzige Figur eine schematische
Darstellung der Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist«,
Gemäß der Zeichnung ist eine Pumpe 10 vorgesehen, die eine peristaltische Pumpe sein kann und zusammendrückbare
Pumpenrohre 12, 14 und 16 aufweist, die sich durch
sie hindurch erstrecken. Mit dem Einlaß von Rohr 16 ist das Auslaßende einer Probensonde 18 verbunden, deren Einlaßende
in jedes einer Reihe von Probengefäßen eintauchen kann, die verschiedene frische Gesamtblutproben (live
whole blood specimens) enthalten, die mit einem Antikoagulans versetzt wurden. Ein derartiges Gefäß ist mit der
Bezugszahl 20 bezeichnet. Die Probengefäße können der Reihe nach der Sonde 18 zugeführt werden, damit ihr Inhalt durch
das Pumpenrohr 16 aufgenommen werden kann. Das Pumpenrohr
14 besitzt ein mit einem Flüssigkeitsvorrat 22 verbundenes Einlaßende, durch das ein Agglutinierungsmittel im Gemisch
mit einem Farbstoff herangeführt wird, wie weiter unten im einzelnen beschrieben wird. Das Pumpenrohr 12 besitzt ein
gegenüber der Atmosphäre offenes Einlaßende, damit Luft durch das Rohr 12 hindurchgefördert werden kann. Das Auslaßende von Rohr 12 ist an das Rohr 14 unterhalb der Pumpe
10 angeschlossen, damit die Luft dem Strom aus Reagenz- und Farbstoff gemisch im Rohr 14 zugeführt und dieser Strom
in Abschnitte unterteilt werden kann. Der Auslaß von Rohr ist ebenfalls mit dem Rohr 14, wie dargestellt, verbunden,
damit die Probe dem erwähnten, unterteilten Strom zugeführt werden kann. Der Strom aus den vereinigten Substanzen wird
durch eine im Rohr 14 eingeschaltete Mischschlange 24 strömengelassen, damit die Substanzen miteinander vermischt
werden können. Durch das Mischen werden die Erythrocyten der Probe agglutiniert. Anschließend an die Agglutinierung
wird der Strom aus der Schlange 24 durch eine Absetzschlange 26 in Rohr 14 geleitet, in der sich die agglutinierten
Erythrocyten aus dem Gemisch absetzen. Stromabwärts von Schlange 26 ist ein Dekantierrohr 28 einer nichtdarge stellten
herkömmlichen Dekantiereinrichtung vorgesehen, dessen Einlaßende mit dem Rohr 14 verbunden ist, wobei das Rohr 28
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zusammendrückbar ist und sich durch die Pumpe 20 hindurch erstreckt, um sich in einen Abfallbehälter zu entleeren.
Annähernd sämtliche agglutinierten Zellen im Rohr 14 werden durch das Rohr 28 aus dem Rohr 14 dekantiert.
Der Rest des Stromes in Rohr 14 strömt durch die eingeschaltete Mischschlange 30, in der noch verbliebene
freie Erythrocyten erneut mit dem Agglutinierungsmittel vermischt werden. Der Strom gelangt aus der Mischschlange
im Rohr 14 in eine zweite Absetzschlange 32, die in dem Rohr 14 angeordnet ist, wo sich noch verbliebene agglutinierte
Zellen absetzen. Stromabwärts von Schlange 32 ist ein dem Rohr 28 ähnliches Dekantierrohr 34 angeordnet,
dessen Einlaßende an das Rohr 14 angeschlossen ist, wobei das Rohr 34 ebenfalls zusammendrückbar ist und sich durch
die Pumpe 20 hindurch erstrecktP um sich in ein Abfallgefäß
zu entleeren. Das Rohr 34 dient dem Abtransport der zuvor agglutinierten Zellen aus dem Rohr 14. Der Rest des
Stromes in Rohr 14 strömt durch eine weitere Mischschlange 36, in der immer noch verbliebene Erythrocyten in der Probe
mit Agglutinierungsmittel vermischt werdenp um sie zu agglutinieren.
Danach gelangt der Strom in Rohr 14 zu einer dritten Absetzschlange 31 für die Abtrennung agglutinierter
Zellen aus dem Gemisch. Stromab\?ärts von Schlange 38 ist
ein weiteres zusammendrückbares Dekantierrohr 40 angeordnet, dessen Einlaßende an das Rohr 14 angeschlossen ist
und das sich durch Pumpe 20 hindurch erstreckt und sich in ein Abfallgefäß entleert« Durch das Rohr 40 werden die
jetzt noch verbliebenen agglutinierten Zellen aus dem Rohr 14 entfernt. Stromabwärts von der Verzweigungsstelle
der Rohre 14 und 40 ist ein zusammendrückbares Pumpenrohr
42 mit seinem Einlaßende an das Rohr 14 angeschlossen, damit ein Teil des restlichen Stromes in Rohr 14 abgezogen
werden kann, wobei sich das Rohr 42, wie dargestellt, ebenfalls durch Pumpe 20 hindurch erstreckt» Der Anteil des verbliebenen
Stromes, der nicht durch Rohr 42 abgeleitet wird, gelangt im Rohr 14 zu einem Abfallgefäß.
