-
Verfahren zur automatischen Trennung und quantitativen
-
Bestimmung von Furfurolen und/oder niederen aliphatischen Aldehyden,
gegebenenfalls im Gemisch mit Zuckern Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist
ein Verfahren zur automatischen Trennung und quantitativen Bestimmung von Furfurolen
und/oder niederen aliphatischen Aldehyden, gegebenenfalls im Gemisch mit Zuckern
unter Anwendung der Ionenaustausch-Chromatographie. Nach diesem Verfahren ist eine
gleichzeitige Trennung und quantitative Bestimmung dieser Stoffe möglich. Weiterhin
ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung eines Farb-Reagenz für dieses Verfahren.
-
Es sind viele Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Furfurolen,
niederen aliphatischen Aldehyden oder Zuckern bekannt.
-
FUr Furfurole sind gravimetrische, titrimetrische, colorimetrische
und spektrophotometrische Methoden gebräuchlich (B.L. BROWNING, Methods of Wood
Chemistry US. II, Interscience Publishers J. Wiley & Sons, New York, London,
Sydney 1967). Bei gravimetrischen Bestimmungen werden Furfurole in unlösliche Derivate
überführt, z.B. durch Fällung mit Barbitursäure; diese werden abfiltriert und gewogen.
Titrimetrische Methoden beruhen auf der Reaktion von Furfurolen
mit
Brom, wobei nicht verbrauchtes Brom titrimetrisch in der Regel mit KaliumJodid und
Thiosulfat in Gegenwart von Stärkelösung als Indikator bestimmt wird. Colorimetrische
Methoden, d.h. die photometrische Messung farbiger Verbindungen von Furfurolen mit
gewissen Reagenzien wie Orcin-Schwefelsäure oder Anilinacetat, werden meist bei
geringen Furfurolkonzentrationen angewandt. Die spektrophotometrische Methode beruht
auf der starken Lichtabsorption von Furfurolen im ultravioletten Bereich (um 280
nm).
-
Diese gebräuchlichen Verfahren sind keine ftir Furfurole spezifische
Nachweise. Andere Stoffe wie aliphatische Aldehyde und Zucker können ähnliche Reaktionen
mit den verwendeten Reagenzien geben, die Reaktion mit Furfurolen beeinträchtigen
oder sich der Messung, z.B. der Lichtabsorption, überlagern. Außerdem kann mit diesen
Methoden nicht zwischen einzelnen Furfurolen unterschieden werden. So lt es z.B.
nicht möglich, das eigentliche Furfurol (Furfural, 2-Furfurylaldehyd), das aus Pentosen
durch saure Hydrolyse bei hoher Temperatur gebildet wird, getrennt von 5-Hydroxy-furfurol
(5-Hydroxymethyl-2-furfurylaldehyd) zu bestimmen, das in entsprechender Weise in
der Regel aus Hexosen entsteht. Eine Gesamtbestimmung ist zudem in vielen Fällen
fehlerhaft, da die einzelnen Furfurole unterschiedlich intensiv reagieren.
-
Niedere aliphatische Aldehyde wie Formaldehyd (HCHO) und Acetaldehyd
(cH3cHO), werden Ublicherweise ebenfalls titrimetrisch, gravimetrisch und colorimetrisch
bestimmt (H.
-
BAUER und H. MOLL: Die organische Analyse, 4. Auflage.
-
Akademische Verlagsgesellschaft, Goest & Portig KG, Leipzig 1960).
Es werden z.B. verwendet Jodometrische, alkalimetrische und acidippetrische Methoden,
gewichts- oder maßanalytische Bestimmung der Kondensationsprodukte mit Dimedon
oder
colorimetrische Messung der roten Reaktionsprodukte mit fuchsinschwefliger Säure
bzw. bei Acetaldehyd der gelben Reaktionsprodukte mit Benzidinhydrochlorid. Diese
Methoden sind in der Regel für einzelne Aldehyde nicht spezifisch und außerdem werden
die Reaktionen von Furfurolen, Zuckern und anderen Stoffen beeinträchtigt.
-
Für die quantitative Bestimmung von Zuckern sind viele physikalische
und chemische Methoden bekannt. Dies gilt sowohl für die Erfassung der Gesamtzucker,
unterschiedlicher Zuckerarten wie Hexosen und Pentosen, als auch für die selektive
Bestimmung einzelner Zucker.
-
Für die quantitative Bestimmung einzelner Furfurole, niederer aliphatischer
Aldehyde oder Zucker werden chromatographische Verfahren eingesetzt, und zwar papier-,
dUnnschicht-, gas-und flüssigkeitschromatographische Verfahren. Dabei werden die
einzelnen Verbindungen möglichst weitgehend voneinander getrennt und dann nachgewiesen.
Furfurole und niedere aliphatische Aldehyde werden bei der Papier- und DUnnschichtchromatographie
nur nach Uberführung in weniger leicht flüchtige Derivate eingesetzt. Bei den niederen
aliphatischen Aldehyden ist dies wegen der niedrigen Siedepunkte (Formaldehyd: -210C,
Acetaldehyd 20,50C) der einzig gangbare Weg.
-
Auch bei der Gaschromatographie werden in der Regel aus den gleichen
Gründen Derivate analysiert. Hier ist unter anderem ein Verfahren beschrieben worden,
das es gestattet, simultan 5-Hydroxymethyl-furfurol und einige Zucker zu trennen
(H.
-
JACIN, J.M. SUNSKI und R.J. XOSHY: Quantitative Determination of 5-Hydroxymethyl-2-furaldehyd.
Journal of Chromatography 35 (1968), 359-362). Allerdings kann 5-Hydroxymethylfurfurol
nicht identifiziert werden, wenn die Probe Xylose
oder Ribose enthält,
da diese Zucker etwa die gleiche Retentionszeit (Zeit von Analysenbeginn bis zum
Austritt aus Gaschromatographiesäule und Nachweis im Detektor) besitzen wie 5-Hydroxymethyl-furfurol.
Außerdem konnten auf diesem Weise Furfurol und aliphatische Aldehyde nicht erfaßt
werden.
