DE2741430A1 - Neues polycyclisches aether-antibiotikum aus neuer dactylosporangium- spezies - Google Patents

Description

PAT E NTA N WA LT Hi

DR. A. VAN DERWERTH DR. FRANZ LEDERER REINER F. MEYER

DlPL-ING. (1934-1974) DIPL-CHEM. DIPL-ING.

274U30

8000 MÜNCHEN 80 LUCILE-GRAHN-STRASSE 22

TELEFON: (033) 472347 TELEX: 524 624 LEDER O TELEGR.: LEDERERPATEMr

18. August 19 P.C. (Ag) 5791

Pfizer Inc.
235 East 42nd Street, New York, N.Y., USA

Neues polycyclisehes Äther-Antibiotikum aus neuer Dactylosporangium-Spezies

Die Erfindung bezieht sich auf einen neuen Vertreter'saurer Antibiotika mit polycyclischer Äthergruppierung, einer Klasse von Verbindungen, die sich biologisch durch ihren Sinflu3 auf den Kationentransport in Mitochondrien auszeichnet. Zu dieser Familie von Antibiotika gehört Monensin (J. Aaier. Chein. Soc, 89, 5737, 1967), Nigericin (Biochen. Biophys. Res. Comm. ;53, 29, 1968); Grisorixin (J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1421, 1970); Dianemycin (J. Antibiotics, 22, 161, 1969); Salinomycin (J. Antibiotics, 27, 814, 1974); X-557A (J. Chem. Soc. Chem. Commun. 967, 1972); X-206 (J. Chem. Soc. Chem. Commun. 927, 1971); und A204A (J. Amer. Chem. Soc, 95, 3399, 1973).

Die vorstehend aufgeführten polycyclischen Äther-Antibiotika wirken gegen Gram-positive Bakterien, Fungi und Protozoen. Diese Antibiotika zeigen starke Wirkung gegen Kokzidien.

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X ~

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Die Kontrolle über die Kokzidiose bleibt weiterhin ein ernstes Problem in der Geflügelindustrie. Sechs Spezies von Koksidien führen zu leicht unterscheidbarer Morbidität bei empfänglichen Küken. Eimeria tenella, E.necatrix, E. "brunetti, E. acervulina, E. maxima und E. mivati schädigen entweder direkt durch Zerstörung der Epithelzellen des Verdauungstrakts oder indirekt durch die Bildung von Toxinen. Drei weitere Spezies von Protozoen, die zur gleichen Gattung gehören, werden als relativ harmlos angesehen; E.mitis, E. hagani und E. praecox jedoch können Gewichtszuwachs und Puttermittelnutzung herabsetzen und die Eierproduktion nachteilig beeinflussen.

Die polycyclischen Äther-Antibiotika besitzen einen hohen Wirkungsgrad gegenüber allen Spezies von Eimeria. Diese Antibiotika können deshalb als Breitband-Kokzidiostatika angesehen werden.

Die Erfindung ist mit einem neuen, sauren, polycyclischen Äther-Antibiotikum befaßt, das von drei Stämmen einer neuen Spezies von Dactylosporangium unter aeroben Tauchbedingungen in einem wässrigen Nährmedium erzeugt wird. Das Antibiotikum und seine kationischen Salze sind gegen eine Reihe von Mikroorganismen, bei der Kontrolle der Kokzidiose "bei Geflügel und hinsichtlich der Verbesserung der Futtenaittelausnutzung bei Wiederkäuern wirksam.

Die erfindungsgemäß das Antibiotikum erzeugenden Mikroorganismen, aus einer Bodenprobe in Japan isoliert, wurden bei der Überprüfung der morphologischen Merkmale von Dactylosporangium gefunden. Diese Gattung zeichnet sich durch dactyloforme (fingerähnliche) Sporangien, 3-4 frei bewegliche Sporen in jedem Sporangium und viele große kugelige Körper auf dem Substrat-Myzel aus.

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Die drei Kulturen und eine Kultur der Art der Spezies Dactylosporangium aurantiacum ATCC 23491 (der American Type Culture Collection) wurden auf den in der Veröffentlichung "Dactylosporangium, gen. nov.," von J.E. Thiemann et al. in Archiv für Mikrobiologie 58, 42-52 (1967) aufgeführten Medien gezüchtet. Die Kulturen wuchsen nicht auf dem Medium, das für die Verwendung von Kohlenhydrat beschrieben wurde; Kulturuntersuchungen wurden auf dem gleichen Medium wiederholt, das auf pH 7,0 von dem beschriebenen sauren Zustand eingestellt worden war.

Die Herstellung von Kulturen zum Ansetzen auf Medien erfolgte nach der in Internat. Jr. System. Bact. _1_6, 322 (1966) beschriebenen Methode. Die Kulturen wurden bei 28°C inkubiert, sofern nicht anders angegeben. Die meisten Ergebnisse wurden nach 14 Tagen Inkubationszeit aufgezeichnet, einige jedoch früher oder später. Die Farben wurden in gewöhnlichen Farbbezeichnungen und auch unter Bezugnahme auf Maerz und Paul's Dictionary of Color, zweite Auflage, 1950, beschrieben.

Die Medien und ihre Zusammensetzung waren wie folgt:

1. Glucose-Asparagin-Agar: Waksman, S.A., The Actinomycetes, Bd. 2, 1961, Medium Nr. 2, S. 328.

2. Glycerin-Asparagin-Agar: Ibid, Medium Nr. 3, S. 328.

3. Czapek-Glucose-Agar: Ibid, Medium Nr. 1, S. 328.

4. Nähr-Agar: Ibid, Medium Nr. 14, S. 330.

5. Bennett's Agar: Ibid, Medium Nr. 30, S. 331.

6. Hafermehl-Agar: ISP Nr. 3 Medium, Difco.

7. Tyrosin-Agar: ISP Nr. 7 Medium, Difco.

8. Calciummalat-A_gar: Waksman, S.A., Bact. Rev., 21, 1-29, (1957).

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9. Gelatine: R. Ξ. Gordon und J.M. Kihm, J. Bact., 73, 15-27 (1957).

