DE2709880A1

DE2709880A1 - Antibakterielle mittel mit der bezeichnung alkyl-cis-bm123gamma tief 1 und alkyl-cis-bm123gamma tief 2 und ihre herstellung

Info

Publication number: DE2709880A1
Application number: DE19772709880
Authority: DE
Inventors: Joseph John Hlavka
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1976-03-08
Filing date: 1977-03-07
Publication date: 1977-09-22
Also published as: SE7702552L; ES456609A1; NL7702493A; DD130481A5; NZ183281A; CA1085391A; AR213842A1; AR222791A1; DK97277A; AU2210377A; FR2343750A1; DE2709880B2; FR2343750B1; AR217677A1; JPS52131576A; GB1565451A; DE2709880C3

Description

Die Erfindung bezieht sich auf neue antibakterielle Mittel, die als alkyliertes Cis-BM1 23gamma.. und alkyliertes cis-BM123gamma₂ bezeichnet werden, ihre Herstellung durch Photolyse, Verfahren zu ihrer Gewinnung aus Rohlösungen und Verfahren zu ihrer Reinigung. Im Rahmen der Erfindung liegen auch verdünnte Formen des antibakteriellen Mittels, wie Rohkonzentrate, sowie reine kristalline Formen hiervon. Die Wirkungen der neuen antibakteriellen Mittel auf bestimmte Mikroorganismen sowie ihre chemischen und physikalischen Eigenschaften unterscheiden sich von früher beschriebenen antibakteriellen Mitteln.

Die neuen erfindungsgemäßen antibakteriellen Mittel sind organische Basen und können daher mit einer Reihe organischer oder anorganischer salzbildender Verbindungen Säureadditionssalze bilden. Die Herstellung solcher Salze erfolgt durch Vermischen der freien Base des jeweiligen antibakteriel len Mittels mit bis zu 3 Äquivalent einer Säure, zweckmäßiger weise in einem neutralen Lösungsmittel. Für die Salzbildung geeignete Säuren sind beispielsweise Schwefelsäure, Phosphorsäure, Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Sulfaminsäure, Zitronensäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Essigsäure, Benzoesäure, Gluconsäure oder Ascorbinsäure. Die Säureadditionssalze der vorliegenden antibakteriellen Mittel sind im allgemeinen kristalline Feststoffe, die sich normalerweise in Wasser, Methanol oder Äthanol verhältnismäßig gut lösen, in nichtpolaren Lösungsmitteln, wie Dimetyhläther, Benzol oder Toluol, jedoch relativ unlöslich sind. Die freien Basen der antibakteriellen Mittel sind erfindungsgemäß als äquivalent zu ihren nichttoxischen Säureadditionssalzen anzusehen. Die Angabe cis-BM123gamma bezieht sich auf ein Gemisch aus cis-BMi23gamma₁ und cis-BMi23gamma₂ in bliebigen Mengenverhältnissen, während unter trans-BMi23gamma ein Gemisch aus trans-BM123gamma₁ und trans-BMi23gamma₂ in beliebigen Mengenverhältnissen verstanden wird.

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Die neuen antibakteriellen Mittel mit der Bezeichnung cis-BM1 23gamma₁ und cis-BMi23gamma₂ sowie Alkyl-cis-BM123gamma₁ und Alkyl-cis-BM123gamma₂ lassen sich durch photochemische Umwandlung ihrer entsprechenden trans-Isomeren herstellen. Die photolytlsche Umwandlung von Alkyl-trans-BM123gamma, Alkyl-trans-BMi2SgBnUHa₁ und Alkyl-trans-BM123gamma₂ in die entsprechenden Alkyl-cis-BMi23gamma, Alkyl-cis-BMi23gamma₁ und Alkyl-cis-BM123gamma₂ wird vorzugsweise durchgeführt, indem man das als Ausgangsmaterial dienende trans-Isomer in Wasser löst oder dispergiert und die Lösung mit Licht bestrahlt. Die Konzentration des als Ausgangsmaterial eingesetzten trans-Isomers im Wasser ist nicht kritisch.

Das für das erfindungsgemäße photolytische Verfahren verwendete Licht hat zweckmäßigerweise eine Wellenlänge von nicht weniger als etwa 25OO Angström, vorzugsweise eine Wellenlänge von etwa 2500 bis 4000 Angström. Um dies auf bequeme Weise zu erreichen, führt man die Umsetzung zweckmäßigerweise in einem aus einem Material, wie Quarz bestehenden Reaktionsgefäß durch, wodurch praktisch das gesamte durch das Reaktionsgefäß gehende Licht ausgefiltert wird, das eine Wellenlänge von unter etwa 25OO Angström hat. Als Lichtquelle verwendet man zweckmäßigerweise eine Hochdruckquecksilberbogenlampe mit etwa 450 Watt. Die Temperatur bei der Durchführung der Photolyse ist zur Erzielung guter Produktausbeuten nicht sonderlich wichtig, sie sollte zweckmäßigerweise jedoch innerhalb von 5 bis 50 ⁰C liegen, und beispielsweise etwa 25 bis 30 ⁰C betragen. Die für eine wesentliche Umwandlung des alkylierten trans-Isomers in das entsprechende alkylierte cis-Isomer erforderliche Zeit ist selbstverständlich abhängig von der Lichtintensität sowie der Temperatur, so daß man sie für den jeweiligen Einzelfall am besten durch einen Versuch ermittelt. Eine Zeitspanne von etwa 20 Minuten bis etwa 2 Stunden ist im allgemeinen jedoch ausreichend.

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In ähnlicher Weise lassen sich auch die Antibiotika trans-BM123gamma, trans-BMi23gamma₁ und trans-BMi23gamma₂ photochemisch in die entsprechenden Antibiotica cis-BMi23gamma, cis-BMi23gamma₁ und cis-BMi23gamma₂ überführen.

Nach Beendigung der Stufe der Bestrahlung läßt sich das erhaltene Produkt in üblicher Weise gewinnen. Hierzu kann man das Reaktionsgemisch beispielsweise lyophilisieren oder
auch zur Trockne eindampfen und den Rückstand in einer minimalen Menge eines Lösungsmittel, wie Äthanol oder Methanol, lösen. Die dabei erhaltene Lösung kann man mit Diäthylather oder Aceton verdünnen, und das hierbei anfallende ausgefallene Produkt läßt sich durch Filtrieren gewinnen. Es kann durch übliche Maßnahmen, wie durch Umkristallisation oder auf chromatographischem Weg, weiter gereinigt werden.

Die als alkyliertes trans-BMi23gamma, alkyliertes trans-BM123gamma₁ und alkyliertes trans-BMi23gamma₂ bezeichneten Ausgangsmaterialien erhält man durch reduktive Alkylierung der Antibiotika trans-BMi23gamma, trans-BM123gamma₁ oder trans-BM123gamma₂ mit einem Aldehyd oder Keton der
folgenden Formel:

R₁-CHO O

R₂-C-R₃

worin

R. Wasserstoff, Alkyl mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen,

Phenyl» Benzyl oder Alkenyl mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeutet,

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R, Alkyl mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen ist und

R₃ Alkyl mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, N,N-Di(C₁-C₄-alkyl)amino-(C₁-C.-alkyl), Chloralkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, Phenyl, Benzyl, ß-Phenyläthy1, Alkenyl mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Hydroxyalkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, oder die Substituenten R₂ und R₃ zusammen mit der Methyli dingruppe für Cyclobutyl, Cyclopentyl, Monomethylcyclopentyl, Dimethylcyclopentyl, Trimethylcyclopentyl, Cyclohexyl, Monomethylcyclohexy1, Dimethylcyclohexyl, Trimethylcyclohexyl, Cycloheptyl oder einen Rest der Formel

CH,

stehen, worin

Wasserstoff, Alkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl bedeutet.

Das reduktive Alyklierungsverfahren nach dem sich alkylierte trans-Isomere herstellen lassen, wird wie folgt durchgeführt: Man löst ein Antibiotikum trans-BMi23gamma, trans-BMi23gamma₁ oder trans-BMi23gamma₂ in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Nasser, Methanol, Methylcellosolve oder ein Gemisch hiervon, worauf man eine gegenüber einer äquimolaren Menge überschüssige Menge des gewünschten Aldehyds oder Keton zugibt und schließlich eine zur Reduktion ausreichende Menge Natriumcyanoborhydrid zusetzt. Im Verlaufe der Reaktion hält man die pH-Werte des Reaktionsgemisches durch Zugabe verdünnter Mineralsäure

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auf 6,0 bis 8,0. Nach 1 bis 24 Stunden langer Umsetzung bei Umgebungstemperatur (10 bis 35 ⁰C) dampft man das Reaktionsgemisch unter Vakuum zur Trockne ein, behandelt den dabei erhaltenen Rückstand mit Methanol und filtriert ihn schließlich ab. Das Filtrat wird mit Aceton verdünnt, worauf man das ausgefallene feste Produkt abfiltriert und unter Vakuum trocknet.

Die Produkte lassen sich aus den bei der reduktiven Alkylierung anfallenden Reaktionsgemischen auch durch andere Methoden gewinnen, beispielsweise durch Fällung, Konzentrieren, Lösungsmittelextraktion oder Kombinationen hieraus. Die nach Isolierung erhaltenen Produkte können nach irgendeinem bekannten Reinigungsverfahren gereinigt werden. Hierzu gehören eine Umkristallisation aus verschiedenen Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, eine chromatographische Reinigung oder eine Gegenstromverteilung, und alle diese Verfahren werden gewöhnlich für derartige Zwecke eingesetzt.

In ähnlicher Weise lassen sich auch die Antibiotika cis-BMi23gamma, cis-BM123gamma_l und cis-BMi23gamma₂ durch reduktive Alkylierung in die erfindungsgemäßen Alkyl-cis-BM123gamma, Alkyl-cis-BM123gamma., und Alkyl-cis-BMi23gamma₂ überführen.

Aldehyde und Ketone, die sich beim obigen reduktiven Alkylierverfahren (nach dem allgemeinen Verfahren von Beispiel 8) einsetzen lassen, gehen aus der folgenden Tabelle I hervor. Aus dem jeweiligen Namen der darin befindlichen Derivate ist dabei ersichtlich, ob als Ausgangsmaterial das Antibiotikum trans-BMi23gamma oder das Antibiotikum cis-BM123gamma eingesetzt wurde.