-
Für die simultane Bestimmung von Furfurolen und niederen aliphatischen
Aldehyden sind ionenaustaus chchromatographische Verfahren bekannt (p. JAIDERA und
J. CHURACEK: Ion-Exchange Chromatography of Aldehydes, Ketons, Ethers, Alcohol:
Polyols andSaccharides. Journal of Chromatography 98 (1974), 55-104). Dafür werden
stark basische Anionenaustauscherharze in HS03- oder S04 -Form (z.B. Dowex 1 X 8
Dow Chemical Co.
-
Midland USA; Amberlite IRA 400 und Amberlite CG 400 Rohm & Haas
Co. Philadelphia USA) und wässrige Elutionsmittel mit unterschiedlicher Salzkonzentration
verwendet. Diese Verfahren gestatten eine direkte quantitative Bestimmung von Furfurolen
und aliphatischen Aldehyden in Lösungen, die eine Vielzahl anderer Stoffe ("Verunreinigungen")
enthalten, wie dies in der Regel bei technischen Produkten der Fall ist.
-
Allerdings erfordern diese Verfahren einen erheblichen Zeitaufwand.
Eine Analyse beansprucht 10 bis 20 Stunden.
-
Quantitative chromatographische Zuckerbestimmungen sind Standardverfahren.
Dazu gehören die direkten papier- und dünnschichtchromatographischen Trennungen
und die Gaschromatographie von Zuckerderivaten. In den letzten Jahren sind auch
eine Reihe flüssigkeits-säulen-chromatographischer Verfahren zur Anwendung gekommen,
die eine schnelle direkte Bestimmung von Zuckern gestatten (unter anderen deutsche
Patentanmeldung P 26 57 516.6).
-
Die bekannten gravimetrischen, titriletrischen, colorimetrischen
und
spektrophotometsischen Verfahren zur Analyse von Furfurolen und Aldehyden haben
in der Regel den Nachteil, daß sie nicht substanzspezifisch sind. Daher können in
einem Stoffgemisch enthaltene Furfurole, aliphatische Aldehyde und Zucker prinzipiell
nicht einzeln erfaßt werden. Die meisten bekannten chromatographischen Verfahren
gestatten die Bestimmung von jeweils lediglich einer Stoffgruppe. Zudem tolerieren
diese Verfahren in der Regel keine oder nur geringe Mengen an Verunreinigungen,
so daß technische Produkte in der Regel zuvor entsprechend aufgearbeitet werden
müssen. Ein weiterer Nachteil vieler Verfahren ist die Notwendigkeit, die zu bestimmenden
Verbindungen zuvor in Derivate zu überführen; dies kostet Zeit und kann die Genauigkeit
der Ergebnisse beeinträchtigen.
-
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabenstellung zugrunde, Furfurole
und/oder niedere aliphatische Aldehyde und gegebenenfalls Zucker in Lösungen ohne
Vorbehandlung automatisch in einem Analysengang zu trennen und quantitativ zu bestimmen.
Überraschenderweise ist diese Trennung und quantitative Bestimmung in einem einzigen
Arbeitsgang in überraschend kurzer Zeit möglich, wenn man die Ionenaustausch-Chromatographie
anwendet in Kombination mit spektrophotometrischer Messung des Säuleneluats und
anschließendem colorimetrischen Nachweisverfahren mit Farbreagenzien im automatischen
Durchflußverfahren.
-
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur automatischen
Trennung und quantitativen Bestimmung von Furfurolen und/oder niederen aliphatischen
Aldehyden, gegebenenfalls im Gemisch mit Zuckern, dadurch gekennzeichnet, daß eine
Lösung des zu trennenden Gemisches an einem stark
basischen Ionenaustauscher
bei OOC bis 800C mit einer wäßrigen, gegebenenfalls Boratpuffer enthaltenden Lösung
und im Falle der Trennung von Zuckern anschließend mit einer Boratpuffer-lösung
als Elutionsmittel getrennt und nach Verlassen der Saule gegebenenfalls die Furfurole
im Durchflußverfahren spektrophotometrisch und anschließend nach Zugabe eines farbbildenden
Reagenz die Aldehyde, Zucker und gegebenenfalls Furfurole colorimetrisch quantitativ
bestimmt werden.
-
Für die quantitative Analyse von Furfurolen, Aldehyden und gegebenenfalls
Zuckern nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden stark basische Ionenaustauscherharze
verwendet, wie sie für die flüssigkeitschromatographische Trennung von Zuckern nach
dem bekannten Verfahren der Borat-Komplex-Ionenaustauschchromatographie eingesetzt
werden (z.
-
B. deutsche Patentanmeldung P 26 57 516.6, Kennedy, J.F., 1974. Methodology
and Instrumentation in the Chromatography of Carbohydrates on Ion-Exchanger Resins.
Biochem. Soc.
-
Trans.2, 54 bis 64; Jandera, P. und Churacek, J. 1974. Ion-Exchange
Chromatography of Aldehydes, Ketones, Ethers, Alcohols, Polyols and Saccharides.
Journal of Chromatography 98, 55 bis 104; Sinner, M., M.H. Simatupang and H.H.Diet-;
richs, 1975. Automated Quantitative Analysis of Wood Carbohydrates by Borate Complex
Ion Schlange Chromatography.
-
Wood Sci. Technol 9, 307 bis 22). Solche stark basischen Ionenaustauscherharze
sind z.B.: Durrum DA X 4 (Durrum Palo Alto, USA) Aminex A-14 (Blo-Rad Richmond,
USA) Chromobeads S (Technicon Co. Tarrytown, USA) Amberlite CG-400 (Rohm & Haas
Co. Philadelphia, USA) Bio-Rad AG 1 (Bio-Rad Richmond, USA) Dowex 1 und Dowex 2
(Dow Chemical Co., Midland, USA)
Die Ionenaustauscher werden in
der Borat-Form eingesetzt.
-
Als Laufmittel (Elutionsmittel, mobile Phase) dienen wäßrige Lösungen
und/oder Boratpuffer von 0 - 1 M und pH 7 - 10.
-
Es kann vorteilhaft sein, Elutionsgradienten-zu verwenden, wobei in
der ersten Stufe Wasser eingesetzt werden kann.