10. Stärke-Agar: Ibid.

11. Kartoffelstücke: Stücke in Röhrchen mit einem Glasring am Boden und mit etwa 0,5 ml V/asser, 20 min bei 121⁰C im Autoklaven behandelt.

12. Möhrenstücke: Arbeitsweise wie für Kartoffeistücke.

13. Organische Nitratbrühe: Waksman, S.A. The Actinomycete3, Bd. 2, 1961, Medium 37, S. 332.

14. Dextrose-Nitrat-Brühe: Ibid, Medium 1, S. 328 mit 3,0 g Dextrose anstelle von Saccharose und ohne Agar.

15. Cellulose:

H.L. Jensen, Proc. Linnean Soc. N. S. Wales, ^5_, 231-248 (1930). M.Levine und H.W. Schoenlein, A Compilation of Culture Media, Medium Nr. 2511 (1930).

16. Casein-Agar:

17. Hickey und Tresner's Agar: J. Bact., 64, 891-892 (1952).

Die neue Kultur (Pfizer P.D. 25647) wurde auf den verschiedenen Medien wie folgt beschrieben:

^ O

Glucose-Asparagin-Agar: Wachstum ziemlich gut, isoliert auftretend, leicht erhöht, glatte Kolonien, lachsfarbig (9C7), Unterseite gleichfarbig mit der Oberfläche, kein lösliches Pigment.

Glycerin-Asparagin-Agar: Wachstum mäßig, bestehend aus isolierten, flachen Kolonien, fahl-rosafarben (9A3),Unterseite gleichfarbig mit der Oberfläche, kein lösliches Pigment.

Czapek-Glucose-Agar: Wachstum extrem spärlich als einige wenige isolierte Kolonien, sehr blaß, lachsfarben.

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Hickey und Tresner's Agar: Wachstum gut, erhöht und uneben, rosa-orange (etwa 11F8), Unterseite ähnlich in der Farbe wie die Oberfläche, kein lösliches Pigment.

Bennetts's Agar: Wachstum mäßig, bestehend aus einer unebenen Masse von Kolonien, orangefarben (ähnlich 11D7), Unterseite ähnlich in der Farbe wie die Oberfläche, kein lösliches Pigment.

Nähr-Agar: Wachstum mäßig, bestehend aus isolierten, sehr schwach erhöhten Kolonien, cremefarben bis blaß rosa (1OA2 "bis 1OB2), Unterseite gleichfarbig mit der Oberseite, kein lösliches Pigment.

Hafermehl-Agar: Wachstum gut bis mäßig, bestehend aus leicht erhöhten Kolonien, rosig (etwa 9B6), Unterseite gleichfarbig mit der Oberseite, kein lösliches Pigment.

Casein-Agar: Wachstum mäßig in Form isolierter, schwach erhöhter Kolonien, blaß orange (etwa 10F8), Unterseite ähnlich in der Farbe wie die Oberseite, kein lösliches Pigment.

Calciummalat-Agar: Wachstum sehr gering, eben, dünn, farblos, kein lösliches Pigment.

Tyrosin-Agar: Wachstum gering, bestehend aus kleinen, schwach erhöhten Kolonien, orange (1119 bis 11H11), Unterseite ähnlich in der Farbe wie die Oberseite, kein lösliches Pigment.

Gelatine: Wachstum mäßig, leicht erhöhte Kolonien, blaß rosaorange (10F6), Unterseite ähnlich in der Farbe wie die Oberseite, kein lösliches Pigment.

Stärke-Agar: kein Wachstum.
Kartoffelschnitzel: kein Wachstum.
Karottenschnitzel: kein Wachstum.

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Biochemische Eigenschaften: Nitrat in beiden Medien zu Nitrit reduziert; Gelatine mäßig verflüssigt; kein Wachstun auf Stärke-Agar; sehr schwache H_?S-3ildung; keine Änderung in Milch, selbst nach 28 Tagen; geringer Aufschluß von Casein um die Kolonien herum; Calciummalat nicht abgebaut; Einfluß auf Tyrosin unbestimmt, da zu wenig Tyrosin im Agar; Wachstum schließlich gut auf Cellulose in Jensen's Medium ohne Zerfall selbst in 28 Tagen, aber Wachstum fraglich im Levine und Schoenlein-Medium; Wachstum von 21-37°C, aber nicht bei 45° mit bestem Wachstum bei 28 und 37 ; kein Wachstum bei pH 4,0, geringes Wachstum in Form von Kolonien bei pH 5,0, mäßiges Wachstum bei pH 6,0 und gutes Wachstum bei pH 7,0; Kohlenhydratverwendung: kein Wachstum auf dem Medium, wie in der Veröffentlichung von Thiemann et al. beschrieben; auf dem gleichen Medium eingestellt auf pH 7,0: Arabinose, Dextrin, Fructose, Galactose, Glucose, Glycerin, Inulin, Lactose, Maltose, Mannit, Mannose, Raffinose, Rhamnose, Ribose, Sorbit, Stärke, Saccharose, Xylose eingesetzt; Dulcit, Inosit nicht'verwendet; Sorbose zweifelhaft.