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T a be lie

Eingesetzte Carbonyl-Verbindung Name des Derivats

1-Dipropylamino-2-propanon

1-Chlor-3-pentanon 4-Methyl-2-pentanon

Phenylaceton

6-Methyl-5-hepten-2-on 3-Methyl-2-pentanon 5-Methyl-2-hexanon 3-Äthyl-2-pentanon 3,5-Dimethyl-2-octanon 3-Octanon

3-Methyl-2-hexanon 1-Methy1-2-(N,N-dipropylamino)äthy1-trans-ΒΜΊ 2 3gamma

1-Xthyl-S-chlorpropyl-trans-BMI23gamma 1 ,S-Dimethylbutyl-trans-BM^Sgamma 1-Methy1-2-phenylathyl-trans-BM123gamma 1,S-Dimethylhexen-4-yl-trans-BMi23gamma 1 ^-Dimethylbutyl-cis-BM^Sgamma 1 ^-Dimethylpentyl-cis-BM^Sgamma 1 -Methyl-2-äthylbutyl-trans-BMI 23ganuna 1,2 ^-Trimethylheptyl-trans-BM^Sgamma 1 -Xthylhexyl-trans-BMl23gamma 1,2-Dimethylpentyl-trans-BMI23gairana

CO CX) CD CD

Tabelle I (Fortsetzung)

Eingesetzte Carbony!-Verbindung Name des Derivats

2-Pentanon 2-Butanon Aceton 3-Decanön 3-Undecanon

Mesityloxid

4-Methyl-2-hexanan 2,4,4-Trimethy!cyclopentanon 3,3-Dimethyl-2-butanon 3,5-Dimethy!cyclohexanon 4-Hydroxy-3-methy1-2-butanon 1-DiSthylamino-3-butanon 1-Methylbutyl-cis-BMI23gamma

1 -Methylpropyl-cis-BMI2 3gamma Isopropyl-trans-BMI23gamma

1-Xthyloctyl-trans-BMI23gamma 1-Äthylnonyl-trans-BM123gamma 1,3-Dimethylbuten-2-yl-cis-BM 1,3-Dimethylpentyl-trans-BMI23gamma 2,4,4-Trimethylcyclopentyl-trans-BMI23gamma 1,2 ^-Trimethylpropyl-cis-BM^Sgamma 3,5-Dimethylcyclohexyl-trans-BMI23gamma 1^-Dimethyl-S-hydroxypropyl-trans-BMI23gamma

1-Methyl-3-(N,N-diäthylamino)propyltrans-BM123gamma

ro -j ο co οο οο

Tabelle I (Fortsetzung)

Eingesetzte Carbonyl-Verbindung Name des Derivats

3-Hydroxy-3-methyl-2-butanon 3-Pentanon

3-Methyl-2-butanon 4-Heptanon

Dimethylaminoaceton

5-Diäthylamino-2-pentanon

Cyclobutanon 2-Octanon

4-Phenyl-2-butanon 5-Chlor-2-pentanon 5-Hexen-2-on

1 ^-Dimethyl^-hydroxypropyl-trans-BMI 23gamma 1-Xthylpropyl-cis-BMI23gamma

1 _/2-Dimethylpropyl-trans-BM123gaInma

1-Propylbutyl-cis-BM12 3gamma

1-Methyl-2-(N,N-dimethylamino)-äthyltrans-BM12 3gamma

1-Methy1-4-(N,N-diäthylamino)butyl-trans-BMi23ganuna

Cyclobutyl-trans-BM^Sgamma ^?

1-Methylheptyl-trans-BMl23gamma

1-Methy1-3-phenylpropyl-trans-BMI23gamma

1-Methyl-4-chlorbutyl-trans-BMi23gamma

1-Methylpenten-4-yl-trans-BM123gamma

CD OO OO CD

Tabelle. I (Fortsetzung)

Eingesetzte Carbonyl-Verbindung Name des Derivats

Cyclohexanon

2-Hexanon 2-Heptanon

Cycloheptanon Cyclopentanon

4,4-Diraethyl-2-pentanon 2,6-Dimethyl-3-heptanon 4-Octanon 3-Heptanon 1-Benzyl-4-piperidon 1-Methyl-4-piperidon 3-Methy!cyclopentanon 3,3-Dimethyl-2-butanon Cyclohexyl-trans-BiH 23gamma

1-Methylpentyl-trans-BMI23gamma

1-Methylhexyl-trans-BM12 3gamma

Cycloheptyl-trans-BMi2 3gamma

Cyclopentyl-trans-BM12 3ganuna

1 ,3 ,S-Trimethylbutyl-cis-BM^Sgamma

1-Isopropyl-4-methylpentyl-cis-BM123gaInma

1-Propylpentyl-trans-BMI23gamma

1-Äthylpentyl-trans-BM123garama

1-Benzyl-4-piperidyl-trans-BMI23gamma

1-Methy1-4-piperidyl-trans-BMI23gamma

3-Methylcyclopentyl-trans-BM123gamma

1-Methy1-2,2-dimethylpropyl-cis-BMI23gamma

CD CO CO CO CD

Tabelle I (Fortsetzung) Eingesetzte Carbonyl-Verbindung

Name des Derivats

4-Methyl-2-heptanon 3,4-Dimethy1-2-hexanon 1,3,3-Trimethy!cyclopentanon 5-Hexen-2-on 2-Methy!cyclopentanon 2,4-Dimethy!cyclopentanon 3-Hexanon 3-Hydroxy-2-butanon 4-Hydroxy-3-methy1-2-butanon 2-Nonanon 5-Hydroxy-2-pentanon 2-Decanon 1,3-Dimethylhexyl-trans-BMI23gamma 1,2,3-Trimethylpentyl-trans-BM123gamma 1,3,3-Trimethylcyclopentyl-trans-BM123gamma 1-Methylpenten-4-y1-cis-BMl23gamma 2-Methylcyclopentyl-trans-BM123gamma 2,4-Dimethylcyclopentyl-trans-BMI23gamma

1-Äthylbutyl-trans-BM123gamma ;

1-Methyl-2-hydroxypropyl-trans-BMI23gamma 1^-Dimethyl-S-hydroxypropyl-trans-BMI23gamma 1-Methyloctyl-cis-BMl23gamma 1 -Methyl-4-hydroxybutyl-trans-BMI 23gamma 1-Methylnony1-trans-BMl2 3gamma

CD OO QO O

Tabelle I (Fortsetzung)

Eingesetzte Carbony!-Verbindung Name des Derivats

Pheny!acetaldehyd

2-Xthylhexanal 2,2-Dimethylbutanal 2,2-Dimethylpropanal 2-Äthyl-2-butenal 2-Methyl-2-butenal 2-Methyl-2-pentenal·

Formaldehyd Acetaldehyd Benzaldehyd

2-Phenyläthyl-trans-BMi 2 3gamma 2-Äthylhexyl-cis-BM123gamina 2,2-Dimethylbutyl-trans-BMI23gamma 2,2-Dimethylpropyl-trans-BMI23gamma 2-Äthyl-2-butenyl-trans-BMi2 3gamma 2-Methyl-2-butenyl-cis-BM123gamma 2-Methyl-2-pentenyl-trans-BM123gamma Methyl-trans-BM12 3gamma Äthyl-trans-BM123gamma Benzyl-trans-BM123gamma

-Vj-

CD 00 OO CD

Die Antibiotica mit den Bezeichnungen BM123ß.. und BMi23ß_, trans-BMi23ß₁ und trans BM123ß₂ entstehen während der Züchtung eines neuen Stammes einer undeterminierten Species von Nocardia unter kontrollierten Bedingungen. Dieser neue Antibioticum produzierende Stamm wurde aus einer Probe Gartenerde isoliert, die bei Oceola, Iowa, gefunden wurde, und wird in der Kultursammlung der Lederle Laboratories Division, American Cyanamid Company, Pearl River, New York, als Kultur No. BM123 aufbewahrt. Eine lebende Kultur des neuen Mikroorganismus wurde bei dem Culture Collection Laboratory, Northern Utilization Research and Development Division, United States Department of Agriculture, Peoria, 111., hinterlegt und dort in die ständige Kulturensammlung aufgenommen. Sie ist von dort unter der Hinterlegungs-Nr. NRRL 5646 frei erhältlich. BM123ß bezieht sich auf eine Mischung von BM123B. und BM123ß₂·

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Im folgenden v/ird der Mikroorganismus Nocardia sp., NRRL 5646, aufgrund der bei ihm festgestellter charakteristischer Merkmale allgemein beschrieben. Die Ermittlung der Kulturmerkmale, physiologischen Merkmale und morphologischen Merkmale des Organismus erfolgte nach den Methoden, wie sie von Shirling und Gottlieb in Internat. Journ. of Syst. Bacteriol. Bd. 16, S. 213-240 (1966) näher beschrieben sind. Die chemische Zusammensetzung der Kultur wurde nach- den von Lechevaller et al. in Advan. Appl. Micrpbiol. Bd. 14, S. 47-72 (1971) beschriebenen Verfahren bestimmt. Die unterstrichenen beschreibenden Farbangaben und die Farbplättchen-Bezeichnungen wurden nach Color Harmony Manual, 3. Auflage (1948), Container Corp. of America, Chicago, 111., ermittelt. Die Beschreibungseinzelheiten finden sich in den folgenden Tabellen II bis VI.

Stärke des Wachstums

Mäßiges Wachstum auf Hefeextrakt-, Asparagin-Dextrose-, Benedict-, Bennett-, Kartoffeldextrose- und Weinstein-Agar, leichtes Wachstum auf Hickey- und Tresner-, Tomatenpasten-, Hafermehl- und Pablum-Agar, Spurenwachstum auf anorganische Salze-Stärke-, Kuster-Haferflocken-, Czapek-Lösungs- und Reis-Agar.

Luftmycel

Das Luftmycel ist, falls vorhanden, weißlich, wird nur auf Hefeextrakt-, Asparagin-Dextrose-, Benedict-, Bennett- sowie Kartoffeldextrose-Agar gebildet.

Lösliche Pigmente

Es werden keine lösliche Pigmente produziert.

Unterseitenfarbe

Farblos bis gelbliche Schattierungen.

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Verschiedene physiologische Reaktionen

Keine Gelatineverflüssigung, Nitrate werden innerhalb von 7 Tagen zu Nitriten reduziert, auf Pepton-Eisen-Agar v/erden keine melanoiden Pigmente gebildet, keine Peptonisierung oder Gerinnungsbildung in Purpurmilch, Natriumchloridtoleranz in Hefeextrakt-Agar

^4 %, jedoch <7 %, optimales Wachstum bei einer Temperatur von 32 ⁰C; Kohlenstoffverwertung nach J. Bacteriol. Bd. 56, S. 107-114 (1948): gute Verwertung von Glycerin, Salicin, d-Trehalose und Dextrose, mäßige Verwertung von Isoinosit und schlechte bis keine Verwertung von d-Fructose, Maltose, Adonit, 1-Arabinose, Lactose, d-Mannit, d-Melibiose, d-Raffinose, 1-Rhamnose, Saccharose und d-Xylose.

Chemische Zusammensetzung

Der Organismus gehört zum Zellwandtyp IV, d. h. er enthält meso-2,6-Diaminopimelinsäure und hat ein Gesamtzellenzuckerspektrum vom Typ A, was besagt, daß er Arabinose und Galactose enthält. Methylierte Ganzzellenextrakte zeigen im Gaschromatogramm Fettsäurespektren, die den von Nocardia asteroides ATCC 3308 gebildeten ähnlich sind.

