DE2647258A1 - Cholinesterasepraeparat enthaltendes pruefroehrchen fuer den nachweis von cholesterasehemmenden substanzen - Google Patents

Description

CholinesteraseprSparat enthaltendes Prüfröhrchen für den Nachweis von cholinesterasehetnmenden Substanzen

Die Erfindung bezieht sich auf ein Prüfröhrchen zur Feststellung van Cha]inesterase behindernden Stoffen in der Umgebungsatmosphäre.

Wie ihre Bezeichnung "hemmende Substanzen" besagt, haben gewisse Stoffe bziü. Verbindungen (Antichalinesterase), wie etwa organischen Phosphor enthaltende Insektizide, Carbomate und Nervengase, die Eigenschaft, die Chalinesterase zu hemmen. Van dieser Eigenschaft macht man vielfach Gebrauch, um solche Verbindungen nachzuweisen. Man bringt dazu die Anticholinesterasen, die als Gase oder Aerosole vorliegen, mit dem Cholesteraseenzym in Kontakt und wertet nach gewisser Einwirkungsdauer die Reaktivität des auf
einem Substrat abgelagerten Enzymes aus.

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Das Enzym beschleunigt die Hydrolyse des Substrates, wobei die zu ermittelnden Komponenten gebildet werden. Auch durch Anwenden sogenannter Ghromogen-Substrate, wie 2,6-Dichlor-Indophenylacetat, im Folgenden als "DIBIA" bezeichnet oder von Indophenylacetat (IFA), bildet sich sofort rin (blau) gefMrbtes Produkt. Bei einer Anwendung von Substraten wie etwa -^ -IMaphtyl-Acetat, wird ^C Naphtol und Essigsäure gebildet. In diesem letztgenannten Prozess wird die Umsetzung in H ebenfalls gemessen mittels eines Indikators oder die Bildung oC -IMaphtol kann ermittelt werden durch Zusetzen von "Echtblau B-salz", das mit -ί-Naphtol eine rotviolette Farbe ergibt. (Siehe beispielsweise die deutsche Patentanmeldung P Zo6 27 1o.5). üJenn in einfacher Weise ohne besondere Facherfahrung und/oder Hilfe eines entsprechend gut ausgestatteten Analyselaboratoriums, an Ort und Stelle der Fabrikation, Handhabung oder beim Transport usw. das Vorhandensein von (toxischen) Stoffen in der Atmosphäre nur qualitativ festzustellen ist, macht man dafür oft Gebrauch von einem Hilfsmittel, das man "Prüfröhrchen" nennt. Eine Anzahl solcher Prüfröhrchen sind im Handel erhältlich. In der Hauptsache bestehen diese aus einem verhältnismäßigdünnem geschlossenen GlaBröhrchen, in dem die Reaktionsmittel enthalten sind. Je nach der angewendeten Ermittlungsweise können diese Prüfröhrchen außer einer oder mehrerer abschnittweise voneinander getrennter Abschnitte oder Zonen mit einer Schicht Chemikalien davon getrennt noch eine besondere Zone aufweisen, mit einer Auffang- oder !Machweisschicht, eine Reinigungsschicht und/oder eine Ampulle mit flüssigen Reaktionsmitteln. Nachdem man die zuge-

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schmolzenen spitzen Enden des Glasprüfröhrchens abgebrochen hat, uiird die zu prüfende Luft der Umgebung durch das Röhrchen hindurchgesaugt mittels einer kleinen, speziell für diesen Zweck entwickelte Pumpe. Nachdem etwa noch weitere mögliche Vorgänge ausgeführt wurden, z.B. das Brechen an dem Röhrchen vorhandenen Ampullen, erscheint eine Farbbildung der Prüfschicht oder eine solche tritt nicht auf.

Das ist dann das Zeichen für das Vorhandensein des Bestandteiles, auf das die umgebende Atmosphäre untersucht worden ist. Um einen Verlust an Flüssigkeit zu vermeiden, wenn man die Ampullen bricht, sind die Prüfröhrchen meist mit einem Schlauchstück aus flexiblem Material umgeben.