Sporangien und Sporen: Sporangien zahlreich auf Calciummalatplatten, 5,5 χ 1,6 pm, gelegentlich 8,0 χ 1,6 um, zum Apex hin geringfügig vergrößert, gefingert, 3-4 sporig; Sporen meist elliptisch, gelegentlich tränenförmig, meist 2,2-2,7 x 1,1-1,6 pm, aber im Bereich von 1,6-3,3 χ 1,1-2,2 um, beweglich.

Pfizer (F.D. 25718) ähnelte dem Stamm F.D. 25647 mit folgenden Ausnahmen: Auf Hickey und Tresner's Medium wurden die Kolonien isoliert, kreisförmig bis dreieckig oder vierseitig, strahlig gefurcht, cremefarbig; Farbe auf Bennett's Agar rosa-cremefarben (10D6 bis 10E7), langsamer bei der Nitratreduktion, Sporangien etwas größer, meist 7,2-7,7 x 1,6-2,2 um, aber im Bereich von 5,5-7,7 x 1,6-2,2 um. Die

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Kultur verbrauchte kein Glycerin, Ribose, Sorbit und Sorbose, ansonsten war der Kohlenstoff verbrauch ähnlich dem von F.D. 25647.

Pfizer (F.D. 25712) hat die Eigenschaften der beiden anderen Kulturen, mit folgenden Ausnahmen: Wachstum auf Czapek-Glucose-Agar mäßig bzw. gering, bestehend aus schwach erhöhten kleinen Kolonien (etwa 12D6), Wachstum auf Bennett's Agar mäßig bis gut, leicht erhöht und zerfurcht, orange (etv/a 10F10), Wachstum auf Casein recht gut, orange (etwa 11G-11), Wachstum auf Hickey und Tresner's Agar gut, schwach erhöht und zerfurcht, leicht bräunlich-orange (etwa 12C8). Der Kohlenstoffverbrauch glich etwa dem von F.D. 25647.

Alle drei Kulturen wurden als Stämme einer neuen Spezies betrachtet, die aufgrund ihrer Farbe Dactylosporangium salmoneum Routien sp. nov. bezeichnet wurde. Die neue Spezies wurde als unterschiedlich zu D. aurantiacum und D. thailandense angesehen, den einzigen weiteren bekannten Spezies dieser Gattung.

Pfizer (F.D. 25647) wird die Kultur von Dactylosporangium salmoneum Routien sp. nov. zugeordnet. Die Hinterlegung erfolgte bei The American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC 31222. F.D. 25718 und F.D. 25712 wurden ebenfalls bei The American Type Culture Collection hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummern ATCC 31224 bzw. ATCC 31223.

Die Kontinuität der Hinterlegung dieser Kulturen bei The American Type Culture Collection in Rockville, Maryland sowie der einfache Zugang zu ihnen seitens der Öffentlichkeit sind für den Fall der Patenterteilung gewährleistet. Der Zugang zu den Kulturen während der Anmeldung ist gemäß Rule 14 und 35 USC 112 geregelt.

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Das Kultivieren der Dactylosporangium-Kulturen erfolgt vorzugsweise in wässrigen Nährmedien bei einer Temperatur von 28-36 C und unter Rühren unter aeroben Tauchbedingungen. Zu für solche Zwecke brauchbaren Nährmedien gehören eine Quelle assimilierbaren Kohlenstoffs, wie Zucker, Stärken und Glycerin, eine Quelle für organischen Stickstoff, wie Casein, enzymatische Abbauprodukte von Casein, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Weizengluten, feines Sojamehl, Fleischmehl und Fischmehl. Eine Quelle für Wachstumssubstanzen, wie Kornlösliches und Hefeextrakt, sowie Salze, wie Natriumchlorid und Calciumcarbonat und Spurenelemente, wie Eisen, Magnesium, Zink, Kobalt und Mangan können auch mit vorteilhaften Ergebnissen verwendet werden. Tritt bei der Fermentation übermäßig starkes Schäumen auf, können Antischaummittel, wie pflanzliche Öle oder Silicone, dem Ferraentationsmedium zugesetzt werden. Belüftung des Mediums in Behältern für Submerswachstum erfolgt vorzugsweise mit etwa 1/2 bis 2 Volumina Frischluft pro Volumen Brühe pro Minute. Das Bewegen kann mit Hilfe von Rührern erfolgen, mit denen man im allgemeinen auf dem Gebiet des Fermentierens vertraut ist. Beim Übertragen des Organismus und während des Wachstums müssen natürlich aseptische Bedingungen aufrecht erhalten werden.

Das Inoculum für die Herstellung des Antibiotikums kann durch Verwendung der Zucht aus einer Schrägkultur erhalten v/erden. Der Zuchtansatz kann zum Impfen entweder von Schüttelflaschen oder von Impfbehältern verwendet werden, oder die Impibehälter können von den Schüttelllaschen her beimpft v;erden. Das Wachstum in Schüttelf laschen hat im allgemeinen sein Maximum in 3 bis 5 Tagen erreicht, während Inoculum in Eintauch-Impfbehältern gewöhnlich am günstigsten in 2 bis 3 lagen ist. Erhebliche antibiotische Aktivität wird in der letzten Fermentierungsstufe in etwa 3 bis 5 Tagen erhalten.

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Der Antibiotikum-Gehalt liegt im Bereich von 50 bis 500 mg/1.

Der Ablauf der Erzeugung von Antibiotikum wird während der Fermentation bequemerweise durch biologische Analyse der Kulturbrühe unter Verwendung eines empfindlichen Stammes von Staphylococcus aureus oder Bacillus subtilis verfolgt. Es wird eine Standard-Plattenprüftechnik angewandt, bei der die eine Filterpapierscheibe, die mit der Kulturbrühe gesättigt ist, umgebende Hemmzone als Maß für die antibiotische Leistungsfähigkeit verwendet wird.