Mlkromorphologle

Das Luftmycel wächst aus dem Substratmycel in Form schwach verzweigter langer gewundener Elemente heraus, die gewöhnlich in länglichen einfachen Spiralen enden. Die gewundenen Elemente sind unregelmäßig in kurze elliptische bis zylindrische Sektionen (Sporen?) segmentiert, die sich leicht zergliedern. Die Spiralendbereiche sind weniger deutlich segmentiert. Die Segmente haben im allgemeinen Abmessungen von 0,8 bis 1,7 ,um χ 0,3 bis 0,5 ,um, mit einem Mittelwert von 0,4 ,um χ 1,2 .um.

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Diagnose

Die morphologischen Charakteristiken der Kultur BM23 sind wegen der schlechten Entwicklung von Luftmycel auf den meisten Medien nur schwierig zu beobachten und zu interpretieren. Der chemischen Analyse zur Bestimmung der allgemeinen Beziehungen des Organismus kommt daher notwendigerweise eine beträchtliche Bedeutung zu. Auf Basis des von Lechevalier et al. vorgeschlagenen Systems enthält die Kultur BM123 meso-2,6-Diamlnopimelinsäure in ihren Gesamtzellen, und bei der Zuckeranalyse ergibt sich das Vorhandensein von Arabinose und Galactose. Die Kultur gehört daher dem Zellwandtyp IV an. Ein Vergleich des GasChromatographenspektrums der Kultur BM123 mit demjenigen von Nocardia asteroides ATCC 3308 zeigt, daB sich beide beachtlich ähneln. Andere Charakteristiken der Kultur BM123, die mit dem Nocardia-Konzept übereinstimmen, sind ihr fragmentierendes Luftwachstum auf einigen Medien und das totale Fehlen von Luftwachstum auf den meisten Medien. Wegen des Fehlens adäquater Kriterien für die Charakterisierung von Nocardia hinsichtlich der Species erfolgte auch keine derartige Bestimmung. Die Kultur BM123 wird daher als eine nicht bestimmte Species von Nocardia angesehen, bis sich eine derartige Diagnose stellen läßt.

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Tabelle ττ

Kulturcharakteristiken von Nocardia sp. NRRL 5646

Inkubation: 14 Tage

Temperatur: 32 ⁰C

Medium	Ausmaß de· Wachstums	Luftmycel und/oder Sporen	lösliches Pigment	Unterseiten farbe
Hefe-Extrakt-Agar	mittelmäßig	Luftmycel weißlich,	keines	senffarben
		schwach		(3 Ie)
co *J Hickey- und Tresner- CP ·* **»	gering	kein Luftmycel	keines	farblos bis gelblich grün
-•4 Asparagin-Dextrose-	mittelmäßig	Spur eines weißlichen	keines	amberfarben
*· Agar		Luftmycels		(3 Ic)
Benedict-Agar	mittelmäßig	Luftmycel weißlich, schwach	keines	durchsichtig lohfarben
				(4 gc)
Bennett-Agar	mittelmäßig	Spur eines weißlichen	keines	camelfarben
		Luftmycels		(3 ie)
Anorganischer SaIz- Stärke-Agar	Spur	kein Luftmycel	keines	farblos

Bemerkungen

dunkle Zonen im Substratmycel; Coremiebildung auf der Myceloberfläche

die peripheren Zonen der Kolonien werden olivgrün

Oberfläche leicht gerunzelt

auf der Myceloberfl£cho reichlich CoremiebilcLung

Oberfläche leicht gerunzelt

CjD OO OO

Tabelle II (Fortsetzung)

Kulturcharakteristiken von Nocardia sp. NRRL 5646 Inkubation: 14 Tage Temperatur: 32 C

	Medium	Ausmaß des Wachstums	Luftmycel und/oder Sporen	lösliches Pigment	Unterseiten farbe
9098	Kuster-Haferflocken- Agar	Spur	kein Luftmycel	keines	farblos
OD	Czapek-Losungs-Agar	Spur	kein Luftmycel	keines	farblos
O	Kartoffel-Dextroae-	mittelmäßig	Luftmycel weißlich,	keines	camelfarben
«4	Agar		schwach		(3 ie)
	Tomatenpaste-Hafer- mehl-Agar	gering	kein Luftmycel	keines	farblos
	Pablum-Agar	gering	kein Luftmycel	keines	farblos
	Reis-Agar	Spur	kein Luftmycel	keines	farblos
	Weinstein-Agar	mittelmäßig	kein Luftmycel	keines	farblos bis gelblich

Bemerkungen Tabelle Mlkromorphologle von Nocardla sp. NRRL 5646

Medium

Hefeextrakt-Agar

Luftmycel und/oder Sporifergn-Strukturen

Das Luftraycel tritt aus dem Trägermycel «in Form schwach verzweigter gewundener Elemente aus, die gewöhnlich in länglichen einfachen Spiralen enden. Die gewundenen Elemente sind unregelmäßig in kurze Sektionen (Sporen?) segmentiert, die leicht disartikulieren. Die Spiralendbereiche sind weniger deutlich segmentiert. Die Segmente haben im allgemeinen die Abmessungen 0,8 bis 1,7 »um χ 0,3 bis 0,5 »um, mit einem Mittelwert von 0,4 .um χ 1,2 ,um.

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Tabelle Verschiedene physiologische Reaktionen von Nocardia sp. NRRL 5646

Inkubationszeit

Organisch· Nitratbrühe

Organische Nitratbrühe

Pepton-Eisen-Agar Purparmilch Bef*extrakt-Agar

plus (4, 7, 10 und 13 %) NaCl

7	Tage
14	Tage
7	Tage

14 Tage

24 bis 48 Stunden 7 Tage 7 Tage Ausmaß des Wachstums gering gut gut

gut

mittelmäßig

Physiologische Reaktion keine Verflüssigung keine Verflüssigung

Nitrate werden zu Nitriten reduziert

Nitrate werden zu Nitrilen reduziert

keine Reduzierung von Melaninpigmenten

keine Peptonisierung oder Gerinnung

NaCl Toleranz ~y. 4 % jedoch < 7 %

O CD 00 OO

- VB -

Tabelle V Kohlenstoffverwertungsverhalten von Nocardia sp. URRL 5646 Inkubation; 10 Tage Temperatur: 32 ⁰C Kohlenstoffquelle Verwertung

Adonit O

1-Arabinose O

Glycerin 3

d-Fructose 1

i-Inosit 2

Lactose O

d-Mannit O

Sallcin 2

d-Meliblose O

d-Raffinose O

Rhannose O

Maltose 1

Saccharose O

d-Trehalose 3

d-Xylose 0

Dextrose 3

Negative Kontrolle O

3 - Gute Verwertung 1 - Schlechte Verwertung

2 - mäßige Verwertung 0 - keine Verwertung

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Tabelle VI Chenische Zusammensetzung von Nocardia sp. NRRL 5646

ZeI!wandtyp Hauptbestandteile

Typ IV neso-DAP,

Arabinose/
Galactose

Die Produktion von BM123B und trans BM123ganuna ist nicht

auf diesen besonderen Organismus oder die Organismen beschränkt, die völlig den oben beschriebenen Wachstumsverhalten und den angeführten mikroskopischen Eigenschaften genügen, welche lediglich zu Illustrationszwecken angegeben sind. Es werden aus diesem Organismus daher auch durch verschiedene Mittel Mutanten gebildet, wie beispielsweise durch Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Stickstofflost, Actinophagen oder dergleichen. Eine lebende Kultur eines typischen derartigen Mutantenstammes wurde bei
Northern Utilization Research and Development Division, United
States Department of Agriculture, Peoria, 111., hinterlegt und
dort in die ständige Sammlung aufgenommen, von wo sie unter der
Nummer NRRL 8050 bezogen werden kann. Obwohl die Kulturmerkmale, die physiologischen Merkmale und die morphologischen Merkmale
von NRRL 8050 praktisch die gleichen sind wie diejenigen von
NRRL 5646, produziert der erstere während einer aeroben Fermentation größere Mengen an BM123· Der Organismus NRRL 8050 unterscheidet sich ferner vom Stammorganismus NRRL 5646 durch
folgende Merkmale:

(a) er reduziert Nitrate langsamer zu Nitriten und

(b) er bildet auf Bennett- sowie auf Hefeextrakt-Agar ein rosenholz-lohfarbenes Myce!pigment.

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-Ht-

Die neuen erfindungsgemäßen antibakteriellen Mittel sind im allgemeinen kristalline Feststoffe, die in nicht-polaren Lösungsmitteln, wie Diäthyläther oder η-Hexan, normalerweise nur verhältnismäßig begrenzt löslich sind, sich in Lösungsmitteln, wie Wasser oder niederen Alkanolen, jedoch weit besser lösen. Die Antibiotika trans-BM123gamma.. und trans-BM123gamma₂ sind Strukturisomere und können durch folgende Strukturformeln widergegeben werden:

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HO

SC

«Ν X

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- vf-

Z t

X U

X Z

IN

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Hl

Die reduktive Alkylierung von trans-BMi23, trans-BM123gamma.., trans-BM123ganuna₂, cis-BMi23gamma, cis-BM^Sgamma.. oder cis-BMi23ganuna_ mit Ketonen greift an der Spermadinseitenkette an, wodurch Derivate der Formel

CH=CH-C-NH- (CH₂) 3-rNH- (CH₃) ₄-NH-CH

entstehen, worin R für einen Rest der Formeln:

NH-C-H;

H NH

C=NH

NH-

oder

-C-HN

steht und die Substituenten R₂ sowie R₃ die oben angegebenen Bedeutungen haben.

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«Ο

Die reduktive Alkylierung von trans-BM123gamma, trans-BMi23gamma.₎, trans-BM123gamma₂, cis-BM123gamma, cis-BMi23gamma₁ oder cis-BMi23ganuna₂ mit Aldehyden greift ebenfalls an der Spermadinseitenkette an, wodurch mono-, di- und tri-substituierte Derivate der Formeln

=CH-C-NH-(CH,) -NII-

CH=CH-

CH-C-NH-(CH₂) -NH-(CH ) -N

³ ^{l q}

υ
-CH=CH-C-NH-(CH.J₁-N-(CH₀) -NH-CH₀-R₁

\—V y

-CH=CH-C-NH-

) j-N- (CH₂) ₄~n

CH₂-R₁

H₂-R₁

enstehen, worin R und R₁ die oben angegebenen Bedeutungen haben.

Die besonders günstige Wirksamkeit der cis-Isomeren der alkylierten Derivate von trans-BM123 wird durch ihre Fähigkeit nachgewiesen« letale systemische Infektionen von Mäusen zu bekämpfen. Diese neuen Substanzen zeigen bei Mäusen in vivo

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eine hohe antibakterielle Wirksamkeit gegenüber Escherichia coli US311, wenn man sie in einer subkutanen Einzeldosis an Gruppen von Carworth Farms CF-1-Mäusen mit einem Gewicht von etwa 20 g verabreicht, die intraperitoneal mit einer letalen Dosis dieser Bakterien in Trypticase-Sojabrühe TSP mit einer Verdünnung von 1O~ infiziert worden sind, wobei man eine 5-stündige TSP-Blutkultur verwendet. In der folgenden Tabelle VII ist die in vivo erhaltene antibakterielle Wirksamkeit typischer erfindungsgemäßer Produkte gegenüber Escherichia coli US311 an der Maus veranschaulicht.