-
Zucker werden in Form ihrer Borat-Komplexe durch Ionenaustausch getrennt,
wobei die Trennleistung hinsichtlich der einzelnen Zucker sehr stark von der Boratkonzentration,
dem pH der Boratpuffer und der Temperatur der Trennsäule abhängig ist. Furfurole
und niedere aliphatische Aldehyde werden in einem weiten Bereich mit Wasser oder
einem Boratpuffer unabhängig von der Boratkonzentration und dem pH der Lösung getrennt,
sind 3edoch auch von der Trenntemperatur abhängig. Die Abhängigkeit von der Trenntemperatur
ist in der Regel umgekehrt wie bei den Zuckern.
-
Die Trennung der Substanzen nach der vorliegenden Erfindung erfolgt
zweckmäßig bei Temperaturen von 4 bis 800C mit wäßrigen Lösungen. Die optimale Temperatur
und Zusammensetzung der wäßrigen Lösung hängt von der Zusammensetzung der zu analysierenden
Probe ab. Furfurol und 5-Hydroxymethylfurfurol werden z.B. bei tieferen Temperaturen
- im Bereich von 10 bis 300C - besser als im Bereich von 40 bis 700C getrennt, der
für die leisten Zucker besonders geeignet ist.
-
Wenn die zu analysierenden Proben viele unterschiedliche Zucker enthalten,
wird eine befriedigende Trennung durch entsprechende Wahl der Zusammensetzung der
waBrigen Phase erreicht. Dabei wird die bekannte Tatsache genutzt, daß die Retentionszeiten
von Zuckern auf einen stark basischen lonenaustauscher bei Verwendung von Borat-Puffer
als wäßrige Phase mit fallender Boratkonzentration sehr stark steigen
und
zudem von dem pil der Lösung abhängen. Bei Furfurolen und Aldehyden trifft dies
überraschenderweise nicht zu.
-
Somit können die Furfurole und niederen aliphatischen Aldehyde mit
Boratpuffern von sehr geringer Konzentration oder Wasser die Ionenaustauschsäule
passieren. Man wendet also als Elutionsmittel Wasser oder eine Boratpufferlösung
von sehr geringer Konzentration an, bis man de Furfurole und gegebenenfalls auch
die niederen aliphatischen Aldehyde getrennt hat. Durch Testversuche kann man mit
einer gegebenen Apparatur feststellen, wann dies der Fall ist. Die Zucker verbleiben
dann noch auf der Säule bzw. durchwandern die Säule nur sehr langsam. Nach Trennung
der Furfurole und Aldehyde wird dann ein Boratpuffer verwendet, der für die Trennung
der auf dem Ionenaustauscher verbliebenen Zucker optimal ist.
-
Die Verwendung von Wasser führt zu einer besseren Trennung der Furfurole.
Allerdings darf die Säule vor Beginn der Trennung nicht zu lange mit Wasser gewaschen
werden, weil sonst die Furfurole und aliphatischen Aldehyde in steigendem Maße am
Ionenaustauscher festgehalten werden und dann bei Eluieren mit Boratpuffer zusammen
mit den Zuckern aus der; Säule austreten.
-
Eine zusätzliche Variante der vorliegenden Erfindung besteht darin,
daß zur Optimierung der Trennergebnisse zusätzlich ein Temperaturgradient zur Anwendung
kommt. Dabei erfolgt die Trennung der Furfurole und Aldehyde bei niedrigen Te peraturen
(10 bis 300C), und anschließend wird die Säulentemperatur nir die Trennung der Zucker
auf 40 bis 800C rhöht.
-
Der quantitative Nachweis der im Säuleneluat vorliegenden
getrennten
Furfurole, niederen aliphatischen Aldehyde und Zucker kann mit Hilfe verschiedener
Verfahren erfolgen.
-
Furfurole können im Säuleneluat aufgrund ihrer starken Lichtabsorption
im ultravioletten Bereich (um 280 nm) beim Durchströmen des Säuleneluats durch einen
W-Durchflußdetektor noch in sehr geringen Konzentrationen erfaßt werden.
-
Mengen von weniger als 0,01 »g können ohne Schwierigkeiten bestimmt
werden. Hierfür sind die in der Flüssigkeitschroiatographie üblichen W-Detektoren
mit Mikrodurchflußzelle geeignet. Niedere aliphatische Aldehyde und Zucker absorbieren
nicht in diesem Bereich. Somit ist die kontinuierliche Messung der Lichtabsorption
des Säuleneluats im VV-Bereich, die auf einem Schreiber aufgezeichnet wird, eine
selektive quantitative Bestimmung der Furfurole.
-
Der quantitative Nachweis der niederen aliphatischen Aldehyde und/oder
Zucker erfolgt durch Reaktion mit farbbildenden Reagenzien. Die farbigen Verbindungen
werden in der Regel durch Erhitzen in starkem Umfang und schneller gebildet. Daher
wird das Gemisch aus Säuleneluat und Reagenz in einer Kapillarschlange - im Folgenden
auch Reaktions-Coil genannt - durch ein Heizbad geführt. Der Flüssigkeitastrol fließt
dann durch ein Photometer (Colorimeter), in dem il Durchfluß die Lichtabsorption
der Lösung bei einer be8tixten Wellenlänge kontinuierlich gemessen wird.
-
Die lit Furfurolen, aliphatischen Aldehyden und/oder Zuckern durch
die Reaktion im Coil gebildeten farbigen Verbindungen bewirken eine Lichtabsorption,
die der Substanzmenge direkt proportional ist. Die Meßwerte werden kontinuierlich
auf einem Schreiber aufgezeichnet. Die einzelnen in der Analysenprobe enthaltenen
Substanzen, getrennt durch das Passieren der Ionenausta'ischer-Säule und nachgewiesen
durch die
Reaktion mit einem farbbildenden Reagenz, erscheinen
auf dem Schreiber als einzelne "Peaks". Die Zuordnung der Peaks geschieht über die
Retentionszeit; das ist die Zeit oder der Abstand von Analysenbeginn bis zum Peak-Scheitel.
Die einzelnen Furfurole, aliphatischen Aldehyde und Zucker haben unterschiedliche
Retentionszeiten. Die Substanzienge wird in der Regel über die Fläche des Peaks
errechnet; dazu kann ein spezieller Integrator an das Analysengerät angeschlossen
werden. Auch die Peak-Höhen sind ein direktes Maß für die Menge der entsprechenden
Substanzen in der Lösung.