DünnschichtChromatographie unter Verwendung von Silicägel ist ein brauchbares Rüstzeug zum Analysieren der in Fermentationsmedien erzeugten Antibiotika und der Zusammensetzung roher und gereinigter Materialien aus den Fermentationsbrühen. Die auf pH 9,0 gepufferten Dünnschichtchromatosramme v/erden mit Äthylacetat oder Chloroform/Aceton (3:1 Vol/Vol) entwickelt. Die entwickelten Platten v/erden unter Licht -von 366 mn geprüft oder mit 1,5 % konzentrierter Schwefelsäure in Äthanol besprüht. Das Antibiotikum ist als hellgelbes Band zu beobachten. Besprühen mit Vanillin-Reagens (3 % Vanillin in 98,5 % Äthanol plus 1,5 % Schwefelsäure) macht das Antibiotikum als gelbbraunes Band sichtbar. Bioautographi3cher Nachweis des Antibiotikums kann mit Hilfe einer Deckschicht einer dünnen Lage Nähr-Agar, beimpft mit einem empfindlichen Stamm von Staphylococcus aureus oder einem anderen empfindlichen Organismus, durchgeführt werden.

Die antibiotische Verbindung 44 161 kann durch Extrahieren der ganzen !infiltrierten Fermentationsbrühe mit einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, Äthylacetat, Methylisobutylketon oder Butanol, bei einem pH-Bereich von 4,0

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ΛΑ

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bis 10,0 abgetrennt und gewonnen werden. Der Hauptanteil des Antibiotikums ist im Myzel enthalten und kann daraus durch Aufschlämmen des abgetrennten Myzels mit einem wasserlöslichen Lösungsmittel, wie Methanol, extrahiert v/erden. Das Lösungsmittel wird zu einem dünnen Sirup eingeengt und das Antibiotikum durch Zusatz von Hexan oder Heptan ausgefällt.

Das bevorzugte Verfahren zur Abtrennung und Gewinnung der Antibiotikum-Verbindung 44 161 ist v/ie folgt: Die ganze unfiltrierte Fermentationsbrühe wird mit etwa 1/5 bis 1/2 Volumen Methylisobutylketon extrahiert. Der Lösungsmittelextrakt wird im Vakuum zu einem öligen Rückstand eingeengt, der dann mit Silicagel PF₂54 (gepuffert auf pH 9,0) in Heptan aufgeschlämmt und auf eine Säule mit auf pH 9,0 gepuffertem Silicagel 60, überschichtet mit einer Lage Silicagel P?254 ^vom P^H 9,0 (beides handelsübliche Silicagele) gegeben. Die Silicagel-Säule wird nacheinander mit Heptan, Chloroform/Heptan (1:1 Vol/Vol), Chloroform, Chloroform/ Äthylacetat (3:1 Vol/Vol) und Äthylacetat entwickelt. Die an der Antibiotikum-Verbindung 44 161 reichen Eluatfraktionen werden vereinigt und im Vakuum zu einem öligen Rückstand eingeengt, der in Äther aufgenommen, mit Aktivkohle (Darco G60) behandelt, filtriert und nacheinander mit Phosphatpuffer von pH 9,0, 4,8 und 3,0 gewaschen wird. Einengen im Vakuum mit anschließendem Verreiben mit Methanol liefert die kristalline Verbindung 44 161.

Das Natriumsalz der Verbindung 44 161 kann durch Schütteln einer Äther- oder Äthylacetat-Lösung der freien Säure mit wässrigem Natriumcarbonat hergestellt werden. Das Kaliumsalz v/ird ähnlich hergestellt. Die Calcium- und Bariumsalze werden durch Behandeln einer Äther- oder Äthylacetat-Lösung der freien Säure mit wässrigem Calciumhydroxid bzw. Barium-

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hydroxid hergestellt.

Die Verbindung 44 161 und ihre Salze zeigen ausgezeichnete Aktivität gegen Kokzidiose-Infektionen bei Geflügel- In
Kükendiät zu 50 bis 200 ppm eingebracht, wirken die Verbindungen steuernd auf Einzelinfektionen von Eimeria
tenella, E. acervulina, E. maxima usw. sowie Mischinfektionen dieser Organismen.

Aufgrund des Endziels der Verhinderung und Behandlung von Kokzidiose bei Geflügel kann die gesamte Fermentationsbrühe, die die Verbindung 44 161 enthält, zur Trockne gebracht
(vorzugsweise sprühgetrocknet) und in Geflügelfutter in
der gewünschten antibiotischen Stärke eingearbeitet werden.

Die Verbindung 44 161 zeigt Hemmwirkung gegen das V/achstum einer Reihe von Mikroorganismen (Tabelle I). Der TestOrganismus wird in eine Reihe von Teströhrchen eingeimpft, die Nährmedium und unterschiedliche Konzentrationen an Verbindung 44 161 enthalten, um die minimale Konzentration des
Antibiotikums in pg/ml zu bestimmen, die das V/achstum des Organismus über 24 h hemmt.

Die Wirksamkeitsdaten für die Verbindung 44 161 und ihre
Salze gegen Kokzidiose-Infektionen bei Hühnchen wurden folgendermaßen erhalten: Gruppen von 3-5 10 Tage alten SPP-weißen Leghorn-Hähnchenküken wurden mit einer Mischdiät gefüttert, die die Antibiotikum-Verbindung 44 161 oder deren Natrium- oder Kaliumsalz gleichförmig dispergiert enthielt. Nach 24 h bei dieser Ration wurde jedes Küken per os mit
Oocysten der besonderen zu untersuchenden Eimeria-Spezies beimpft. Andere Gruppen von 3-5 10 Tage alten Küken wurden mit einer ähnlichen Mischdiät gefüttert, die von der Antibiotikum-Verbindung 44 161 oder deren Salzen frei war.