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Tabelle

VII

Verbindung

Dosis in mg/kg Kör per g°wi ch t

Überlebende/Gesaratzahl der Prüfmause (7 Tage nach Infektion)

Cis-BM!23gamma

Cis-BM!23gamma

Cis-BM!23gamma

2 1 0,5

Orale Dosis

(mg/kg Körperge-

gewicht)

infizierte unbehandelte Kontrollen

4/5
1/5
1/5

Überlebende/Gesamtzahl der Prüfmause (7 Tage nach Infektion)

18/20 verendeten innerhalb 3 Tagen nach Infektion

Isopropyl-cis-	2,0	5/5
BM123gamma	1,0	5/5
	0,5	3/5
	0,25	1/5
	0,12	2/5
1-Propylpenty1-	2,0	5/5
cis-BMi23gamma	1,0	2/5
	0,5	0/5
	0,25	0/5
	0,12	0/5
1,5-Dimethyl-	2,0	5/5
4-hexenyl-cis-	1,0	5/5
BM12 3gamma	0,5	5/5
	0,25	0/5
	0,12	0/5
1-Benzyl-4-	2,0	5/5
piperidyl-	1,0	3/5
cis-BM!23gamma	0,5	0/5
	0,25	0/5
	0,12	0/5
infizierte unbe-		5/25
handelte Kontrollen		(3 Tage nach Infektion)

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Fertnentationsverf ahren zur Herstellung ν on vorw i ° 9 e. η d BM1 2 3

Die Züchtung von Nocardia sp. NRRL 8050 kann in einer großen Zahl verschiedener flüssiger Kulturmedien durchgeführt werden. Medien, die sich für die Erzeugung dieses neuen antibakteriellen Mittels eignen, enthalten eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, zum Beispiel Stärke, Zucker, Melasse oder Glycerin, eine assimilierbare Stickstoffquelle, z.B. Protein, Protelnhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren oder Maisquellwasser sowie anorganische Anionen und Kationen, wie Kalium, Magnesium, Calcium, Ammonium, Sulfat, Carbonat, Phosphat und Chlorid. Spurenelemente wie Bor, Molybdän und Kupfer liegen als Verunreinigungen anderer Bestandteile des Mediums vor. Die Belüftung in Tanks und Flaschen erfolgt durch Durchleiten von steriler Luft durch das garende Medium oder Aufblasen von steriler Luft auf die Oberfläche des Mediums. Außerdem wird in Tanks durch mechanische Mittel für Bewegung gesorgt. Je nach Bedarf kann ein Entschäumer wie Specköl (Hodag (R), FD 82) zugesetzt werden.

Inokulumherstellung für.BM123ß und trans-BM123

Ein Schüttelkolbeninokulum von Nocardia sp. NRRL 8050 wird durch Beimpfen von 100 ml sterilem flüssigem Medium in 5OO ml-Kolben mit abgeschabten oder abgewaschenen Sporen einer Schrägagerkultur hergestellt. Ein geeignetes Medium ist beispielsweise folgendes:

Bac to-trypton	5 g
Hefeextrakt	5 g
Rindfleischextrakt	3 g
Glucose	10 g
Wasser auf	1000 ml

Die Kolben werden bei einer Temperatur von 25 bis 29 ⁰C, vorzugsweise 28 ⁰C, unter kräftiger Bewegung auf einer Drehschüttelvorrichtung 3O bis 48 Stunden inkubiert. Die Inokula werden dann in sterile Kulturrohre mit Schraubverschlüssen überführt

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und unter -18 ⁰C gelagert. Diese Reihe von vegetativem Inokulum wird anstelle von Schrägagarabschabungen zur Beimpfung weiterer SchJttelkolben zur Herstellung dieses Inokulums der ersten Stufe verwendet.

Diese Inokula der ersten Stufe werden dann zum Beimpfen von 12 Liter-Ansätzen des gleichen Mediums in gläsernen Fermentatonsgefäßen mit einem' Fassungsvermögen von 20 Liter verwendet. Die Maische wird mit steriler Luft behandelt, während die Züchtung 3O bis 48 Stunden fortgesetzt wird.

Die 12-Liter-Ansätze der Inokula der zweiten Stufe werden zum Beimpfen von Fermentationstanks verwendet, die 300 Liter des folgenden sterilen flüssigen Mediums enthalten, wodurch Inokulum der dritten und letzten Stufe erzeugt wird:

lösliche Fleischstoffe	15	g
Ammoniumsulfat	3	g
Kaliumphosphat, zweibasisch	3	g
Calciumcarbonat	1	g
Magnesiumsulfat-heptahydrat	1,	5 g
Glucose	10	g
Wasser auf	1000	ml

Die Glucose wird gesondert sterilisiert.

Das Inokulum der dritten Stufe wird mit 0,4 bis 0,8 Liter steriler Luft je Liter Brühe und Minute belüftet, und die Gärmischung wird mit einem mit 150 bis 300 U/Min, betriebenen Rührer in Bewegung gehalten. Die Temperatur wird bei 25 bis 29 °C, gewöhnlich 28 ⁰C, gehalten. Die Züchtung wird 48 bis 72 Stunden fortgesetzt, wonach das Inokulum zum Beimpfen einer 3000 Liter Tankfermentation verwendet wird.

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Tankfermentation zur Erzeugung von BMI23ß und trans-BM123gamma

Zur Erzeugung von BM123B und trans-BM123gamma in Fermentationstanks wird in der Regel folgendes Medium verwendet:

lösliche Fleischstoffe 30 g

Ammoniumsulfat 6 g

Kaliumphosphat, zweibasisch 6 g

Calciumcarbonat 2 g

Magnesiumsulfat-heptahydrat 3 g

Glucose 20 g

Wasser auf 1000 ml

Die Glucose wird gesondert sterilisiert.

Jeder Tank wird mit 5 bis 10 % des wie oben beschrieben hergestellten Inokulums der dritten Stufe beimpft. Die Fermentationsmaische wird bei einer Temperatur von 25 bis 28 ⁰C, gewöhnlich bei 26 ⁰C gehalten. Die Belüftung wird durch Zufuhr von 0,3 bis 0,5 Liter sterile Luft je Liter Maische und Minute bewirkt, und die Gärmischung wird durch einen mit 70 bis 100 U/Min, betriebenen Rührer bewegt. Die Fermentation wird gewöhnlich 65 bis 90 Stunden forgesetzt, wonach die Maische aufgearbeitet wird.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1 Bereitung dee Inokulums für BM123B und trane-BM123gamma

Ein beispielhaftes Medium, das zur Züchtung des Inokulums der ereten und zweiten Stufe verwendet wird, wird aus folgenden Bestandteilen hergestellt:

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Bacto-trypton 5 g

Hefeextrakt 5 g

Rindfleischextrakt 3 g

Glucose 1Og

Wasser auf 1OOO ml

Zwei 500 ml-Kolben, die jeweils 1OO ml des oben angegebenen sterilen Mediums enthalten, werden mit je 5 ml eines gefrorenen vegetativen Inokulums von Nocardia sp. NRRL 8050 beimpft. Die Kolben werden auf eine DrehschütteIvorrichtung aufgebracht und 48 Stunden bei 28 ⁰C kräftig bewegt. Das so erhaltene Kolbeninokulum wird in ein Glasfermentationsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 19 Litern überführt, das 12 Liter des oben beschriebenen sterilen Mediums enthält. Die Maische wird mit steriler Luft belüftet, während die Züchtung etwa 48 Stunden geführt wird. Danach werden die Gefäßinhalte zum Besamen eines 380 Liter-Fermentationstanks verwendet, der 300 Liter des folgenden sterilen flüssigen Mediums enthält:

lösliche Fleischstoffe	15	g
Axnmoniumsulfat	3	g
Kaliumphosphat, zweibasisch	3	g
Calciumcarbonat	1	g
Magnesiumsulfat-heptahydrat	1,	5 g
Glucose	10	g
Wasser auf	1000	ml

Die dritte Stufe der Inokulummaische wird mit steriler Luft, die in einem Verhältnis von 0,4 Liter Luft je Liter Maische und Minute in das Fermentationsgefäß eingeführt wird, belüftet. Be" wegung wird durch einen mit 240 Umdrehungen pro Minute betriebenen Rührer erzielt. Die Maische wird bei 28 ⁰C gehalten, und als Entschalungsmittel wird Hodag¹ ' FD82 verwendet. Nach 48-stUndigem Wachstum wird die Inokulummaische zum Besamen einer 3000 Liter-Fermentation verwendet.

909838/O?'**

Beispiel 2

Fermentation unter Verwendung von Nocardia sp. NRRL 8050 zur Herstellung von BMI 23 und trans-BH123gamma

Ein Fermentationsmedium wird aus den folgenden Bestandteilen hergestellt:

lösliche Fleischstoffe 30 g

Ammoniumsulfat 6 g

Kaliumphosphat, zweibasisch 6 g

Calciumcarbonat 2 g

Magneslumsulfat-heptahydrat 3 g

Glucose 20 g

Wasser auf 1OOO ml

Die Glucose wird gesondert sterilisiert.

Das Fermentationsmedium wird 60 Minuten bei 120 ⁰C mit Dampf von einem Druck von 1,4 kg/cm² sterilisiert. Danach liegt der pH-Wert des Mediums bei 6,9. 3000 Liter des sterilen Mediums in einem Fermentationstank mit einem Fassungsvermögen von 4000 Liter werden mit 300 Liter des in Beispiel 1 beschriebenen Inokulums beimpft, und die Fermentation wird unter Verwendung von Hodag* ' FD82 als Entschäumungsnittel bei 26 ⁰C geführt. Das Belüftungsverhältnis liegt bei 0,35 Liter sterile Luft je Liter Maische und Minute. Die Maische wird mit Hilfe eines mit 70 bis 72 U/Min, angetriebenen Rührers in Bewegung gehalten. Nach einer Fermentationsdauer von 67 Stunden wird die Maische aufgearbeitet.