-
Dieses Verfahren und dafür geeignete Apparate sind zur quantitativen
Bestimmung von Zuckern bekannt. Es ist überraschend und bisher vom Fachmann nicht
vorausgesehen worden, daß auch niedere aliphatische Aldehyde auf diese Weise getrennt
werden können, sogar im Gemisch mit Furfurolen.
-
Für die quantitative Bestimmung von Furfurolen und Zuckern können
für Zucker bekannte Farbreagenzien wie Orcin-Schwefelsäure verwendet werden. Niedere
aliphatische Aldehyde ergeben mit Orcin-Schwefelsäure keine farbigen Reaktionsprodukte.
Bei diesem bekannten Farbreagenz handelt es sich um Schwefelsäure mit einer Konzentration
von etwa 60 bis 99 Gew.%, die etwa 0,1 bis 0,3 Ges.% Orcin enthält. Nach dem Vermischen
der die lonenaustauschersäule verlassenden Lösung bit der Orcin-Schwefelsäure wird
das Gemisch etwa 3 bis 20 Minuten lang durch eine in siedendem Wasser erhitzte Schlange
geleitet, um die Farbbildung zu bewirken. Durch ein Fotometer wird dann die Absorption
bei 420 nm gemessen und über ein automatisches System aufgezeichnet. Anhand von
Test-Furfu rol-Zuckergemischen wird an einer gegebenen Apparatur unter gegebenen
Bedingungen festgelegt und festgestellt, welche Retentionszeiten die einzelnen Furfurole
und Zucker besitzen und welche Faktoren ftlr die Usreebaung von Peakflächen oder
Peakhöhen
auf die Mengen der einzelnen Furfurole und Zucker anzuwenden sind. Mit diesem Verfahren
ist eine hervorragende Trennung und quantitative Bestimmung der Furfurole und Zucker
möglich. Die untere Nachweisgrenze beträgt etwa 0,1 Furfurol und etwa 0,5 pg Zucker.
-
Ein Nachteil dieses bekannten Verfahrens liegt insbesondere darin,
daß die Orcin-Schwefelsäure ein sehr aggressives Reagenz ist, das immer wieder die
Ursache zu unliebsamen Zwischenfällen ist. Es besteht deshalb ein großes Bedürfnis
danach, ein nicht-aggressives Farbreagenz zu finden, das zudem die quantitative
Erfassung niederer aliphatischer Aldehyde gestattet.
-
Der vorliegenden Erfindung liegt daher auch die Aufgabenstellung zugrunde,
ein Farb-Reagenz für die automatische quantitative boratkompl ex-ionenaustaus ch-
chromatographi sche Bestimmung von Furfurolen, niederen aliphatischen Aldehyden
und Zuckern zu finden, das nicht-aggressiv ist und den Nachweis geringer Mengen
dieser Substanzen gestattet. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß das nachfolgend
definierte Reagenz, das in ähnlicher Zusammensetzung bereits für die automatische
quantitative Boratkomplex-Ionenaustausch-Zucker-Chromatographie eingesetzt wird
(deutsche Patentanmeldung P 26 57 516.6), diese Aufgabenstellung in ausgezeichneter
Weise löst, Ciganstand der vorliegenden Erfindung ist demgesaB auch die Verwendung
eines Farbreagenz für die automatische quantitativ B.sti-ung von Furfurolen und/oder
niederen aliphatischen lidohyden, gegebenenfalls im Gemisch Somit Zuckern, dadurch
gekennzeichnet, daß es in wäßriger Lösung enthält:
0,04 bis 0,25
Gew.% Dinatrium-2,2|-Bicinchoninat 2 bis 15 Gew.% Na2CO3 0,05 bis 0,2 Gew.% Asparaginsäure
oder Zitronensäure (monohydrat) 0,02 bis 0,15 Gew.% Kupfersulfat (berechnet als
Pentahydrat), wobei die Lösung einen pH-Wert von 11,2 bis 11,7 aufweist.
-
Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren gemäß der
Erfindung also derart ausgeführt, daß als Farbbildner eine wäßrige Lösung in einer
Menge von 0,5 bis 5 Milliliter pro Milliliter der die Chromatographiesäule verlassenden
Lösung verwendet wird, die enthält: 0,04 bis 0,25 Gew.% Dinatrium-2,2'-Bicinchoninat,
2 bis 15 Gew.% Na2CO3 0,05 bis 0,2 Gew.% Asparaginsäure oder Zitronensäure (ionohydrat)
0,02 bis 0,15 Gew.% Kupfersulfat (berechnet als Pentahydrat), wobei die Lösung einen
pH-Wert von 11,2 bis i1,7 aufweist.
-
Das Verfahren gemäß der Erfindung kann also mit mehreren Variationen
durchgeführt worden. Wenn nur Furfurol und Aldehyde zu trennen und zu bestimmen
sind, genügt als Elutionsmittel Wasser. Han kann aber auch eine Boratpuffer-Lösung
einsetzen. Wenn das zu trennende Substanzgemisch zusätzlich Zucker enthält, ist
es zweckmäßig, zunächst die Furfurole und gegebenenfalls auch die Aldehyde nur unter
Verwendung von Wasser oder einer sehr verdtinnton Boratpuffer-Lösung als flutionsaittei
zu trennen, und die Zucker dann anschließend unter Verwendung einer konzentrierteren
Boratpuffer-Lösung zu trennen. B8 kannen aber insbesondere
dann,
wenn wenig Furfurole und/oder Aldehyde im zu trennenden Gemisch vorhanden sind,
ausschließlich eine Boratpuffer-Lösung verwendet werden.
-
Unter niederen aliphatischen Aldehyden im Sinne der vorliegenden Erfindung
werden bevorzugt solche mit 1 bis 8, besonders bevorzugt 1 bis 6, und insbesondere
mit 1 bis 4, vorzugsweise 1 bis 3 Kohlenstoffatomen verstanden.