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Tabelle I

Organismus Verbindung 44

(lJatriuiusalz)

Staphylococcus aureus O1AÜO5 <O,1

O1AO52 <O,1

O1A1O9 <O,1

O1A11O <O,1

O1A111 <O,1

O1AO87 <O,1

O1A400 <O,1

Streptococcus faecalis O2AOO6 <0,1

Streptococcus pyogenes O2C2O3 <0,1

Mycobacteriura smegmatis 05A001 > 200

Bacillus subtilis 06Λ001 <0,1

Eschcrichia coli 51Λ229 >200

5U266 >200

51A125 >200

Pceudoi.'iona;3 aeruginoaa 52A1O4 >200

Klebsiella ρηΘωιιοηϊεΐθ 53ΑΟΟ9 > 200

53AO31 >2()0

Proteus mirabilis 57CJO64 >200

Salmonella cholerae-suia 58B242 >200

i'asteurella multocida 59Λ.ΟΟ1 6,25

Serratia rnarcascens 63ΛΟ17 >200

Enberobactei- aerogenes 55ΛΟΟ4 >20ü

sicca 66COOO 0,2

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' **" 274Η30

Auch sie v/urden nach 24 h infiziert und dienten als infizierte Kontrolltiere. Wieder anders Gruppen von 3-5 10 Tage alten Küken erhielten die von der Antibiotikum-Verbindung 44 161 freie Mischdiät und wurden nicht mit Kokzidiose infiziert. Sie dienten als normale Kontrolltiere. Die Behandlungsergebnisse wurden im falle von E. acervulina nach 5 Tagen und in allen anderen Fällen nach 6 Tagen ausgewertet.

Tabelle II zeigt die erzielten Ergebnisse.

	tenella	Tabelle II	durchschnittl. Infektionsgrad	Ver- hältnis	Gawichts- zunahme (vO
	acervulina		0,3 1,3	0,09 0,37	63 82
	necatrix	Dosis (ppm)	0,4 0,6 1,0	0,22 0,33 0,56	59 51 67
infizierende Spezies	maxima	100 75	0,2 0,2 0,2	0,1 0,1 0,1	77 82 Ti
E.	brunetti	125 100 75	0,4 0,8 1,0	0,22 0,44 0,56	54 49 37
"7* -u ·	125 100 75	0,6 0,6 1,4	0,38 0,38 0,88	57 82 61
E.	125 100 75
E.	125 100 75
E.

Die zur Messung der Antikokzidiose-Aktivität herangezogenen Kriterien bestanden in Schädigungsv/erten von 0 bis 4 für E. tenella nach J.E. Lynch,A Hew Method Cor the Priuary Evaluation of Anticoccidial Activity, Αεί. J. Vet. Re j. 22, 324-326 (1961), und 0 bis 3 für die anderen Spozios auf der Grundlage einer Abwandlung des Bewertungssystems nach

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-u-

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J. JolmGon und V/.H. Reid, Anticoccidial Drugs, Exp. Parasit. 2_8, 50-56 (1970). Ein konstantes Verhältnis ergab sich durch Division des Schädigungswertes einer jeden behandelten Gruppe durch den Schädigungswert der infizierten Kontrollgruppe.

Der Wert von Tierfuttern wurde im allgemeinen direkt durcii Püttern des Tieres bestimmt. Die GB-PS 1 197 826teschreibt im einzelnen eine in vitro-Wiederkäuertechnik, nach der in Futtermitteln durch Mikroorganismen verursachte Änderungen leichter und genauer bei der Wertermittlung von Tierfuttern gemessen werden. Zu dieser Technik gehört die Verwendung einer Apparatur, in der die tierischen Verdauungsprosesse in vitro durchgeführt und untersucht werden. Die Tierfuttermittel, Pansenflüssigkeit und verschiedene Wachetumsförderer werden in eine Laboreinheit unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen eingebracht und entnommen, und die eintretenden Veränderungen werden kritisch und allmählich im Verlauf des Abbaues der Futterstoffe durch die Mikroorganismen untersucht. Ein Ansteigen des Propionsäuregehalts in der Pansenflüssigkeit zeigt an, daß eine wünschenswerte Reaktion der gesamten Pansenleistung durch die Wachstumsförderer in dem Futtermittel eingetreten ist. Die Änderung des Propionsäuregehalts wird als Prozent des in der Pansen-Kontrollflüssigkeit gefundenen Propionsäuregehalts ausgedrückt. Langzeit-in vivo-Fütterungsuntersuchungen werden angewandt, um eine zuverlässige Besiehung zwischen dem Propionsaureanstieg in der Pansenflüssigkeit und verbesserter tierischer Leistung aufzuzeigen.

Panssnflüssigkeit wird einer fistulösen Kuh entnommen, die Mit handelsüblichem Mastfutter plus Heu gefüttert wird. Die Pansenflüssigkeit wird sofort durch ein Käsetuch filtriert,

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Ab

- tfi -

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und 10 ml werden in einen konischen 50 ml-Kolben gebracht, der 400 mg Standard-Substrat (68 % Maisstärke + 17 % Cellulose + 15/0 extrahiertes Sojabohnenmehl), 10 ml eines Puffers von pH 6,8 und die Testverbindung enthält. Die Kolben werden für etwa 2 min mit sauerstoffreiem Stickstoff begast und etwa 16 h in einem Schüttelwasserbad bei 39°C inkubiert. Alle Tests werden dreifach durchgeführt.