Beispiel 3
Isolierung von BM123ß und trans-BM123gamma

3000 Liter der nach Beispiel 2 erzeugten Fermentationsmaische vom pH 4,3 werden mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,0

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- 14 -

eingestellt und unter Verwendung von 5 % Diatomeenerde als Filterhilfe filtriert. Der Filterrückstand wird mit etwa 100 Liter Wasser gewaschen und verworfen. Das mit dem Waschwasser vereinigte Filtrat wird durch drei parallel angeordnete Säulen aus rostfreiem Stahl mit den Abmessungen 21 χ 122 cm, deren jede 15 Liter CM-Sephadex^(R) C-25 /NaV-Harz (nämlich ein von Pharmacia Fine Chemicals, Inc. erhältliches vernetztes Dextran-epichlorhydrin-Kationenaustauschergel) enthält, von unten nach oben gepumpt. Die beladenen Säulen werden mit insgesamt etwa 390 1 Wasser gewaschen und hierauf zuerst mit 200 1 einprozentigem wässrigem Natriumchlorid und anschließend mit 560 1 5-prozentigem wässrigem Natriumchlorid entwickelt. Das mit 5-prozentigem wässrigem Natriumchlorid erhaltene Eluat wird durch Diatomeenerde filtriert, und das klare Filtrat leitet man durch eine Glassäule mit den Abmessungen 23 χ 152 cm, die 25 1

(R)

granulierte Aktivkohle Darco G-60 mit einer Teilchengröße von 0,8 bis 0,4 mm (nämlich eine von Atlas Chemical Industries, Inc. erhältliche granulierte Aktivkohle) enthält. Die beladene Säule wird mit 120 1 Wasser gewaschen, worauf man sie zuerst mit 120 1 15-prozentigem wässrigem Methanol, sodann mit 340 1 50-prozentigem wässrigem Methanol und abschließend mit 120 1 50-prozentigem wässrigem Aceton entwickelt. Das mit dem 15-prozentigem wässrigem Methanol erhaltene Eluat konzentriert man unter Vakuum zu etwa 7 Litern einer wässrigen Phase und stellt dessen pH-Wert mit Amberlite*^R) IR-45 (OH")-Harz (nämlich einem schwach basischen Anionenaustauscherharz auf Basis Polystyrol-Polyamin) auf 4,5 bis 6,0 ein. Das Harz wird durch Filtrieren entfernt, und das Filtrat wird unter Vakuum auf etwa 1 1 eingeengt und anschließend lyophilisiert, wodurch man 38 g eines Ma terials erhält, das vorwiegend aus BM123 zusammen mit einer geringen Menge trans-BM123gamma (vorwiegend trans-BMi23gamma₂) enthält. Das mit dem 50-prozentigen wässrigen Methanol erhaltene Eluat stellt man mit AmberIite ^(R) IR-45 (OH~)-Harz auf pH 4,65 bis 6,0 ein. Das Harz wird dann durch Filtrieren

909838/0714

- MT-

entfernt, worauf man das FiItrat unter Vakuum auf etwa 6,3 1 einengt und anschließend filtriert. Auf diese Weise erhält man 213 g eines Materials, das vorwiegend aus trans-BM123gamma besteht. Das mit 50-prozentigem wässrigem Aceton erhaltene Eluat wird mit Amberlite*^R* IR-45 (OH~)-Harz auf pH 4,0 bis 6,0 eingestellt. Das Harz wird abfiltriert, und das Filtrat engt man unter Vakuum auf etwa 1,5 1 ein. Durch Lyophilisieren dieses Konzentrats gelangt man zu 56 g unreinem trans-BM123.

Beispiel 4 Weitere Reinigung von trans-BMi23gamma

Eine Aufschlämmung von CM Sephadex^v ' C-25 /ΝΗ._/ in 2-prozentigem wässrigem Ammoniumchlodid wird in eine Glassäule von 2,6 cm Durchmesser bis zu einer Harzhöhe von etwa 62 cm gegossen. Der Überschuß an 2-prozentiger wässriger Ammoniumchloridlösung wird ablaufen gelassen, und 5,0 g des wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellten trans-BMi23garama werden in etwa 10 ml 2-prozentigem wässrigem Ammoniumchlorid gelöst und auf die Säule aufgegeben. Die Säule wird dann mit jeweils 6 Liter 2- und 4-prozentigem wässrigem Ammoniumchlorid eluiert. Fraktionen von jeweils etwa 75 ml werden automatisch alle 15 Minuten aufgefangen. Durch überwachung des Ausflusses aus der Säule im Ultraviolettlicht und durch Bioautographie von getränkten Papierscheiben auf großen Agarplatten, die mit Klebsiella pneumoniae, Stamm AD, besamt sind, wird das Antibioticum trans-BMi23gamma festgestellt. Der größte Teil des trans- BM123gamma befindet eich in den Fraktionen 71 bis 107.

(al

130 ml granulierte Aktivkohle (Darco* , 0,4 bis 0,8 mm) werden in Wasser suspendiert, in eine Glassäule gegeben und abbitten gelassen, und der Wasserüberschuß wird abtropfen gelassen. Die

I0MII707U

Fraktionen 84 bis 96 der vorstehend beschriebenen Chromatographie mit CM Sephadex werden vereinigt und durch die Säule mit Kohlegranulat geleitet. Die beladene Säule wird mit 6OO ml Hasser gewaschen und mit 1 1 20-prozentigem wässrigem Methanol und anschließend mit 1 1 50-prozentigem wässrigem Aceton entwickelt. Diese Eluate, die beide trans-BMi23gamma enthalten, werden im Vakuum bis zum Verbleib von wässrigen Phasen konzentriert und dann lyophylisiert, wodurch insgesamt 886 mg trans-BM123gamma als Hydrochlorid erhalten werden. Durch Wiederholung der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise wird eine Mikroanalysenprobe erhalten.

Das Antibiotikum trans-BM123gamma hat keinen definierten Schmelzpunt; seine allmähliche Zersetzung beginnt bei etwa 200 ⁰C. Die Mikroanalyse einer Probe, die 24 Stunden bei 22 ⁰C und einer relativen Feuchtigkeit von 23 % gehalten wird, ergibt folgende Werte: C 39,44 %; H 6,10 %; N 16,19 %; Cl (ionisch) 11,54 %;

Trocknungsverlust 8,19 %. In Wasser ergibt trans-BMi23gamma

1 % ein UV-Absorptionsmaximum bei 286 nm, E' = 250. Die Lage dieses Maximums verändert sich mit dem pH-Wert nicht. Trans-BMi23gamma hat eine spezifische Drehung von /alpha/- = +71 (c * 0,97 in Wasser).

Das Antibiotikum trans-BM123gamraa zeigt charakteristische Absorptionen im infraroten Bereich des Spektrums bei folgenden Wellenlängen: 770, 830, 870, 930, 980, 1035, 1105, 1175, 1225, 1300, 1340, 1370, 1460, 1510, 1555, 1605, 1660, 1740, 2950 und 3350 cm"¹.

Beispiel 5 Isolierung von trans-BMi23gamma

Eine Aufschlämmung von CM Sephadex* ' C-25 /Na_/ in 2-prozentigem wässrigem Natriumchlorid wird bis zu einer Harzhöhe von etwa 70 cm in eine Glassäule vom Durchmesser 2,6 cm gegossen.

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Der Überschuß an 2-prozentigem wässrigem Natriumchlorid wird abgezogen und 4,11 g einer Probe, die hauptsächlich trans-BMi23gamma.. neben etwas trans-BM123gamma₂ und anderen Verunreinigungen enthält und wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt war, werden als Lösung in etwa 10 ml 2-prozentigem wässrigem Natriumchlorid auf die Säule aufgegeben. Die Säule wird mit je 4 1 2-prozentiger bzw. 4-prozentiger wässriger Natriumchloridlösung eluiert. Fraktionen von etwa 75 ml werden alle 15 Minuten automatisch gesammelt. Durch Überwachung des Säulenabflusses im Ultraviolettlicht und durch Bioautographie getränkter Papierscheiben auf großen Agarplatten, die mit Klebsiella pneumoniae, Stamm AD, besamt sind, wird festgestellt, daß sich der Hauptteil des trans-BM123gamma in den Fraktionen 64 bis 90 befindet, wobei die ersten Fraktionen (64 bis 80) ein Gemisch aus trans-BMi23gamma.. und trans-BM123gamma₂ und die späteren Fraktionen (81 bis 90) praktisch reines trans-BM123gamma₁ enthalten.

100 ml Aktivkohle in Granulatform (Darco , O,4 bis 0,8 mm) werden in Wasser suspendiert, in eine Glassäule gegeben und absitzen gelassen, und das überschüssige Wasser läßt man ablaufen. Die Fraktionen 81 bis 90 der vorstehend beschriebenen Chromatographie werden vereinigt und durch die Säule mit Kohlegranulat geleitet. Die beladene Säule wird mit 500 ml Wasser gewaschen und dann mit 500 ml 10-prozentigem wässrigem Methanol und anschließend mit 1 1 50-prozentigem wässrigem Methanol entwickelt. Das mit 50-prozentigem wässrigem Methanol erhaltene Eluat, das den Hauptteil des trans-BMi23gamma₁ enthält, wird mit Amberlite¹*' IR-45 (OH )-Harz von pH 5,9 auf 6,0 eingestellt. Nach Abfiltrieren des Harzes wird das Filtrat im Vakuum bis zu einer wässrigen Phase eingeengt, die lyophllisiert wird. Man erhält so 294 mg amorphes trans-BM123gamma₁ als Hydrochlorid.

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- ve-

Das Antibiotikum trans-BMi23gamma.. hat keinen definierten Schmelzpunkt, aber seine allmähliche Zersetzung beginnt bei. etwa 200 ⁰C. Die Mikroanalyse einer Probe, die 24 Stunden bei 21 ⁰C und 60 % relativer Feuchtigkeit gehalten wurde, ergibt folgende Werte: C 37,84 %; H 5,73 %; N 15,58 %; Cl (ionisch) 10,01 %; Trocknungsverlust 10,45 %. In Methanol zeigt trans-

1 % BMi23gamma₁ ein UV-Absorptionsmaxima bei 286 nm, E' = 225.

Die Lage dieses Maximums ändert sich mit dem pH-Wert nicht. Trans-BM123gamma₁ hat eine spezifische Drehung von + 55° (c = 0,803 in Wasser).

Das Antibiotikum trans-BM123gamma.. zeigt charakteristische Absorptionen im Infrarotbereich des Spektrums bei folgenden Wellenlängen: 770, 830, 870, 930, 980, 1045, 1080, 1110, 1125, 1175, 1225, 1305, 1345, 1380, 1465, 1515, 1560, 1605, 1660, 173O, 2950 und 3350 cm"¹.

Beispiel 6 Isolierung von trans-BMi23gamma₂

25 g einer hauptsächlich trans-BM123gamma₂ und BM123B ent haltenden, wie in Beispiel 3 beschriebenen hergestellten Probe werden in etwa 120 ml 2-prozentigem wässrigem Natriumchlorid gelöst und auf eine Säule aufgegeben, die 1800 ml CM Sephadex C-25 /Na__/ in 2-prozentigem wässrigem Natriumchlorid enthält. Die Säule wird mit je 20 1 2-prozentiger bzw. 4-prozentiger wässriger Natriumchloridlöeung eluiert. Die ersten 12 1 Eluat werden in einem großen Gefäß gesammelt und verworfen. Danach werden Fraktionen von jeweils etwa 800 ml alle 40 Minuten automatisch gesammelt. Durch überwachung des

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Säulenabflusses im Ultraviolettlicht wird festgestellt, daß sich der Hauptteil des trans-BM123gamma in den Fraktionen 7 bis 18 befindet, wobei die ersten Fraktionen (7 bis 15) praktisch reines trans-BM123gamma₂ und die späteren Fraktionen (16 bis 18) ein Gemisch aus trans-BMi23gamma₁ und trans-BMi23gamma₂ enthalten.