-
Das Farbreagenz gemäß der Erfindung besitzt eine intensive blaue Farbe
und zeigt eine starke Fluoreszenz. Wenn es in braunen Glasflaschen bei Raumtemperatur
aufbewahrt wird, verfärbt es sich erst nach mehreren Wochen und bekommt einen leicht
purpurnen Farbton. Bei höheren Temperaturen erfolgt die Verfärbung schneller. Die
Bildung von farbigen Komplexen mit Furfurolen, aliphatischen Aldehyden und reduzierenden
Zuckern ist Jedoch mehrere Monate lang unverändert konstant, obwohl der Purpurfarbton
nach einigen Wochen stärker zur Geltung kommt. Die gleiche Farbmenge pro Substanzmenge
wird auch mit frisch angesetztem Reagenz erhalten, das vor der Reaktion mehrere
Stunden oder Tage bei höheren Temperaturen (z.B. 30 bis 500C) aufbewahrt wurde.
Vor der Verwendung sollte frisch angesetztes Reagenz grundsätzlich einige Stunden
stehen.
-
Es ist zweckmäßig, daß zur Herstellung des Reagenz zunächst zwei getrennte
Lösungen wie folgt hergestellt werden: Lösung A: Es wird eine wäßrige Lösung hergestellt,
die etwa 0,04 bis 0,25 Gew.%, vorzugsweise 0,13 Gew.% Dinatrium-2,2'-Bicinchoninatund
3 bis 15 Gew.%, vorzugsweise etwa 6,23 Gew.%
wasserfreies Natriumcarbonat
enthält.
-
Lösung B: Es wird eine wäßrige Lösung hergestellt, die 1,2 bis-5 Gew.%,
vorzugsweise 2,47 Gew.% Asparaginsäure und 2 bis 3,5 Gew.%, vorzugsweise 3,33 Gew.%
wasserfreies Natriumcarbonat sowie 0,6 bis 2,7 Gew.%, vorzugsweise etwa 1,33 Gew.%
Kupfersulfat (berechnet als Pentahydrat) enthält. Bei der Herstellung dieser Lösung
kann möglicherweise ein flockiger hellblauer Niederschlag auftreten, der jedoch
wieder verschwindet.
-
Die Herstellung der Lösung A erfolgt zweckmäßig derart, daß zunächst
das Dinatrium-2,2'-Bicinchoninat in eine etwas geringere als die Gesamtmenge Wasser
gelöst wird. Dann wird unter Rühren das Natriumcarbonat zugefügt, und es wird auf
das volle Volumen mit destilliertem Wasser aufgefüllt.
-
Die Lösung B wird zweckmäßig dadurch hergestellt, daß die Asparaginsäure
und das Natriumcarbonat zunächst in etwa 2/3 der Gesamtmenge an Wasser gelöst werden.
Dann wird das Kupfersulfat in Wasser gelöst zugefügt und die Restmenge Wasser anschließend
zugegeben. Als Natriumcarbonat wird zweckmäßig Kristallsoda mit 10 Mol Kristallwasser
eingesetzt.
-
Die angegebenen Gewichtsmengen sind 3edoch auf wasserfreies Natriumcarbonat
gerechnet.
-
Wenn für die Lösung B anstelle der Asparaginsäure Zitronensäure verwendet
wird, ist es nicht nötig, Natriumcarbonat für diese Lösung zu verwenden, da sich
die Zitronensäure leicht und vollständig in Wasser löst. Das gesamte für das Reagenz
erforderliche Natriumcarbonat kann dann in der Lösung A vorliegen.
-
Die Lösungen A und B sind 3eweils viele Monate lang stabil.
-
Das Reagenz wird aus diesen Lösungen dadurch hergestellt, daß etwa
23 Volumenteile der Lösung A mit etwa einem Volumenteil der Lösung B vermischt werden.
Wie bereits oben dargelegt, besitzt diese endgültige Reagenz-Lösung eine Lagerfähigkeit
von mehreren Wochen. Wenn jedoch größere Lagerfähigkeiten der Lösungen erwünscht
werden, ist es zweckmäßig, die Lösungen A und B zunächst getrennt -herzustellen
und aufzubewahren. Das Farbreagenz kann dann daraus durch einfaches Mischen rechtzeitig
vor dem gewUnschten Verbrauch hergestellt werden.
-
Das Zitronensäure enthaltende Farbreagenz gemäß der Erfindung besitzt
einen schwach grünen Schimmer, der einige Stunden nach der Herstellung verschwindet.
Dann sieht dieses Reagenz wie fluoreszierendes Wasser mit einem sehr leichten blauen
Schimmer aus. Wenn das Reagenz in braunen Flaschen bei Raumtemperatur aufbewahrt
wird, bildet sich nach etwa zwei Wochen ein schwacher Purpurfarbton, der durch Brhitzen
verstärkt wird. Dies führt wie bei dem unter Verwendung von Asparaginsäure hergestellten
Reagenz dazu, daß die Farbreaktion mit Furfurolen, aliphatischen Aldehyden und Zuckern
gegen einen purpurfarbenen Hintergrund gemessen werden nuß, der bei dem Zitronensäurereagenz
stärker ausgeprägt ist als bei dem lsparaginsäurereagenz. Die Farbbildung mit den
genannten Substanzen bleibt jedoch unverändert konstant.
-
Das Ausmaß der Farbbildung erreicht im allgemeinen ein Optiiui, wenn
der pH-Wert des Reagenz-Boratpuffer-Gemisches Ii Bereich von etwa 10 bis 11, vorzugsweise
von etwa 10.5 bis 10,7 liegt.
-
Das Farb-Reagenz gemäß der Erfindung enthält soviel Natriumcarbonat
wie möglich, wobei jedoch die Gefahr eines Niederschlages vermieden werden muß.
Der obere Grenzwert für den Natriumcarbonatgehalt liegt deshalb etwa bei 15 Gew.%.
-
Hohe Gehalte an Bicinchoninat und Kupfer erweitern den linearen Erfassungsbereich
des Farbreagenzes für Furfurole, aliphatische Aldehyde und reduzierende Zucker.
Beim Nachweis geringer Mengen können aber auch Farbreagenz-Lösungen mit geringeren
Mengen an Bicinchoninat und Kupfer zur Anwendung klonen.
-
Die Konzentrationsabhängigkeit des Farbkomplexes, den das Reagenz
mit den genannten Substanzen im Boratpuffer bildet, kann als eine Funktion erster
Ordnung biß zu einem Grenzwert von etwa 0,5 bis 0,8 Absorptionseinheiten angesehen
werden, und diese Funktion geht durch den Nullpunkt. Dies gilt für einen weiten
Bereich von Reaktionsbedingungen, so z.B. für Wasser oder Boratpuffer von bis zu
1 M mit pH-Werten von 8 bis 10, für VerhEltnisse von Farbreageaz zu Säuleneluat
von 0,7 bis 4, für Reaktionsbadtemperaturen von 80 bis 1250C und Reaktionszeiten
von 0,5 bis 20 Minuten.