Nach dem Inkubieren werden 5 ml der Probe mit 1 ml 25 %±ger Metaphosphorsäure gemischt. Nach 10 min v/erden 0,25 ml Ameisensäure zugesetzt und das Gemisch 10 min bei 1 500 UpM zentrifugiert. Die Proben werden dann nach der Methode von D.W. Kellog in J. Dairy Science 52, 1690 (1969) gas-flüssig-chromatographisch analysiert. Die Peakhöhen werden für Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure für Proben aus unbehandelten und behandelten Inkubationskolben bestimmt. Die Ergebnisse zeigt Tabelle III.

	Tabelle III	Propionsäure W)+
Verbindung	Konsentration (ug/ml)	169 168 157 147 168 172 147 152
	25 10 5 1 25 10 5 1
44 161 Monensin

⁺unbehandelte Kontrolle = 100 %

Auf der Grundlage dieser Daten kann gefolgert werden, daß die Verbesserung der Futterverwertung durch V/iederkäuer, wie Rinder und Schafe, und monogastrische Tiere, wie Pferde, Schweine und Kaninchen, vergleichbar ist mit der, die durch

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im Handel erhältliches Monensin, ein polycyclisches Äther-Antibiotikum, erreicht wird. Die Antibiotikum-Verbindung 44 161 kann in Futtermittel als freie Säure, Natriumsalz, Kaliumsalz, Calciumsalz oder deren Gemische eingearbeitet werden. Eingetrocknete Fermentationsbrühe, die die Antibiotikum-Verbindung 44 161 enthält, kann in Futtermittel in der gewünschten Leistungskonzentration eingearbeitet v/erden.

BeisOiel 1

Es wurde ein steriles wässriges Medium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

Bestandteil	Gramm/Liter
Glucose	10
Stärke	20
Hefeextrakt	5
enzymatische Abbauprodukte	5
von Casein
Dikaliumhydrogenphos phat	0,5
Fleischmehl	5
Kobaltchlorid	0,002
Calciumcarbonat	4

pH 7,1-7,2

Zellen aus einer Schrägkultur von Dactylosporangium salmoneum ATCC 31224 wurden in eine Reihe von 300 ml-Kolben überführt, die jeweils 50 ml dieses sterilen Mediums enthielten und auf einer Rotationsschüttelmaschine 3-4 Tage bei 28-30⁰C geschüttelt wurden. Eine Teilmenge der Zuchtkultur, genügend, um ein 5 VoI/Völliges Inoculum zu liefern, wurde in 4 1-Fermentatoren überführt, die jeweils 2 des folgenden sterilen Mediums enthielten:

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	At - η -	pH	6,6 + 0,1	Gramm/Liter
Bestandteil				10
Glucose			10
feines Sojamehl		10
Stärke		10
enzymatische Abbauprodukte von Casein	1
Calciumcarbonat	0,002
Kobaltchlorid

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Die Fermentation wurde bei 28-36⁰C unter Rühren mit 1 700 UpM und Belüftung zu 1,5-2 Volumina Luft pro Volumen Kulturbrühe pro min durchgeführt, bis erhebliche antibiotische Aktivität erhalten wurde (40-60 h). Die ganze Brühe wurde ohne pH-Einstellung zweimal mit 1/3 bis 1/2 Volumen Methylisobutylketon extrahiert. Die abgetrennten Lösungsmittelextrakte wurden vereinigt und im Vakuum zu einem dünnen Sirup eingeengt.

Beispiel 2

Es wurde ein steriles wässriges Medium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

Bestandteil	pH 6,9 ί 0,1	Gramm/Liter
Glucose	10
Stärke	20
Hefeextrakt	VJl
enzymatische Abbauprodukte von Casein	5
Kobaltchlorid	0,002
C alciumc arb onat	1

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Ein 5,67 8 m⁵ (1 500 gallon)-Fermentator mit 3,785 m⁵ (1 gallons) Mediura wurde mit einem 10 %igen Inoculum von Dactylosporangium salmoneum ATCC 31224, hergestellt nach der Methode des Beispiels 1, beimpft. Die Fermentation wurde etwa 150-170 h bei 30⁰C und einer Belüftung von einem Volumen Luft pro Volumen Kulturbrühe pro min durchgeführt. Die gesamte Brühe (4,542 m , 1 200 gallons) wurde ohne pH-Einstellung mit 1,226 nr (324 gallons) Methylisobutylketon extrahiert und auf einem Podbielniak-Extraktor abgetrennt;. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und lieferte 2,5 1 eines dunklen, beweglichen Öls.

Zu 1,25 kg des Rohextrakts wurden 500 g von auf pH 9,0 gepuffertem Silicagel PFpc^ (hergestellt durch Zusatz von 1 1 0,5 m Dinatriumhydrogenphosphat zu 1 kg Silicagel P das dann über Nacht bei 110⁰C getrocknet und darauf an einem Rotationsverdampfer kräftig bewegt wurde) und 3,785 1 (1 gallon) Heptan gegeben. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und die bewegliche Aufschlämmung wurde dann ol)en auf ein Filterhilfsmittel (Super CeI) etwa 2,54 cm tief, 1 kg Silicagel 60, auf pH 9,0 gepuffert, und 2,5 kg Silicagel PF₂C/, pH 9,0 gepuffert, enthalten in einem Lappenfilter von 81,3 cm (32 Zoll) gegeben. Das Antibiotikum wurde dann mit 9,46 1 (2,5 gallons) Heptan, 18,93 1 (5 gallons) Chlorofonn/Heptan (1:1 Vol/Vol), 18,93 1 (5 gallons) Chloroform, 18,93 1 (5 gallons) Chloroform/Äthylacetat (3:1 Vol/Vol) und 3,785 1 (1 gallon) Äthylacetat eluiert. Diese Eluate (hauptsächlich Chloroform/Heptan -1:1 Vol/Vol und Chloroform), die an Verbindung 44 161 reich waren, wurden vereinigt und im Vakuum eingedampft, um ein öliges Konzentrat zu liefern, das in Äther aufgenommen, mit Aktivkohle (Darco G6O) behandelt, filtriert und mit halben Volumina Phosphatpuffer von jeweils pH 9,0, 4,8 bzw. 3,0 gewaschen wurde. Einengen im Vakuum mit anschließendem Verreiben mit Methanol führte zu