(R) 6OO ml Aktivkohle in Granulatform (Darco , 0,4 bis 0,8 mm) werden in Wasser suspendiert, in eine Glassäule gegeben und absitzen gelassen, und das überschüssige Wasser läßt man ablaufen. Die Fraktionen 7 bis 15 der vorstehend beschriebenen Chromatographie werden vereinigt und durch die Säule mit Kohlegranulat geleitet. Die beladene Säule wird mit 3 1 Wasser gewaschen und dann mit 3 1 10-prozentigem wässrigem Methanol und anschließend mit 6 1 50-prozentigem wässrigem Methanol entwickelt. Das mit 10-prozentigem wässrigem Methanol erhaltene Eluat wird mit Amberllte^v ' IR-45 (OH )-Harz von pH 5,8 auf 6,O eingestellt. Nach Abfiltrieren des Harzes wird das Filtrat im Vakuum bis zu einer wässrigen Phase eingeengt, die lyophilisiert wird. Man erhält so 595 mg weißes amorphes trans-BMi23gamma, als Hydrochlorid. Das Eluat mit 50-pro-

(R) zentigem wässrigem Methanol wird mit Amberlite ' IR-45

(OH~)-Harz von pH 4,6 auf 6,1 eingestellt. Nach Abfiltrieren des Harzes wird das Filtrat im Vakuum bis auf eine wässrige Phase eingeengt und lyophilisiert. Man erhält so 3,645 g etwas weniger reines weißes amorphes trans-BM123gamma₉ als Hydro-Chlorid.

Das Antibioticum trans-BMi23gamma₂ hat keinen definierten Schmelzpunkt, aber seine allmähliche Zersetzung beginnt bei etwa 200 ⁰C. Die Mikroanalyse einer Probe, die 24 Stunden bei 21 ⁰C und 60 % relativer Feuchtigkeit gehalten wurde, ergibt folgende Werte: C 36,14 %; H 5,67 %; N 15,1 %; Cl (ionisch) 11/11 t; Trocknungeverlust 10,87 %. In Methanol zeigt trans-BM123gamma₂ ein UV-Absorptionsmaximum bei 286 nm, Ej ^_n =» 220.

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Die Lage dieses Maximums ändert sich mit dem pH-Wert nicht. Trans-BM123gamma₂ hat eine spezifische Drehung von +60 ° (C = 0,51 in Wasser).

Das Antibioticum trans-BM123gamma₂ zeigt charakteristische Absorptionen im Infrarotbereich des Spektrums bei folgenden Wellenlängen: 770, 830, 870, 950, 98O, 1035, 1110, 1175, 1225, 1285, 1345, 1380, 147O, 1515, 1560, 1605, 1660, 1755, 2950 und 3350 cm"¹.

Beispiel 7 Papierverteilungs- und Dünnschichtchromatographie von BM123ß

und trans-BMi23gamma

Die antibakteriellen Mittel können durch Papierchromatographie voneinander unterschieden werden. Zu diesem Zweck werden auf Streifen aus Whatman No. 1-Papier Flecken von wässrigen oder methanolischen Lösungen der Substanzen aufgebracht, worauf

1 bis 2 Stunden in Gegenwart der oberen und unteren Phasen equilibriert wird. Die Streifen werden über Nacht mit der unteren (organischen) Phase entwickelt, die aus einer Mischung von 90-prozentigem Phenol:m-Cresol:Essigsäure:Pyridin:Wasser (100 : 25 : 4 : 4 : 75, jeweils Volumen) erhalten wird. Die Streifen werden aus der Chromatographierkammer entfernt, 1 bis

2 Stunden an der Luft getrocknet, zur Entfernung von noch vorhandenem Phenol mit Äther gewaschen und auf großen Agarplatten die mit K. pneumoniae besamt sind, bioautographiert. Typische R.-Werte gehen aus folgender Tabelle VIII hervor:

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Tabelle VIII Komponente Rf-Werte

trans-BMi23gamma 0,85

BM123B 0,50, 0,70

Die ß-Komponente ist bei Verwendung dieses Systems ein Gemisch aus 2 Antibiotika. Das BM123B setzt sich zusammen aus einem größeren Teil eines als BM123B.. bezeichneten Antibiotikums (Rf = 0,50) und einem kleineren Teil eines als BM123ß₂ benannten Antibiotikums (Rf = 0,70).

Die Antibiotika BM123 lassen sich ferner auch dünnschicht-

chromatographisch unterscheiden. Zu diesem Zweck betupft

(R)
man vorbeschichtete Cellulose F -Platten (mit einer Stärke von 0,10 mm), nämlich eine Pormdickschichtcellulose, wie sie von EM Laboratories Inc., Elmsford, N.Y. erhältlich ist, mit einer Wasserlösung der zu chromatographierenden Substanz (20 bis 40 Mikrogramm pro Tupfer). Die Platten entwickelt man dann über Nacht mit einem Lösungsmittelgemisch aus 1-Butanol, Wasser, Pyridin und Essigsäure (15:12:10:1 auf Volumenbasis). Die entwickelten Platten werden anschliessend aus der Chromatographenkammer entnommen und etwa 1 Stunde an der Luft getrocknet. Die Dedektion der Antibiotika erfolgt in üblicher Weise durch Besprühen mit entweder Ninhydrin oder einem Sakaguchi-Reagens. Typische dabei erhaltene Rf-Werte gehen aus folgender Tabelle IX hervor:

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	4T SS	1	e	0	IX	0,23	2709880
Tab	e 1			0		0,14
Komponente
BM123gairana			Rf-Werte
BM123B			,17,
	,08,

Sowohl BM123B als auch trans-BM123gamma sind bei Verwendung dieses Systems Gemische aus zwei Bestandteilen. Das BM123ß enthält als überwiegende Komponente 614123B₁ (Rf = 0,08) und als geringere Komponente BM123ß₂ (Rf = 0,14). Die weniger polare Komponente von trans-BM123 (Rf = 0,23) ist das trans-BMi23gamma₁, und die stärker polare Komponente (Rf = 0,17) ist das trans-BM123gamma,,.

Beispiel 8

Allgeraeines Verfahren zur reduktlven Alkylierung von Antibiotikum trans-BMi23gamma oder Antibiotikum cis-BMi23gamma

Eine Lösung von 100 mg Antibiotikum trans-BMi23gamma oder Antibiotikum cis-BMi23gamme in 20 ml Methanol versetzt man unter Rühren mit 5 ml (oder 5 g) des entsprechenden Aldehyds oder Ketons sowie 100 mg Natriumcyanoborhydrid. Unter Verwendung von O,1 η methanolischem Chlorwasserstoff hält man den pH-Wert der erhaltenen Lösung über eine Zeitspanne von 3 bis 24 Stunden auf etwa 7,0. Der Fortgang der Reaktion wird dünnschichtgromatographisch bis zum Verschwinden des als Ausgangsmaterial verwendeten Antibiotikums überwacht. Das Reaktionsgemisch wird dann abfiltriert, worauf man das FiI-trat zur Trockne eindampft. Der dabei erhaltene Rückstand wird

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mit 3 ml Methanol behandelt, worauf man erneut filtriert. Das Filtrat wird mit 50 ml Aceton verdünnt, und der dabei entstandene Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Anstelle des oben als Lösungsmittel verwendeten Methanols kann man auch 20 ml Wasser verwenden, wenn man es mit einem wasserlöslichen Aldehyd oder Keton als Ausgangsmaterial zu tun hat.

Beispiel 9 Methyl-trans-BMI2 3gamma

Eine Lösung von 1,0 g trans-BM123gamma und 2,5 ml einer 37-prozentigen wässrigen Formaldehydlösung in 50 ml Wasser wird portionsweise mit 400 mg Natriumcyanoborhydrid versetzt. Während der Zugabe hält man den pH-Wert des Reaktionsgemisches unter Verwendung von 1 η Chlorwasserstoffsäure auf 7,0. Das Reaktionsgemisch wird hierauf weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der dabei erhaltene Rückstand wird mit 20 ml Methanol behandelt, worauf man das Ganze filtriert und das Filtrat mit 250 ml Aceton verdünnt. Das dabei ausgefallene Produkt wird abfiltriert und getrocknet. Ausbeute 667 mg.

Beispiel 10 Isopropyl-trans-BMI23 gamma

Eine Lösung von 200 mg trans-BM123gamma in 30 ml Methanol wird mit 5 ml Aueton versetzt, worauf man 139 mg Natriumcyanoborhydrid zugibt und das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur rührt, wahrend dieser Zeit hält man den pH-Wert des Reaktionsgemieches durch Zugabe 1 η methanolischer Chlorwasserstoff lösung zwischen 7,4 und 7,8. Der dabei entstandene

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geringe Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 2 ml Methanol behandelt, worauf man erneut filtriert. Das Filtrat wird mit 1OO ml Aceton verdünnt, worauf man das erhaltene Festprodukt abfiltriert und trocknet. Ausbeute 184 mg.

Beispiel 11 ß-Phenyläthyl-trans-BMi23gamma

Eine Lösung von 200 mg trans-BM123gamma in 15 ml Wasser und 25 ml Acetonitril versetzt man mit einer Lösung von 2 ml Phenylacetaldehyd in 4 ml Äthanol. Sodann werden 1O3 mg Natriumcyanoborhydrid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird anschließend 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, wobei man den pH-Wert des Gemisches mit 0,2 η Chlorwasserstoffsäure auf 7 hält. Anschließend filtriert man das Reaktionsgemisch und dampft das erhaltene Filtrat unter Vakuum zur Trockne ein. Der angefallene Rückstand wird mit 2 ml Methanol behandelt, worauf man erneut filtriert. Das Filtrat wird mit 100 ml Aceton verdünnt, worauf man das Produkt abfiltriert und trocknet. Ausbeute 180 mg.

Beispiel 12 1 , 3,3-Trimethylbuty1-trans-BMi23gamma

Eine Lösung von 200 mg trans-BMi23gamma-hydrochlorid in 5O ml Methanol versetzt man mit 3 ml 4,4-Dimethy1-2-pentanon und 106 mg Natriumcyanoborhydrid. Die Reaktionslösung hält man durch tropfenweisen Zusatz methanol!scher Chlorwasserstofflösung auf pH 7. Das Reaktionsgemisch wird 18 Stunden bei

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Raumtemperatur gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wird unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Den Rückstand löst man in 3 ml Methanol, worauf man das Ganze mit 50 ml Aceton verdünnt und filtriert. Ausbeute 125 mg.

Beispiel 13 1-Methylphenyläthyl-trans-BM12 3gamma

Eine Lösung von 200 mg trans-BMi23gamma in 50 ml Methanol wird mit 5 ml Phenylaceton versetzt. Die Lösung versetzt man dann mit 170 mg Natriumcyanoborhydrid und rührt das Reaktionsgemisch 3,5 Stunden bei Raumtemperatur. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert des Gemisches durch Zusatz von mit Chlorwasserstoffgas gesättigtem Methanol auf 7,0. Das Reaktionsgemisch wird dann auf ein Volumen von etwa 5 ml eingeengt, mit 2 ml Methanol verdünnt und filtriert. Das Filtrat gießt man in 100 ml Aceton, worauf man das anfallende feste Produkt abfiltriert und trocknet. Ausbeute 233 mg.