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Zusammendrückbar Pumpenrohre 44 und 46 erstrecken sich ebenfalls durch die Pumpe 20 hindurch. Das Rohr 44
ist mit seinem Einlaßende an einen Vorrat 45 aus Verdünnungsmittel,
wie beispielsweise Salzlösung, angeschlossen. Das Rohr 46 besitzt ein gegenüber der Atmosphäre offenes
Einlaßende, während das Auslaßende stromabwärts von der Pumpe an das Rohr 44 angeschlossen ist, wodurch der Strom
des Verdünnungsmittels mittels Luft in Abschnitte unterteilt wird. Stromabwärts der Einmündung des Rohrs 46 in
das Rohr 44 ist das Auslaßende des oben erwähnten Rohres an das Rohr 44 angeschlossen, wodurch der Strom aus Rohr
demjenigen in Rohr 44 zugeführt wird. Durch das Rohr 42 strömen im wesentlichen keine Erythrocyten, da diese Zellen
agglutiniert und aus dem Rohr 14 abdekantiert worden sind. Der Strom im Rohr 42 enthält Plasma aus der Probe und
den obenerwähnten Farbstoff. Die im Rohr 44 strömenden Substanzen werden in der Mischschlange 48 vermischt, und das
Gemisch fließt danach durch eine im Rohr 44 eingeschaltete Kolorimetriedurchflußzelle 50. In Verbindung mit der
Durchflußzelle sind in üblicher Weise eine Lichtquelle und ein Fotodetektor 54 angeordnet. Der Detektor 54 besitzt
einen Ausgang über Leitung 56 zu einem herkömmlichen
Aufzeichnungsgerät 58, das die in der Durchflußzelle 50 ermittelte Farbstoffkonzentration anzeigt. Da das Probenvolumen
sowie die Volumina der anderen genannten Substanzen vorbestimmt und bekannt sind und auch die Farbstoffkonzentration
in dem Vorratsbehälter 22 bekannt ist, kann der prozentuale Volumenanteil der Erythrocyten in der Probe auf
herkömmliche Weise berechnet werden. Das Ergebnis ist in dem Ausmaß fehlerhaft, als Leukocyten in der Probe vorhanden
sind, jedoch ist dieser Fehler in Blutproben, die keinen anomal hohen Anteil an Leukocyten enthalten, unbedeutend.
Die Fließgeschwindigkeiten in den Pumpenrohren 12, 14, 16, 28, 34 und 40 können beispielsweise mit Strömungsgeschwindigkeiten
von 0,42, 0,80, 0,80, 0,60, 0,16 bzw.
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0,16 ml/min durchströmt werden. Analog können die Pumpenrohre
42, 44 und 46 mit Strömungsgeschwindigkeiten von 0,16, 4,0 bzw. 0,32 ml/min durchströmt werden. Das oben
erwähnte, dem Rohr 44 zugeführte Verdünnungsmittel dient dazu, das Volumen des Stroms aus dem Rohr 42 zu vergrößern
und das Rauschen (noise) bei der Messung der Farbstoffkonzentration zu verringern.
Wichtig ist es, daß der Farbstoff und das Agglutinierungsmittel nicht miteinander reagieren und der Farbstoff
an den Erythrocyten nicht anhaftet oder in sie eindringt. Zum Agglutinieren der Erythrocyten oder roten
Blutzellen kann ein Reagenz, wie ein kationischer PoIyelektrolyt oder Protamin verwendet werden. Ein derartiger
kationischer Polyelektrolyt ist von Aldrich Chemical Co.
unter dem Warenzeichen "Polybrene" erhältlich; ein Freiname
für diese Substanz ist Hexadimethrinbromid. Dieses Agglutinierungsmittel besitzt eine verhältnismäßig hohe
positive elektrische Ladung, so daß es mit Erythrocyten, die eine verhältnismäßig hohe negative elektrische Ladung
aufweisen, reagieren kann. Gewünschtenfalls können zur
Agglutinierung der Erythrocyten ein Panagglutinierungsantikörper (panagglutinating antibody), wie beispielsweise ein
gegen menschliche Erythrocyten wirksamer Antikörper von der Ziege oder dem Kaninchen, oder andere Agglutinierungsmittel,
wie beispielsweise Pflanzenlectine (plant lectins), verwendet werden.