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der kristallinen Verbindung 44 161, die durch Filtrieren gesammelt, mit Heptan gewaschen und im Vakuum über Nacht bei etwa 5O⁰C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet wurde. Eine zweite Kristallisation aus Methanol mit anschließender Behandlung mit Darco G60 führte zu einem Material -. mit einem Schmp. von 155-157°C. Ingesamt wurden 25,8 g der Verbindung 44 161 aus den ursprünglichen 1,25 kg Rohextrakt gewonnen.

Die freie Säure ist löslich in Methylenchlorid, Chloroform, Aceton, Äthylacetat und Methylisobutylketon. Sie ist teilweise löslich in Methanol und unlöslich in Heptan und Wasser.

Die kristalline Säure zeichnet sich durch eine durchschnittliche Gewichtszusammensetzung von 69,24 % Kohlenstoff, 9,12 % Wasserstoff und 21,64 % Sauerstoff (Differenz), eine optische Drehung vonc* = -10° (c = 1,0, Aceton), UV-Absorptionsmaxima in Methanol bei 246 und 313 nm mit e] '* -Werten von *76 bzw.

1 CHl

und in KBr-Pellets durch unterscheidbare Banden im IR-Bereich, wie in Fig. 1 zu sehen, bei folgenden Wellenlängen in um aus: 2,97, 3,44, 5,80, 6/35, 6,18, 6,30, 6,87, 7,09, 7,28, 7,85, 8,07, 8,65, 9,08, 9,63, 10,20, 10,50, 10,94 und 12,33.

Das Natriumsalz der Verbindung 44 161 wurde durch Schütteln einer Lösung von 5 g der freien Säure in 200 ml Äthylacetat mit 200 ml 5 %igem Natriumcarbonat hergestellt. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum eingedampft und aus Heptan kristallisiert, Schmp. 181-182°C. Das Natriumsalz zeichnet sich durch eine durchschnittliche Gewichtszusammensetzung von 67,79 % C, 8,69 % H, eine optische Drehung vonof = +0,56° (c = 1,0, Chloroform), UV-Ab-

-IC'

sorptionsmaxima in Methanol bei 243 und 303 nm mit EJ ^-Werten von 60 bzw. 54 und in KBr-Pellets durch unterscheidbare Banden im IR-Bereich, wie in Fig. 2 zu sehen, bei folgenden

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Wellenlängen in um aus: 3,00, 3,40, 5,84, 6,24, 6,85, 7,00, 7,24, 7,60, 7,34, 8,00, 8,28, 9,00, 9,65, 10,55, 10,93 und 12,37.

Ebenso wurde das Kaliumsalz unter Verwendung einer 5 folgen wässrigen Kaiiumcaroonatlösung anstelle von Natriumcarbonat hergestellt. Das Salz wurde aus Heptan umkristallisiert, Schmp. 206-207°C. Das kristalline Kaliumsalz zeichnet sich durch eine durchschnittliche Gewichtszusammensetzung von 66,54 % C, 8,58 % H, eine optische Drehung von oC^ = +27° (c = 1,0, Chloroform), UV-Absorptionsmaxima in Methanol bei 243 und 305 mn mit e] '° -Werten von 59 bzw. 53 und in KBr-Pellets durch unterscheidbare Banden im IR-Bereich, wie in Fig. 3 gezeigt, bei den folgenden Wellenlängen in um aus: 3,00, 3,15, 3,40, 5,82, 6,24, 6,85, 7,22, 7,55, 7,82, 9,05, 9,60, 10,18, 10,50 und 10,93.

Das Bariumsalz wurde durch Schütteln einer Lösung von 2 g der freien Säure in 80 ml Äthylacetat mit einem glei'chen Volumen Bariumhydroxid-octahydrat in Wasser (hergestellt durch Lösen von 2,4 g Ba(0H)_?*8Hp0 in 80 ml Wasser) hergestellt. Die Schichten wurden getrennt, und die organische Schicht wurde weiter mit einer frischen Lösung von Bariumhydroxid gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Umkristallisieren aus wässrigem Aceton ergab das Bariumsalz, Schmp. 188°C. Das Bariumsalz zeichnet sich durch eine durchschnittliche Gewichtszusammensetzung von 63,67 % C, 8,11 % H, eine optische Drehung von tfjy= -2° (c = 1,0, Chloroform), UV-Absorptionsmaxima in Methanol bei 243 und 306 nm mit EJ ' -Werten von 60 bzw. 53 und in

ι cm

KBr-Pellets durch unterscheidbare Banden im IR-Bereich, wie in Fig. 4 gezeigt, bei folgenden Wellenlängen in um aus: 3,00, 3,40, 5,83, 6,23, 6,84, 7,24, 9,00, 9,64, 10,20, 10,54 und 10,94.