Für den Nachweis Cholinesterase hemmender Substanzen in der Umgebung gibt es, wie bereits erwähnt, bereits verschiedene Prüfröhrchenarten. So befinden sich etwa Prüfröhrchen im Handel, bei denen eine stöchimetriBch zunehmende Farbreaktion benutzt wird, die in der Literatur als „Schönemann-Reaktion" beschrieben wird. Bei dieser Reaktion werden organische Phosphorverbindungen in einem alkalischen Milieu zu Perphosphatverbindungen mit Uasserstoffperoxyd, Natriumperborat oder Natriumpyrophosphatperoxyd oxydiert. Die gebildeten Perphosphate vermögen gewisse aromatische Amine, wie von Benzidin und o- Dianysidin zu einem orange-gelben Produkt zu oxydieren. Die Entstehung eines so gefärbten Produktes ergibt dann die Anzeige für die Anwesenheit organischer Phosphorverbindungen in der Umgebung.

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Die Anwendung dieser Schönemann-Reaktion hat jedoch folgende Nachteile: (a) Nicht alle cholinesterasehemmenden Verbindungen ergeben eine Reaktion und können infolgedessen nicht erfaßt werden, (b), die gerade noch erfaßbaren Konzentrationen liegen über den als maximal erlaubten Konzentrationen bezogen auf die kritischen Biftigkeitsiiierts und (c) daB die Trennschärfe der Reaktion nicht so groB ist wie es wünschenswert uSre.

Um diese Kachtsile auszuschalten* wurden ferner Prüfröhrchen entwickelte, mit denen sämtliche Chalinesterasehemmenden Verbindungen auf dem Wege einer enzymatischen i\!achueisreaktion ermittelbar sind. Diase Reaktion zeichnet sich durch große Empfindlichkeit und Trennschirfe aus. Prüfröhrchen, wobei das Enzymacetylcholinesterase vorliegt^ verhaftet mit einem aktivierten Träger, der ein Kieselgur, unter dem Handelsnamen „Celite" erhältlich ist, sind bekannt. Nachdem man das zu untersuchende Fluid, insbesondere Luft oder ülasser, das Anticholinesterase enthält, durchgeleitet hat, läßt man eine DIBIA-Lösung durch das Prüfröhrchen laufen, wonach die entstandene blaue Farbe photometrisch ausgewertet wird. Es ist einleuchtend, daß bei einem solchen Vorgehen daß das Enzym _naltioe Röhrchen mehr oder weniger als Sammlungsdepot for da· Enzym dient und nicht als eigentliches Prüfröhrchen, da es ja keine unabhängige Einheit darstellt, mit der die gesamte Nachweisreaktion ausgeführt werden kann, so daß eine visuelle Betrachtung schließlich das gewünschte Resultat engibt.

Es sind aber bereits andererseits Prüfröhrchen bekannt, die schon

sämtliche, für einen enzymatischen Nachweis erforderlichen Reagenzien enthalten. _/t.

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Charakteristisch für diese Art von Prüfröhrchen ist das Vorhandensein einer Adsorptionsschicht aus bspui. Kieselsäure, an die die enzymhemmenden Verbindungen beim Duröfosaugen des Prüffluides, wie Luft, sich anlagern und an der die Reaktion stattfindet; durch das Vorhandensein ferner einer nach dem Durchöaugungsvorgang abzubrechenden Ampulle mit einer gepufferten Enzymlösung, wodurch das Enzym sich an die Adsorptionsschicht ablagert und weiterhin als Ergebnis einer zuleiten Ampulle mit einer Nährlösung, die abgebrochen uierden muB nach der Einujirkungszeit, kann die RestaktivitMt des Enzyms visuell ausgewertet werden.

Folgende Nachteile bei dieser bekannten Prüfmethode sind jedoch festzuhalten:

Da das gelöste Enzym (a) immer weniger stabil ist, als uienn es in eine feste, trockene Form eingelagert ist, ist die Aufnahmefähigkeit dieses vorerwähnten Prüfröhrchens sehr begrenzt. Zugegeben, daB das angewendete Substrat, Butyrylcholin-jodid in Wasser löslich ist, so ist es jedoch kein „chromogenes" Substrat. Infolgedessen wird das Aufspalten dieses Substrates unter dem Einfluß der verbleibenden Aktivität des Enzyms bestimmt mittels eines Indikators auf SMurebasis vom Typus Phenolrot.