Beispiel 14 1-Methylnonyl-trans-BMi23gamma

Eine Lösung von trans-BM123gamma (200 mg) und 2-Decanon (1 ml) in 40 ml Methanol wird mit Natriumcyanoborhydrid (100 mg) versetzt. Der pH-Wert der Lösung wird auf 7,0 eingestellt und erforderlichenfalls durch Zugabe 0,1 η methanolischer Chlorwasserstoff lösung auf 7,0 - 0,2 gehalten. Nach 19,5 Stunden langer Umsetzung wird das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat unter Vakuum bei 35 ⁰C konzentriert. Der Rückstand

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wird in 5 ml Methanol aufgeschlämmt, worauf man das Ganze filtriert. Das Filtrat wird zu 50 ml Aceton gegeben. Der dabei ausfallende weißliche Feststoff wird abfiltriert,, mit Aceton gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an rohem 1-Methylnonyl-trans-BM123gamma beträgt 167 mg.

Beispiel 15 1, 3-Dimethylbutyl-trans-BMi23gamma

Eine Lösung von 210 mg trans-BM123gamma in 50 ml Methanol wird mit 5 ml Methylisobutylketon versetzt. Sodann versetzt man die Lösung mit 166 mg Natriumcyanoborhydrid und rührt das Reaktionsgemisch 5 Stunden bei Raumtemperatur. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zugabe von mit Chlorwasserstoffgas gesättigtem Methanol auf 7,0. Sodann wird das Reaktionsgemisch unter Vakuum zur Trockne eingedampft, worauf man den Rückstand mit 2 ml Methanol behandelt, das Ganze filtriert und das Filtrat mit 100 ml Aceton verdünnt. Das dabei erhaltene feste Produkt wird ab filtriert und getrocknet. Ausbeute 210 mg.

Beispiel 16 Isopropyl-trans-BMi23gamm₁

Ein Gemisch aus 50 mg trans-BM123gamma.., 5 ml Aceton und 60 mg Natriumcyanoborhydrid in 35 ml Methanol wird 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Den pH-Wert der Lösung hält man durch tropfenweise Zugabe methanollecher Chlorwasserstofflösung auf

909838/0714

Anschließend dampft man das Gemisch unter Vakuum zur Trockne ein, behandelt den erhaltenen Rückstand mit 5 ml Äthanol und verdünnt die Lösung mit 50 ml Aceton. Auf diese Weise gelangt man zu 49 mg Produkt.

Nach dem oben beschriebenen Verfahren, jedoch unter Ersatz des Acetons durch die in der folgenden Tabelle angegebenen jeweiligen Carbonylverbindungen als Ausgangsmaterialien gelangt man zu den angeführten entsprechenden alkylierten Produkten.

Ausgangsmaterial Produkt

Formaldehyd Methyl-trans-BM123gamma..

Acetaldehyd Äthyl-trans-BM123gamma.

Propionaldehyd n-Propyl-trans-BMi23gamma₁

n-Butyraldehyd n-Butyl-trans-BMi23gamma.

Isobutyraldehyd Isobutyl-trans-BMi23gamma.

2-Butanon see.-Butyl-trans-BMI23gamma₁

3-Pentanon 1-Äthylbutyl-trans-BMi23gamma.

Methylisobutylketon 1,3-Dimethylbutyl-trans-

BMi23gamma₁

⁺In Form einer 37-prozentigen wässrigen Lösung in Wasser als Lösungsmittel anstelle von Methanol.

Beispiel 17 l8opropyl-trans-BMi23gamma₂

Ein Gemisch aus 41 mg trans-BMi23gamma₂, 5 ml Aceton und 50 mg Natriumcyanoborhydrid in 35 ml Methanol wird 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Den pH-Wert der Lösung hält man durch tropfenweise Zugabe einer methanol!sehen

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Chlorwasserstofflösung (gesättigt) auf 7. Das Gemisch wird filtriert und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Den Rückstand behandelt man mit 5 ml Methanol, und die erhaltene Lösung wird mit 50 ml Aceton verdünnt. Auf diese Weise erhält man 46 mg Produkt.

Nach obigem Verfahren, jedoch unter Ersatz des Acetons durch die aus der folgenden Tabelle hervorgehenden Carbonylverbindungen als Ausgangsmaterialien gelangt man zu den angeführten entsprechenden alkylierten Produkten.

Ausgangsmaterial Produkt

Formaldehyd Methyl-trans-BMi23gamma₂

Acetaldehyd Äthyl-trans-BM123gamma-

Propionaldehyd n-Propyl-trans-BMi

n-Butyraldehyd n-Butyl-trans-BMi2

Isobutyraldehyd Isobutyl-trans-BM123gamma₂

2-Butanon see.-Butyl-trans-BMi2 3gamma₂

3-Pentanon 1-Äthylbutyl-trans-BMi2 3gamma₂

Methylisobutylketon 1,3-Dimethylbutyl-trans-

BMi23gamma₂

In Form einer 37-prozentigen wässrigen Lösung in Wasser als Lösungsmittel anstelle von Methanol.

Beispiel 18 1-Methyl-2-phenyläthy1-trans-BM12 3gamma₂

Ein Gemisch auf 200 mg trans-BMi23gamma₂, 5 ml Phenylaceton und 170 mg Natriumcyanoborhydrid in 50 ml Methanol wird 3,75 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert dieses Reaktionsgemisches durch tropfen

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weise Zugabe methanolischer Chlorwasserstofflösung (gesättigt) auf 7. Sodann wird das Gemisch unter Vakuum zur Trockne eingedampft, worauf man den Rückstand mit 5 ml Methanol behandelt und die erhaltene Methanollösung mit etwa 5O ml Aceton verdünnt. Auf diese Weise erhält man 233 mg Produkt.

Beispiel 19 Isopropyl-cis-BMi23gamma

Ein Lösung von 200 mg Isopropyl-trans-BMi23gamma in 200 ml Wasser photolysiert man unter Verwendung einer Hanovia-Lampe in einem mit Wasser umspülten Dreihalskolben über eine Zeitspanne von 1 Stunde, und während dieser Zeit verschiebt sich das Maximum der Ultraviolettabsorption der Reaktionslösung von 290 niyU auf 275 m,u. Zur Gewinnung des gewünschten Produkts wird die Reaktionslösung anschließend lyophilisiert, wodurch man 160 mg Material erhält.

Die obige photolytische Reaktion überwacht man am besten, indem man zu verschiedenen Zeitpunkten Reaktionsproben entnimmt und deren Ultraviolettabsorption mißt. Die Reaktion ist beendet, sobald sich das Absorptionsmaximum von 290 m.u nach 275 m,u verschoben hat.

Unter Anwendung des obigen Verfahrens, jedoch Ersatz des darin verwendeten Isopropyl-trans-BM123gamma durch die in den Beispielen 16 und 17 aufgeführten Alkylderivate gelangt man zu folgenden Verbindungen:

709838/071/»

Methyl-cis-BM123gairana₁, Äthyl-cis-BM^Sgamma. , n-Propyl-cis-BMi23gamma₁, Isopropyl-cis-BMI23gamma.., n-Butyl-cis-BMi23ganuna₁, Isobutyl-cis-BM123gamma₁, sec.-Butyl-cis-BMi23ganuna₁, 1-Äthylbutyl-cis-BM123gamma₁, 1,3-Dimethylbutyl-cis-BM123ganuna_l, Methyl-cis-BMi23ganuna₂» Äthyl-cis-BMi23gamma₂f n-Propyl-cis-BM123gamma₂, Isopropyl-cis-BMI23gamma₂» n-Butyl-cis-BMi23gamma2» Isobutyl-cis-BM123gapuna₂» sek.-Butyl-cis-BM^Sganuna,» 1-Äthylbutyl-cis-BMi23garama₂f 1,3-Dimethylbutyl-cis-BMi23ganuna₂·

Beispiel 20 1-Propylpentyl-cis-BMi 23ganuna

Eine Lösung von 175 mg i-Propylpentyl-trans-BM^Sgamma in 175 ml Wasser und 45 ml Methanol bestrahlt man über eine Zeitspanne von 1_r25 Stunden mit einer Hochdruckultraviolettlampe. Durch anschließendes Eindampfen der Lösung unter Vakuum zur Trockne erhält man 169 mg Produkt.

Beispiel 21 1 , 5-Dimethyl-4-hexenyl-cis-BMi23gamma

Eine Lösung von 2CX) mg 1 ,S-Dimethyl^-hexenyl-trans-BM^Sgamma in 200 ml Wasser bestrahlt man unter Verwendung einer Hochdruckultraviolettlampe 1 Stunde. Durch nachfolgendes Gefriertrocknen der Lösung gelangt man zu 182 mg Produkt.

*09838/0714

Beispiel 22 1-Benzyl-4-piperidyl-cis-BM123qamma

Eine Lösung von 200 mg 1-Benzyl-4-piperidyl-trans-BMi23gamma in 2OO ml Wasser und 20 ml Methanol bestrahlt man 1 Stunde unter Verwendung einer Hochdruckultraviolettlampe. Die nachfolgende Gefriertrocknung dieser Lösung führt zu 125 mg Produkt.

Beispiel 23 3,5-Dimethylcyclohexyl-trans-BMI23gamma

Eine Lösung von 200 mg trans-BMi23gamma, 5 ml 3,5-Dimethylcyclohexanon und 200 mg Natriumcyanoborhydrid in 50 ml Methanol beläßt man 1 Stunde bei Raumtemperatur. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert der Lösung durch Zusatz einer gesättigten Lösung von Chlorwasserstoff in Methanol auf 7. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 3 ml Methanol behandelt und filtriert, worauf man das Filtrat mit 40 ml Aceton verdünnt. Auf diese Weise gelangt man zu 2OO mg Produkt.

Beispiel 24 2, 4-Dimethylcyclopentyl-trans-BMi 23gamma

Eine Lösung von 206 mg trans-BMi23gamma, 3 ml 2,4-Dimethy1-cyclopentanon und 104 mg Natriumcyanoborhydrid in 50 ml Methanol beläßt man 6 Stunden bei Raumtemperatur. Während

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- sr-

dieser Zeit hält man den pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer gesättigten Lösung von Chlorwasserstoff in Methanol auf 7. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 3 ml Methanol behandelt und filtriert, worauf man das Filtrat mit 40 ml Aceton verdünnt. Auf diese Weise erhält man 101 mg Produkt.

Beispiel 25 S-Methylcyclohexyl-trans-BM^Sgamma

Eine Lösung von 200 mg trans-BMi23gamma, 1,5 ml 3-Methylcyclohexanon und 200 mg Natriumcyanoborhydrid in 50 ml Methanol beläßt man 2 Stunden bei Raumtemperatur. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer gesättigten Lösung von Chlorwasserstoff in Methanol auf 7. Die Lösung wird dann mit 3 ml Methanol behandelt und filtriert, worauf man das Filtrat mit 40 ml Aceton verdünnt. Auf diese Weise erhält man 2OO mg Produkt.