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. 2t -

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Das Calciumsalz wurde ebenso unter Verwendung einer gesättigten Lösung von Calciumhydroxid anstelle von Bariumhydroxid hergestellt. Es hatte einen Schmp. von 174-175°C nach dem Kristallisieren aus wässrigem Aceton. Das kristalline Calciumsalz zeichnet sich durch eine durchschnittliche Gewichtszusammensetzung von 67,67 % C und 8,85 % H, eine optische Drehung vont*^ = +0,9° (c = 1,0, CHCl₅), UV-Absorptionsmaxima in Methanol bei 243 und 306 nm mit e] £ Werten von 54 bzw. 48 und in KBr-Pellets durch unterscheidbare Banden im IR-Bereich, wie in Fig. 5 gezeigt, bei folgenden Wellenlängen in um aus: 3,00, 3,45, 5,84, 6,24, 6,85, 7,25, 7,85, 8,02, 9,30, 9,02, 9,65, 10,23, 10,60, 10,95, 11,25 und 12,40.

Beispiel 3

Die Methode des Beispiels 1 wird mit vergleichbaren Ergebnissen unter Verwendung von Dactylosporangium salmoneira ATCC 31222 oder Dactylosporangium salmoneum ATCC 313-23 wiederholt. Die gesamte, das Antibiotikum enthaltende Fermentationsbrühe wird, vorzugsweise durch Sprühtrocknen, zur Trockne gebracht.

Beispiel 4
Das Fermentationsverfahren des Beispiels 1 wurde auf die

■z

Dimensionen von Fermentatoren mit 49^1 nr (13 000 gallons) Kulturbrühe Inhalt ausgeweitet. Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 30⁰C und einer Belüftung von einem Volumen Luft pro Volumen Kulturbrühe pro min durchgeführt. Zu starkes Schäumen wurde durch Zusatz von Sojabohnenöl gesteuert. Die Fermentationsdauer betrug 5 Tage, wobei der pH der gesamten Kulturbrühe zu dieser Zeit 5,0 betrug. Die gesamte Kulturbrühe wurde mit einem Podbielniak-Extraktor unter Einsatz von 18,93 nr (5 000 gallons) Methyl-

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isobutylketon auf 49,21 m⁵ (13 000 gallons) Kulturbrühe extrahiert. Jeder 18,93 m⁵ (5 000 gallon)-Extrakt wurde im Vakuum auf 45,4 1 (12 gallons) eingeengt, und diesee wurde mit Methuiol verdrängt. Die Antibiotikum-Verbindung 44 161 fiel aus dem Methanol aus, das zum Verreiben der kautschukartigen Feststoffe verwendet wurde, wobei frisches Lösungsmittel fünfmal zugesetzt wurde. Nach dem Verreiben wurde die Aufschlämmung in Aceton gelöst und zum Entfernen von unlöslichen Anteilen filtriert. Das Ac&ton wurde auf ein kleines Volumen eingeengt und durch Heptan verdrängt, aus dem die Antibiotikum-Verbindung 44 161 kristallisieren konnte. Die Feststoffe wurden filtriert, gespült, im Vakuum getrocknet und vermählen. Eine Gesamtausbeute an kristallinem Antibiotikum 44 161 von 3,45 kg wurde aus 49,21 m (13 000 gallons) Fermentationsbrühe insgesamt erhalten.

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Leerseite

Claims (3)

274U30 Patentansprüche

1. Antibiotikum 44 161 in Form der kristallinen freien Säure mit einem Schmp. von 155-157°C, <x' = -10° bei einer Konzentration von 1 % in Aceton, einer durchschnittlichen Gewichtszusaminensetzung von 69,24 % C, 9,12 % H und 21,64 % 0 (aus der Differenz), UV-Absorpüionsmaxima in

1 ^ci Methanol bei 246 und 313 nm mit Έ\ ' -Werten von 76 bzw.

I CZZl

51 und in KBr-Pellets mit charakteristischen Absorptionen im IR-Bereich bei den Wellenlängen 2,97, 3,44, 5,80, 6,05, 6,18, 6,30, 6,87, 7,09, 7,28, 7,85, 8,07, 8,65, 9,08, 9,63, 10,20, 10,50, 10,94 und 12,33 um.

2. Antibiotikum 44 161 in Form des kristallinen Natriumsalzes mit einem Schmp. von 181-182°C, oC-q = +0,56° bei einer Konzentration von 1 % in Chloroform, einer durchschnittlichen Gewichtszusamoiensetzung von 67,79 % C und 8,69 So'H, UV-Ab-

1 ^c/ri

sorptionsmaxima in Methanol bei 243 und 303 nm mit EJ ^/j -

ι cm

V/erten von 60 bzw. 54 und in KBr-Pellets mit charakteristischen Absorptionen im IR-Bereich bei den Wellenlängen 3,00, 3,40, 5,84, 6,24, 6,85, 7,00, 724, 7,60, 784, 8,00, 9,65, 10,55, 10,93 und 12,37 um.

3. Antibiotikum 44 161 in Form des kristallinen Kaliumsalzes mit einem Schmp. von 206-207⁰CjOC₁.= +27° bei einer Konsentration von 1 % in Chloroform, einer durchschnittlichen Gewichtszusammensetzung von 66,54 % C und 8,58 % H, UV-Absorptionsmaxima in Methanol bei 243 und 305 nm mit 1 ^C/i

E₁ '-Werten von 59 bz\*. 53 und in KBr-Pellets mit cha-■ cm

rakteristischen Absorptionen im IR-Bereich bei den Wellenlängen 3,00, 3,15, 3,40, 5,82, 6,24, 6,85, 7,22, 7,55, 7,82, 9,05, 9,60, 10,18, 10,50 und 10,93 pm.

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ORIGINAL INSPECTED