-
Die Intensität der Farbreaktion steigt mit zunehmendem Volulen-Verhältnis
von Reagenz zu Borat-Puffer bzw. mit abnehmender Molarität des Puffers bei gleichem
Verhältnis Reagenz zu Puffer. Aufgrund der Durchführung der Nachweis reaktion im
Durchfluß durch einen Kapillarschlauch kann das Verhältnis Reagenz zu Borat-Puffer
(Säuleneluat) nicht beliebig groß gestaltet werden. Wenn es einen gewissen Grenzwert
überschreitet, tritt eine zunehmend starke Verbreiterung der Peaks ("Bandenverbreiterung")
auf. Diese Baadenverbreiterung bewirkt, daß nahe beieinanderliegende Peaks
mehr
und mehr ineinander verlaufen. Das führt im Extremfall dazu, daß zwei Substanzen,
die durch das Passieren der Säule getrennt worden waren, im Reaktions-Coil wieder
vermischt werden und als ein Peak auf dem Schreiber-erscheinen. Zur Ermittlung des
optimalen Reagenzvolumens, das bei. gegebener Säulendurchflußrate und gegebenen
Reaktionsbedingungen (z.B.
-
Innendurchmesser der Kapillarschlange, Temperatur, Dauer) dem Säuleneluat
zugefügt werden muß, kann die Beziehung Peakhöhe zu Peakfläche verwendet werden.
Die Peakhöhe nimmt anfangs mit steigendem Reagenzvolumen zu, nimmt jedoch bei hohen
Reagenzvolumina wieder ab. Die Peakfläche hingegen steigt über den gesamten untersuchten
Bereich, wobei der Anstieg anfangs sehr steil ist und anschließend abflacht.
-
Die maximale Nachweisempfindlichkeit mit einem Minimum an Bandenverbreiterung
wird in der Regel am Wendepunkt der Kurve erzielt, die die Beziehung Peakhöhe zu
Peakfläche in Abhängigkeit vom Volumenverhältnis Reagenz zu Säuleneluat beschreibt.
Dieses optimale Volumenverhältnis von Reagenz zu Säuleneluat liegt je nach Molarität
und pH des Puffers und je nach Reaktionsbedingungen (z.B. Innendurchmesser der Kapillarschlange,
Temperatur, Zeit) im Bereich von 1 bis 2.
-
Ein Beispiel ist in der Fig. 5 dargestellt.
-
Die optimale Temperatur der Reaktion zwischen dem Farbstoffreagenz
und dem Eluat liegt bei etwa 90 bis 1000C, vorzugsweise bei etwa 950C. Die Reaktionszeit
beträgt dabei etwa 10 Minuten. Bei höheren Temperaturen nimmt die Farbintensitzt
und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse in der Regel ab. In Kapillarschlangen
hängt die Temperatur des Flüssigkeitsstroms stark von der Wärmeübertragung und der
Verweilzeit ab. Um bei kurzer Verweilzeit optimale Temperaturbedingungen in der
Kapillarschlange zu erreichen, muß
die Temperatur des Reaktionsbads
über 1000C liegen (vgl.
-
DT-OS 24 13 546). Ein Beispiel für die Abhängigkeit der Farbbildung
in Abhängigkeit von der Reaktionsbadtemperatur ist in Fig. 6 gegeben.
-
Die Reaktionszeit hat einen starken Einfluß auf die Farbbildung in
der Kapillarschlange. Bei konstanter Durchflußgeschwindigkeit und bei konstantem
inneren Durchmesser der Schlange hängt die Reaktionszeit naturgemäß von der Länge
der Schlange ab. Mit zunehmender Länge der Schlange steigen Fläche und Höhe der
Peaks zunächst an, fallen dann aber wieder ab. Dies trifft stärker zu für die Peakhöhe
als für die Peakfläche, und das Peakhöhen-Maximum wird vor dem Peakflächen-Maximum
erreicht. Der Wendepunkt der Kurve, die das Verhältnis zwischen Peakhöhe zu Peakfläche
darstellt, gibt die optimale Länge der Kapillarschlange für maximale Farbbildung
bei minimaler Bandenverbreiterung an. Es wird dazu auf Fig. 7 verwiesen.
-
In der Regel kann man davon ausgehen, daß eine hohe Farbbildung bei
geringer Bandenverbreiterung und bei kurzen Reaktionszeiten dann erreicht werden
kann, wenn das Volumenverhältnis von Reagenz zum Puffer im Bereich von 1 bis 2 liegt,
die Reaktionsbadtemperatur relativ hoch liegt bei etwa 1200C und der Reaktions-Coil
ein feiner Kapillarschlauch ist. Beispielsweise wird in 0,4 Minuten Reaktionszeit
bei 121 0C in einer Schlange mit 0,3 mm Innendurchmesser (5,5 m Lunge) bei sonst
gleichen Reaktionsbedingungen (gleiche Reagenz-Puffer-Volumina, gleiche Substanzmenge)
eine größere Peakhöhe erhalten als in 8 Minuten Reaktionszeit bei 1000C in einer
Schlange mit 0,7 mm innerem Durchmesser und 18 m Länge (vgl. dazu Fig. 7). Bei Verwendung
der Schlange mit
0,3 mm innerem Durchmesser (5,5 m Länge, 1210C)
und einem Volumenverhältnis Reagenz zu Puffer von 1 betrug die "Peakhalbwertsbreite
(w = 4 64 58 Sekunden.
-
Mit dem bevorzugten Farb-Reagenz gemäß der Erfindung können die meisten,
wenn nicht alle Furfurole (Furfurylaldehyde), aliphatischen Aldehyde und reduzierenden
Zucker reagieren, z.B. 2-Furfurol, 5-Hydroxymethyl-2-furfurol, 5-Nethyl-2-furfurol,
Formaldehyd, Acetaldehyd, Propionaldehyd, die üblichen Hexosen und Pentosen, Aminozucker,
Methyläther von Zuckern, Di- und Oligosaccharide, Glucuronsäuren usw. Mengen bis
herab zu 0,01 pg sind gut erfaßbar. Die Reproduzierbarkeit der quantitativen Erfassung
der Substanzmenge in einer Lösung - ausgedrückt als Variationskoeffizient der Peakfläche
bei 9 Binspritzungen - beträgt etwa + 1 %. Dies liegt im Bereich der Reproduzierbarkeit
der Volumendosierung beim Einspritzen.