In der obengenannten Literaturstelle von Ponder ist die Verwendung von zwei Farbstoffen erwähnt j, von denen
keiner in dem vorliegenden Verfahren zur Bestimmung eines Volumens an Erythrocyten geeignet ist. So reagiert Polybrene
beispielsweise mit Evans Blue (Eastman Kodak), einem von Ponder gewählten Farbstoff;, unter Ausbildung eines Niederschlags» Eine derartige Umsetzung würde die vorliegende
Methode undurchführbar macheno Der zweite von Ponder ge-
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wählte Farbstoff ist Hämoglobin. Jedoch gestattet ein natürliches Blutzellenprodukt, wie Hämoglobin, das Auftreten
von Artefakten bei der Messung der Farbstoffkonzentration. Wenn beispielsweise Hämoglobin als Farbstoff
verwendet wird, so können ein mögliches Auslaufen des Hämoglobins aus den Erythrocyten des Spenders oder ein
hoher Hämoglobinspiegel im Plasma zufolge von intravasculärer Hämolyse die Konzentration des Hämoglobins erhöhen
und somit bei der kolorimetrisehen Messung zu fehlerhaften
Ergebnissen führen. In der bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens muß der ausgewählte Farbstoff,
der die obenerwähnten Bedingungen erfüllt, wasserlöslich sein und eine verhältnismäßig niedrige elektrische
Ladung besitzen..Außerdem muß der Farbstoff eine andere
Farbe als rot aufweisen, da die Hämolyse der Erythrocyten ein natürlicher Vorgang ist. Es wurde gefunden, daß als
geeigneter Farbstoff für die Verwendung bei dem obenbeschriebenen Verfahren ein Diphenyl- oder Triphenylmethanderivat,
wie Erico Blue Glassine A, das auch als Triphenylmethan 42090 bekannt ist, oder ein Farbstoff wie
Fast Green FCF, verwendet werden kann.
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Claims (8)
- ^: ΐ ν u iüü a. M i 8973 2809 2b/TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, N.Y., VStAPatentansprüche.y Verfahren zur Bestimmung eines Volumens an Erythrocyten in einer Blutprobe,dadurch gekennzeichnet, daß man ein bestimmtes Volumen der Probe eine Leitung entlangströmen läßt, ein bekanntes Volumen eines Agglutinierungsmittels und ein bestimmtes Volumen eines Farbstoffes in die Leitung einleitet, wobei der Farbstoff bei seiner Einführung in bekannter Konzentration vorliegt, die genannten Substanzen zur Agglutinierung der Erythrocyten vermischt und die Konzentration des Farbstoffes in dem in der Leitung entlangströmenden Plasma kolorimetrisch mißt.
- 2. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man als Agglutinierungsmittel einen kationischen PoIyelectrolyten, insbesondere ein Hexadimethrinbromid, oder ein Protamin verwendet. - 3. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man als Farbstoff Erico Blue Glassine A oder Fast Green FCF verwendet. - 4. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem in die Leitung zur Unterteilung des flüssigen Stroms ein Gas einleitet. - 5. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man das Agglutinierungsmittel und den Farbstoff aus einem gemeinsamen Vorratsbehälter einleitet. - 6. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem die agglutinierten Erythrocyten aus der Leitung durch Dekantieren entfernt und daß man als Agglutinierungsmittel ein solches mit verhältnismäßig hoher positiver Ladung und als Farbstoff einen solchen verwendet, der wasserlöslich ist, nicht in die Zellen eindringt und mit dem Agglutinierungsmlttel oder mit löslichen Bestandteilen der Probe keinen Niederschlag bildet sowie die Zellen weder auflöst noch ihr Volumen verändert. - 7. Verfahren zur Bestimmung des Volumens an Erythrocyten in einer Blutprobe,dadurch gekennzeichnet, daß man ein bekanntes Volumen an einem Agglutinierungsmittel in ein bekanntes Volumen der Probe einführt, daß man ein bekanntes Volumen eines Farbstoffes von bekannter Konzentration in das Probenvolumen einführt, daß man die agglutinierten Erythrocyten innerhalb des Probenvolumens abtrennt und daß man die Farbstoffkonzentration im Plasma der Probe als Maß für das Erythrocytenvolumen der Probe kolorimetrisch bestimmt.80983fi/0858"3" 2809757
- 8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Agglutinierungsmittel einen panagglutinierenden Antikörper oder ein Pflanzenlectine enthaltendes Mittel verwendet.
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Family Cites Families (6)
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