Die Verwendung eines solchen sauren Indikators wifckt sich störend bei der Nachweisreaktion aus, wenn hierbei saure Gase in der zu untersuchenden Luft vorhaden sind. Darüberhinaus erfordert das Vorhandensein von zwei Ampullen in einem Prüfröhrchen, die einzeln gebrochen werden müssen, eine ganz besondere Geschicklichkeit des VerwBBders und außerdem die Zuhilfenahme eines besonderen Ampullenöffners. .~

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Der Erfindung liegt.·; danach die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Prüfröhrchen langzeitiger Haltbarkeit zu bieten, mit dem Cholinesterase hemmende Substanzen feinstufig und trennscharf in verhältnismäßig kurzer Zeit und auf einfache Uleise mittels enzymatischer Reaktion nachweisbar sind.

Für dieses Ziel ist eine spezielle Herstellungsueise der Reagenzien und spezifische Verteilung und Anordnung der Reagenzien im Prüfröhrchen Voraussetzung.

Das demgemäB verbesserte Prüfröhrchen nach der Erfindung weist folgenden Aufbau in Zonen auf:

(a) Eine für das Reagieren zu brechende Ampulle, die eine entsprechende uMssrige Pufferlösung enthält;

(b) in Trpckenform ein Präparat aus komogenem Substrat und einem LBsungsbeschleuniger;

(c) ein Trockenpräparat aus einer Cholinesterase und einem Lösungsbeschleuniger und

(d) einer Anzeigezone, die ein Adsorptionsmittel, uie z.B. Kieselsäuregel enthält.

Die Zeichnung zeigt schematisch den Aufbau einer bevorzugten Ausführungsform eines Prüfröhrchens nach der Erfindung. Die darin untergebrachten Reaktionsmittel und Zusätze sind folgende:

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Das in festem und trockenem Zustand unterzubringende und als Masse bei Herstellung der Prüfröhrchen leicht handzuhabende Enzymmaterial enthält außerdem ein inertes Füllmaterial zugesetzt, das möglichst lagerfest macht und vorzugsweise dem gefriergetrockneten Enzympräparat zugesetzt uiird. Darüberhinaus soll sich diese Matrix praktisch momentan mit dem Enzym nach Zutritt der wässrigen Pufferlösung auflösen können. Es wurde gefunden, daß man das erreichen kann, uienn man eine gefriergetrocknete Enzymgelatinezubereitung verwendet, wie sie in Beispiel 1 angegeben ist, Als vorzugsweise geeignet hat sich dazu Butyril-Cholinesterase (BuChE) als Enzym erwieeen. Man erhält damit ein besonders gut handzuhabendes, nicht allzu plastisches Material, das ein Brechen ohne besondere Schwierigkeit ermöglicht, auf der anderen Seite aber nicht zu brüchig ist urid infolgedessen alsbald zu Pulver zerfällt, sich ferner schnell und in großer Mehge löst. Das Enzym kann zusammen mit einer Matrix aus natürlichen und/oder synthetischen pharmazeutischen Gummiarten, wie z.B. Gelatine, Gummiarabicum, Carbö>ax gefriergetrocknet sein. Ferner mit dem unter dem Handelsnamen VEEGUM bekannten Emulgier- und Verdickungsmittel aus koloidalem Magnesium-Aluminiumsilikat od. dgl. Die Verwendung einer teilhydralisierten Gelatine hat sich als besonders zweckmäßig erwiesen.

Daß Gelatine eine stabilisierende Wirkung auf die Haltbarkeit von Enzymen ausübt, ist natürlich eine bekannte Tatsache.

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Da als Substrat bei einem Enzymnachweis vorzugsweise ein chromogenes Substrat angewendet wird, um dadurch größere Trennschärfe zu erreichen, wurden die Anwendungsmöglichkeiten von uiasserlöslichen Chromogensubstraten gesucht.