-
Als Ionenaustauscherharze können für das Verfahren gemäß der Erfindung
die üblichen Harze verwendet werden, wie sie für die bekannte quantitative Borat-Komplex-Ionenaustausch-Zucker-Chromatographie
verwendet werden und wie sie eingangs beispielsweise genannt wurden.
-
Das bevorzugte Farb-Reagenz hat gegenüber der Orcin-Schwefelsäure
den beträchtlichen Vorteil, daß es nicht-aggressiv ist. Dies hat z.B. zur Folge,
daß die häufig Störungen verursachenden peristaltischen Pumpen ersetzt werden können
durch übliche Mikrokolbenpumpen. Auf diese Weise können außerordentlich genau reproduzierbare
Drrchflußeigenschaften erzielt werden. Dieses Farb-Reagenz verursacht keine Verstopfungen,
wie sie mit der viskosen Orcin-Schwefelsäure auftreten können, wenn nicht regelmäßig
mit Wasser gespült
wird. Mit diesem Reagenz wurde das Detektor-System
nur etwa einmal pro Woche mit Wasser gespült und gelegentlich mit 5 %iger Phosphorsäure.
Selbst dann traten keine Verstopfungsprobleme auf, wenn das Reaktionsgemisch bei
1000C über mehrere Tage in der Schlange verblieb. Da es sich bei diesem Farbreagenz
um eine wäßrige Lösung handelt, vermischt sich diese leicht und vollständig mit
dem wäßrigen Säuleneluat. Die Peakverbreiterung in dem Reaktions-Coil ist geringer
als bei Verwendung der viskosen Orcin-Schwefelsäure.
-
Deshalb wird eine bessere Auflösung von nah beieinanderliegenden Peaks
erzielt. Die Basislinienstabilität ist ausgezeichnet, und die verbesserte Auflösung
des Detektor-Systems des Analysators kann bei erhöhter Empfindlichkeit ausgenutzt
werden. Deshalb liegt die Empfindlichkeitsgrenze für reduzierende Zucker tiefer
als bei Verwendung von Orcin-Schwefelsäure. Verletzungen und Beschädigungen des
Analysators werden wegen der Nicht-Aggressivität des Farb-Reagenz auf ein Minimum
beschränkt. Der automatische Zucker-Analysator kann kontinuierlich Tag und Nacht
laufen.
-
Trotz der starken Puffer-Kapazität des bevorzugten Farb-Reagenz gemäß
der Erfindung wird die Farbbildung durch die Molarität und den pH-Wert des Borat-Puffers
beeinflußt. Deshalb müssen diese Faktoren konstant gehalten werden, oder Änderungen
der Pufferzusammensetzung bei stufenweiser Eluierung müssen in genau reproduzierbarer
Weise durchgeführt werden. Dies verursacht jedoch bei den verwendeten automatischen
Zuckeranalysatoren keine Schwierigkeiten.
-
Begleitstoffe, wie sie in der Regel bei der Untersuchung von pflanzlichen
Rohstoffen vorliegen und für die Aufarbeitung verwendete Chemikalien, stören die
quantitative Analyse der
Furfurole, aliphatischen Aldehyde und
reduzierenden Zucker in der Regel nicht. So können von dem Trenn- und Nachweissystem
z.B. Holzinhaltsstoffe, Puffersalze, Schwefelsäure, Salzsäure, Essigsäure, Natronlauge,
Enzyme und andere Proteine toleriert werden, wenn diese "Verunreinigung" in nicht
allzu großen Konzentrationen vorliegen.
-
Beispiel 1: Im Folgenden wird die Trennung und der Nachweis der Furfurole,
Aldehyde und Zucker einer Testlösung beschrieben, die zur Eichung des Analysators
(Biotronik-Zuckeranalysator ZA 5100, Biotronik GmbH, Frankfurt, Bundesrepublik Deutschland),
des angeschlossenen Integrators (Autolab System I, Spectra-Physics, Santa Clara,
USA) und des UV-Durchflußdetektors (Uvicord III, LKB, Bromma, Schweden) mit Mikrodurchflußzelle
(10 mm Schichtdicke, 0,01 ml Volumen) diente.
-
In 100 ii destilliertem Wasser waren enthalten: 1. Acetaldehyd : 10
mg 2. Formaldehyd : 401g 3. Cellobiose : 5 mg 4. Furfurol : 78 mg 5. 5-Hydroxymethylfurturol
: 15 mg 6. Mannose : 5 Dg 7. Xylose t 5 mg 8. Glucose : 9 Dg Die verwendeten Substanzen
waren: Acetaldehyd 99 % AC 015, Merck-Schuchard (München); Formaldebyd-Lösung für
Analyse 35 Ges.%, Riedel Du Haen (Seelze, Hannover); Furfurol rein, Riedel De Haen
(Seelze, Hannover)
frisch destilliert; 5-Hydroxymethyl-furfuroldehyd
rein, Serva (Heidelberg); Zucker p.a. von Merck (Darmstadt) und Fluka (Buchs, Schweiz).
-
Zur Trennung wurden verwendet: Ionenaustauscher: Durrum DA X 4 (Korngröße:
20 pm); nach Behandlung mit 8 zeiger Natronlauge mit 10 Xigem Kaliumtetraborat in
die Borat-Form überführt.
-
Trennsäule: Glassäule von 0,4 cm innerem Durchmesser mit Temperiermantel;
30 cm Ionenaustauscher-Füllhöhe; Säulentemperatur konstant 280C.
-
Borat-Puff er: 0,49 M Natriumborat pH 9,3; Fördergeschwindigkeit der
Mikrokolbenpumpe des Analysators: 35 ml/Std. (Rückdruck 28 atm). Bevor der Puffer
durch den automatischen Probenaufgeber zur Trennsäule gelangt, wird er zur Reinigung
über eine mit Dowex 1 X 4 in Boratform gefüllte Säule von 0,9 cm x 15 cm geführt.