Beispiel 26 2,4,4-Trimethylcyclopentyl-trans-BMi23gamma

Eine Lösung von 200 mg trans-BMi23gamma, 5 ml 2,4,4-Trimethylcyclopentanon und 179 mg Natriumcyanoborhydrid in 50 ml Methanol beläßt man 24 Stunden bei Raumtemperatur. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer gesättigten Lösung von Chlorwasserstoff in Methanol auf 7. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 3 ml Methanol behandelt und filtriert, worauf man das Filtrat mit 40 ml Aceton verdünnt. Auf diese Weise erhält man 176 mg Produkt.

709838/071

Beispiel 27 2-Methylcyclopentyl-trans-BM123gamma

Eine Lösung von 211 mg trans-BM123gamma, 3 ml 2-Methylcyclopentanon und 98 mg Natriumcyanoborhydrid in 50 ml Methanol beläßt man 3,5 Stunden bei Raumtemperatur. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer gesättigten Lösung von Chlorwasserstoff in Methanol auf 7. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 3 ml Methanol behandelt und filtriert, worauf man das Filtrat mit 4O ml Aceton verdünnt. Auf diese Weise erhält man 157 mg Produkt

Beispiel 28 Herstellung von cis-BMi23gamma

Eine Lösung von 2CX) mg trans-BM123gamma in 200 ml Wasser photolysiert man mit einer Hanovia-Lampe über eine Zeitspanne von 0,5 Stunden in einem mit Wasser gekühlten Dreihalskolben, und während dieser Zeit verschiebt sich das Maximum der UV-Absorption der Reaktionslösung von 290 m,u nach 275 m,u. Den Fortgang der Reaktion überwacht man am besten indem man zu verschiedenen Zeiten Teilmengen des Reaktionsgemisches entnimmt und ihre Ultraviolettabsorption mißt. Die Umsetzung ist beendet, sobald sich das Absorptionsmaximum von 290 m,u nach 275 m.u verschoben hat. Im Anschluß daran gewinnt man das Produkt durch Lyophilisieren.

Das obige Verfahren wird wiederholt, wobei man die Lösung abweichend davon jedoch 1,5 Stunden photolysiert. Die nachfolgende Lyophilisierung ergibt 170 mg cis-BMi23gamma.

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Claims

Patentansprüche

Antibakterielles cis-BM123ganuna₁ der Formel

2 ι

«τ

CN

X Z

X U

und seine phannakologisch annehmbaren Säureadditionssalze.

709838/07U

ORIGINAL INSPECTED

Antibakterielles cis-BM123gart!ma₉ der Formel

X υ

fN

und seine pharmakologisch annehmbaren Säureadditionssalze.

709838/07U

3. Verfahren zur Herstellung von Cis-BM123ganuna₁, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wässrige Lösung von trans-BMi23gamma₁ mit Licht einer Wellenlänge zwischen etwa 2500 Angström und 4000 Angström bestrahlt und die Bestrahlung solange fortführt, bis das trans-Isomer im wesentlichen in das cis-Isomer überführt ist.

4. Verfahren zur Herstellung von cis-BM123gamma₂, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wässrige Lösung von trans-BM123gamma₂ mit Licht einer Wellenlänge zwischen etwa 2500 Angström und 4000 Angström bestrahlt und die Bestrahlung solange fortführt, bis das trans-Isomer im wesentlichen in das cis-Isomer überführt ist.

5. Verbindungen der Formeln

CIS

y— CH=CH-C-NH- (CH₂) ₃~NH-(CH₂) ₄-NH-CH₂-R (D

H=CH-C-NH- (CH,),-NH- (CH-,) .- ^{2 3 2 4}

(ID

R—V y—-CH=CH-C-NH- (CH )^

(III)

09838/0716

-N-(CH₂J₄-NH-CH₂-R₁

CH₂-R₁

-NH-

(IV)

worin der Substituent R für einen Rest der Formeln

H-C-

(V)

oder

H-C-HN

—O—

(VI)

steht, und R₁ Wasserstoff, AIy1 mit bis zu β Kohlenstoffatomen, Benzyl oder Alkenyl mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeutet, und ihre pharmakologisch annehmbaren Säureadditionssalze.

109838/0714

6. Verbindungen der Formel

eis

worin R für einen Rest der Formeln

H WH

I C=NH

(A)

H-OHN\| [/>—

(B)

steht.

909838/0714

R₂ Alkyl mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen ist und

R₃ Alkyl mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, N,N-Di(C₁-C₄-alkyl)amino-(C₁-C₄~alkyl), Chloralkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, Phenyl, Benzyl, ß-Phenyläthyl, Alkenyl mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Hydroxyalkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, oder die Substituenten R~ und R₃ zusammen mit der Methylidingruppe für Cyclobutyl, Cyclopentyl, Monomethylcyclopentyl, Dimethylcyclopentyl, Trimethylcyclopentyl, Cyclohexyl, Monomethylcyclohexyl, Dimethylcyclohexyl, Trimethylcyclohexyl, Cycloheptyl oder einen Rest der Formel

-CH N—R

^ CF^—CH stehen,

R. Wasserstoff, Alkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl bedeutet,

und ihre pharmakologisch annehmbaren Säureadditionssalze.

f09838/0714

7. Verbindungen der Formeln

R—(/ \^_ciicH-ft-NH-(CH₂) 3-NH-(CH₂) 4-NH-CH₂-R₁

eis ₃-NH-(CH₂J₄-N

V^Ri

ell Jl
CH=CH-C-NH- (CH,

CH₂-R₁ ,J₃-N-(CH₂) 4-NH-CH₂-R₁

ί CH₉-R₁

I ² \ ^V¹¹I -NH- (CH₂J₃-N- (CH₂) ₄-^N\_CH __R

-) -NH-(CH ))-NH-CiI 2 3 i ·* ^r

»09838/0714

worin R für einen Rest der Formeln

L-C-HN^" ΐΛ-Ο

oder

MTV U

H-C-HN

steht,

Hasserstoff oder Alkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen bedeutet,

Alkyl mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen ist und

Alkyl mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen oder Alkenyl mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeutet.

909838/0714

8. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formeln

CIS ₃-NH-(CH₂) 4-NH-

H
H=CH-C-NH- (CH,), -NH- (CH,)--

^{23 2}

CH-CH-C—NH- (CH ) — N— iv»n_ # .—«n—v.«_ —«·. 2 J 2 4 2 ■>■

und

eis S I

CH=CH-C-NH- (CH,) .,-N- (CH,) ^{23 2}

worin R für einen Rest der Formeln

t09838/0714

A*

und

-c-i

steht und

R₁ Wasserstoff, Alkyl mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen,

Benzyl oder Alkenyl mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeutet,

dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung von Verbindungen der Formeln

trans H \)— CH-CH-C-NH- (CH₂) ,-NH-

ΛΛ

trans

|| =C-NH- (CH J₁-NH-(CH,) .-

^{23 2 4}

trans CH-CH

-e-NH-

.-N-(CH.) -ΝΗ-ί

trans CH-CH-

NH- (CH₂) j-fl-

worin R und R₁ die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit Licht einer Wellenlänge zwischen etwa 2500 und 4000 Angström bestrahlt und die Bestrahlung solange fortführt, bis sich das trans-Isomer praktisch vollständig in das cis-Isomer umgewandelt hat.

9. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel

// >\ £12. I

^f/ y—CH=CH-C-NH-(CH₂) j-NH-(CH J₄-NH-CH ,

worin R für einen Rest der Formeln

oder

«Ό9838/0714

.H-C-Hn

steht,

Alkyl mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen ist und

Alkyl mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, N,N-Di (C₁-C₄-alkyl)amino-(Cj-C^alkyl), Chloralkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, Phenyl, Benzyl, ß-Phenyläthyl, Alkenyl mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Hydroxyalkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, oder die Substituenten R_ und R. zusammen mit der Methylidingruppe für Cyclobutyl, Cyclopentyl, Monomethylcyclopentyl, Dimethylcyclopentyl, Trimethylcyclopentyl, Cyclohexyl, Monomethylcyclohexyl, Dimethylcyclohexyl, Trimethylcyclohexyl, Cycloheptyl oder einen Rest der Formel

,CH

-CK

stehen,

Wasserstoff, Alkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl bedeutet,

dadurch gekennzeichnet wässrige Lösung von Verbindungen der Formel

909838/0714

daß man eine

A-W -

R—

(CH₂) ₃-NH-(CH₂) ₄-NH-C

worin R, R- und R₃ die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit Licht einer Wellenlänge zwischen etwa 2500 und 4000 Angström be strahlt und die Bestrahlung solange fortführt, bis sich das trans isomer praktisch vollständig in das cis-Isomer umgewandelt hat.

10. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formeln

cis η

CH=CH-C-NH-(CH₂)

CIS j H=CH-C-NH-

// Vv £i^ I —Γ y— CH=CH-C-NH-

=CH-C-NH-(CH )₃-N-(CH^)₄

CH₉-R,

CH=CH

JCH₉-R, I -NH- (CH₂) j-*- (CH₂) ,.-

2-^Rl

Wasserstoff, Alkyl mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl oder Alkenyl mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeutet und

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-je* -

für einen Rest der Formeln

oder

steht,

dadurch gekennzeichnet, daß man ein Amin der Formel

CIS

R—V ^Y-CH=CH-C-NH-(CH J₃-NH-(CHj)₄-NH₂ _}

worin R obige Bedeutung hat, mit einem Aldehyd der Formel

R₁-CHO,

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worin R₁ obige Bedeutung besitzt, in Gegenwart eines Reduktionsmittels in einem gegenüber den Reaktionsteilnehmern inerten Lösungsmittel solange umsetzt, bis eine wesentliche reduktive Alkylierung eingetreten ist.

11. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der

Formel

O
-C-NH- (CH )3-NH-(CH₂)₄»N-<

R₂ Alkyl mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen ist und

R₀ Alkyl mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, N,N-Di (C..-C,-

j ι 4

alkyl)amino-(C₁-C₄~alkyl), Chloralkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, Phenyl, Benzyl, ß-Phenyläthy1, Alkenyl mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Hydroxyalkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, oder die Substituenten R₂ und R- zusammen mit der Methylidingruppe für Cyclobutyl, Cyclopentyl, Monomethylcyclopentyl, Dimethylcyclopentyl, Trimethylcyclopentyl, Cyclohexyl, Mönomethylcyclohexyl, Dimethylcyclohexyl, Trimethylcyclohexyl, Cycloheptyl oder einen Rest der Formel

N-

stehen,

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Ak

R₄ Wasserstoff, Alkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl bedeutet und

R für einen Rest der Formeln

CH

H NH

C=NH

I MH,

oder

:h

NH-C-HN

steht,

dadurch der Formel

gekennzeichnet * daß man ein Amiη

\\-Cfi=?H-C-NH- (CH₂) 3-NH-(CH₂) 4-

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Ar

worin R die oben angegebene Bedeutung hat, mit einem Keton der Formel

worin R₂ und R₃ die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, in Gegenwart eines Reduktionsmittels in einem gegenüber dem Re aktionsteilnehmern inerten Lösungsmittel solange umsetzt, bis es zu einer wesentlichen reduktiven Alkylierung gekommen ist.

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