Wohlbekannte, wasserlösliche chrnmogene Substrate, wie 3-axyacet-U,2 triazolylazDphenyl, trimenthyl, ammanium jodid, haben sich als genügend stabil erwiesen, ergeben aber eine Farbumuiandlung, die nur schwach erkennbar ist. Andere bekannte Chramogensubstrate wie DIBIA und IFA sind in Wasser schwer löslich. Da die Anwendung von organischen Lösungsmitteln unmöglich ist, ohne die Anwendung zusätzlicher Maßnahmen - sie beeinträchtigen in hohem Maße die Aktivität der Cholinesterase - so war eine Möglichkeit zu finden, um diese Substrate, die schlecht in Wasser löslich sind, in eine solche Form zu bringen, daß eine geringe, aber ausreichende Menge, die in Wasser gelöst werden kann, gebildet wird und sich dabei auch sehr schnell bei einem Nachweis löst. Man kann dies erreichen, wenn man ein Präparat aus gefriergetrocknetem Substrat/Gelatine herstellt, wie das im einzelnen beschrieben ist in Beispiel II. Es wurde gefunden, daß vorzugsweise DIBIA, auch in Rücksicht auf die im Handel erhältliche Form des Natriumsalzes des entsprechenden Phenol und des pH (5,8) des Phenolations verwendet werden kann, mährend als lösungsbeschleunigender Füllstoff wiederum teilhydralisierte Gelatine verwendet werden kann.

Außer DIBIA ::ann man auch einige verwände Indophenalacetate verwenden, wie z.B. Indaphenolacetat als solches (N- (V Gxyaceto-

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phenyl )-p-Quinonimin), 2,6 Dibramindaphenylacetat und ähnliche Verbindungen, die in stark gefärbte Verbindungen durch Cholinesterasen umgesetzt werden.

Ueiterhin sollte in dem Prüfröhrchen eine gepufferte wässrige Lösung vorhanden sein, um nach Erfassung der Cholerestinasenhemmstoffe ein Milieu zu schaffen, in dem einerseits die Enzymhemmung stattfinden kann, optimal bei pH 7,6 - B, ο und in welcher andererseits die Enzymsubstratreaktion derart verläuft, daß man eine optimale Farbbildung für die visuelle Ermittlung erhält. Vorzugsweise benutzt man eine o,15 - o,2 ml Lösung von D,l M tris-Pufferlösung (pH ß) oder o,15 M Phosphatpufferlösung (pH S). (tris = tri (hydroxymethyl) Aminomethan.) Um sicher zu stellen, daß auf der einen Seite ein angemessenes Aufnehmen der Cholinesterasehemmstoffe gewährleistet ist und auf der anderen Seite eine Prüflage gebildet wird, in der die Reaktion stattfinden kann und die Farbbildung gut beurteilt werden kann, verwendet man vorzugsweise eine entsprechend ausgewählte Menge farbloser aktiver Kieselsäure. Beim Auswählen von Typus und Menge an Kieselsäure sind Kriterien, wie Aufnahmefähigkeit, Druckabfall und Benetzung durch die angewendete Menge von Pufferlösung von Bedeutung.

Nach den Beispielen, die eine Ausführungsfarm der Herstellungsweise der angewendeten Enzym- und Substratpräparate wiedergeben, ist von den vorzugsweise gehandhabten Mengen ausgegangen. Die Mengen und jeweiligen Konzentrationen können natürlich in einem verhältniswEiten Bereich verändert werden.

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Beispiel I: Herstellung der Enzym-Gelatinezubereitung.

2,5 g Gelatine ujer.tien in 125 ml Wasser gelöst. Hierzu uiird o,8 g NaDH zugesetzt. Diese Lösung erhitzt man 9o Minuten lang in einem bei Ga C gehaltenen Bad mit einem Thermostaten. Darauf ujird die teilhydrnlisierte Gelatinelösung abgekühlt und sorgfältig auf pH 7,5 mit HCL -Lösungen ( 3 N und o,l N) neutralisiert. In der Lösung werden 5o mg von Butyrylcholesterinase (BuChE) (angenähert) 3 E -mg gelöst, wobei die Lösung leicht geschüttelt üiird. (IE = I umol von Acetylcholin/min, pH 7,5, 25^DC (Report Comm. Enzymes, Pergamon press, N.Y. 1961 p.8). Diese Lösung ujird 2M Stunden lang in üblicher Weise gefriergetrocknet, bis ein trocknes Produkt entsteht. Die gefriergetrocknete Zubereitung wird etwas mit einem Spatel zerkleinert und in einen Exsiccator über PD gebracht. Schnellversuche haben gezeigt, daß dieses Produkt sehr gute Lagerbeständigkeit hat und ein Leistungsabfall bei einer Halbwertzeit von mindestens 8, aber wahrscheinlich 22 Jahren eintritt.