-
Zum Nachweis wurden verwendet: a) Messung der Absorption des aus der
Trennsäule austretenden Flüssigkeitsstroms (Säuleneluat) in einem UV-DeteRt;or (Unicord
III) mit einer Mikrodurchflußzelle bei 278 nm.
-
b) Colorimetrische Bestimmung reduzierender Substanzen im Säuleneluat
unter folgenden Bedingungen: Reagenz: 0,125 Gew.% Dinatrium-2,2'-Bicinchoninat 6,111
Gew.% Natriuecarbonat 0,103 Gew.% D-L-Asparaginsäure 0,056 Gew.% Kupfersulfat-Pentahydrat
Fördergeschwindigkeit der Mikrokolbenpumpe für das Reagenz: 19 ml/Std. (Rückdruck
25 atm.).
-
Die Pulsation der Pumpe wurde durch einen Pulsationsdämpfer der Firma
Waters GmbH (Königstein i.T., Bundesrepublik Deutschland) gedämpft, den das Reagenz
durchströmte (Rückdruck: 10 atm.), bevor es in den Mischblock des Analysators gelangte,
in dem es mit dem Säuleneluat zusammengeführt wurde.
-
Reaktions-Coil: Teflonkapillare von 0,5 mm innerem und 2mm äuBerem
Durchmesser, 22,5 m Länge; in kochendem Wasser (Reaktionsbad des Analysators). Um
einen gewissen Rückdruck zu gewährleisten, war der Auslaß des Reaktions-Coil mit
der Durchflußzelle des Colorimeters über einen Teflonkapillarschlauch von 0,3 mm
innerem Durchmesser und 2,5 m Länge verbunden.
-
Coloriaeter: Durchflußphotometer des Biotronik-Zuckeranalysato rs
mit 560 nl Filter.
-
lOjal der Testlösung wurden über ein Septum in eine der 24 Schlauchschleifen
des automatischen Probenauigebers gespritzt. Der Boratpuiferstrom wurde - entsprechend
dem zuvor eingestellten Analysenprogramm - anschließend durch diese Schleife geführt
und damit die Testlösung zur Trennsäule geleitet. Dem aus der Säule austretenden
Flüssigkeitsstrom, der die voneinander getrennten Komponenten enthält, wurde nach
Passieren des UV-Durchflußdetektors der ebenfalls kontinuierliche Farbreagenzstrom
zugemischt. Das Getisch floß durch den Reaktions-Coil, anschließend durch das Coloriieter
und wurde dann in einem Gefäß aufgefangen und verworfen.
-
Im UV-Durchflußdetektor wurde die Absorption des Säuleneluats bei
278 nm und einfacher Empfindlichkeit (E = 0 - 1) kontinuierlich gemessen und auf
einen Schreiber aufgezeichnet. Dabei wurden nur die beiden Furfurole erfaßt.
-
Figur 1a zeigt das entsprechende Diagramm. In der Figur 1 bezeichnen
die Zahlen die Verbindungen, die in der Testlösung enthalten sind, so wie dies oben
angegeben wurde.
-
Das gleiche gilt sinngemäß für die folgenden Beispiele.
-
Im Colorimeter wurde die Absorption des Flüssigkeitsstromes nach Reaktion
mit dem Farb-Reagenz kontinuierlich bei 560 nm im Meßbereich von 0 bis 0,2 Absorptionseinheiten
gemessen, auf einem Schreiber aufgezeichnet und die Retentionszeiten sowie die Peakflächen
und die mit Hilfe der vorgegebenen Substanzmengen für die folgenden Analysen errechneten
Umrechnungsfaktoren von PeakflEchen auf Zuckermengen vom Autolab System I ausgedruckt.
Die Analyse war innerhalb 50 Min beendet. Das Diagramm ist in Fig. Ib dargestellt.
-
Beispiel 2: Bei einer Trennsäulentemperatur von 51 0C wurden unter
sonst gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 folgende Substanzen einer Testlösung
getrennt: In 100 ml destilliertem Wasser waren enthalten: 1. Acetaldehyd t 10 mg
2. Formaldehyd s 40 rg 3. Xylobiose t 3 Ig 4. Furfurol t 70 Ig 5. 5-Hydroxysothylfurturol
t 20 rg 6. Ribose : 4 mg 7. Mannose : 8 mg 8. Fructose : 2 mg
9.
Arabinose : 8 mg 10. Galaktose : 8 mg 11. Xylose : 45 mg 12. Glucose : 90 mg Die
Xylobiose war in kristalliner Form durch enzymatische Hydrolyse von Buchenholzxylan
gewonnen worden (M. Sinner, H.H. Dietrichs und M.H. Simatupang: Holzforschung, 26
(1972), 218 bis 228). Figur 2a zeigt das Diagramm der Furfurole (vor Zugabe des
Farb-Reagenz) und Figur 2b das Diagramm der Testlösung nach Zugabe des Farb-Reagenz.
-
Beispiel 3: Trennung eines Gemisches von 1.) Furfurol und 2.) 5-Hydroxymethylfurfurol
mit 0,49 M Natriumborat pH 9,3 bei 210C an der im Beispiel 1 beschriebenen Säule
(Abbildung 3a) und mit Wasser bei 90C an einer Säule von nur 15 cm Ionenaustauscher-FUllhöhe
und 0,4 cm Durchmesser (Abbildung 3b).
-
Beispiel 4: Bei einer Trennsäulentemperatur von 600C wurden unter
sonst gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 folgende Substanzen einer Testlösung
getrennt: In 100 ml destilliertem Wasser waren enthalten: 1. Acetaldehyd : 10 mg
2. Formaldehyd : 40 mg 3. Furfurol : 70 wg 4. 5-Hydroxymethylfurfurol : 20 ig 5.
Ribose : 8 Ig 6. Mannose t 8 Ig 7. Fructose t 3 Ig
8. Arabinose
: 8 mg 9. Galaktose : 8 mg 10. xylose :45 mg 11. Glucose :90 mg Figur 4a zeigt das
Diagramm der Furfurole (vor Zugabe des Farb-Reagenz) und Figur 4b das Diagramm der
Testlösung nach Zugabe des Farb-Reagenz.