Beispiel II: Herstellung einer Substrat/Gelatinezubereitung. 1 g Gelatine uiird in 5o ml Wasser gelöst. Dazu gibt man 16o mg NaDH, T,h mg DIBIA, gelöst in 7,*t ml Wasser und peroxidfreies Dioxen. Die so erhaltene Lösung wird 2.h Stunden gefriergetrocknet bis ein Trockenprodukt entsteht. Dieses gefriergetrocknete Materi al uird leicht mit einem Spatel verteilt und in einen Exsiccator mit P₂ ⁰C gebracht. Schnellproben zeigen, daß dieses Produkt genügend stabil ist, vorausgesetzt, daß es dunkel aufbewahrt wird und frei von Feuchtigkeit bei Temperaturen unter 3o - ^o C.

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Unter diesen Bedingungen betrögt die Halbwertzeit mindestens 3,5 Jahre, ist aber wahrscheinlich größer.

Mit den beschriebenen Reagenzien kann man ein Prüfröhrchen herstellen, wie es etwa in der Zeichnung dargestellt ist.

In seiner Form ist das Prüfröhrchen, wie üblich, mit einer Einschnürung 2, an der Stelle der flüssigkeitenthaltenden Ampulle versehen.

Die verschiedenen Abschnitte oder Zonen des Prüfröhrchens sind voneinander getrennt durch Zwischenboden <t, die für Gase und
Flüssigkeiten durchlässig sind. Mit 5, 6 und 7 jeweils sind die Zonen für die die Chromogensubatrat-Füllstoffzubereitung, die
Cholinesterase-Füllstoffzubereitung und die Anzeigezone mit einem Absorbierungsmittel, uie z.B. Kieselsäure bezeichnet. An beiden Enden des Prüfröhrchens sind feine Spitzen B und 9 ausgezogen, die man kurz vor der Reaktion abzubrechen hat.

Vorzugsweise enthMlt das Prüfröhrchen 25 mg der BuChE/Gelatinezubereitung (etwa 0,7 E), 5 mg der DIBIA/Gelatinezubereitung,
85 - loo mg Kieselsäure und eine Ampulle mit o,15 - o, 2 ml Pufferlösung. Die Handhabung, die man bei Gebrauch des Prüfröhrchens beachten muß, ist folgende:

Abbrechen der feinen Spitzen am Prüfröhrchen. Durchsaugen einer bestimmten Volumenmenge von zu untersuchendem Fluid 23 Luft durch das Röhrchen. Brechen der Ampulle mit der Pufferlösung, dann ca. 2 Minuten warten und schließlich Auswerten der Farbe.

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Beide Gelatinezubereitungen lösen sich praktisch augenblicklich in der Pufferlösung, die nachdem die Ampulle gebrochen ist, nach unten fließt. Bei Abwesenheit einer Cholesterinase-hemmenden Verbindung (D-Reaktion) innerhalb 2 Minuten, kann man in der Nachweisschicfat sine Farbumwandlung von Rat-orange zu blau beobachten.

Dis DIBIA-Gelatinezubereitung liegt vorzugsweise über der BuChE-G@latinezubereituno.j da tsJährsnd der zwei Minuten Wartezeit nach dem Zutreten der Pufferlösung zusatzlich etwas nicht-hydrolisiertes DIBIA nach unten fließt. Wenn das stattfindet gerade über der AnzeigesEbicht, dann könnte die Betrachtung der Farbbildung dadurch beeinträchtigt werden.

Entgegen aller Erwartung,, muB die Luft vorzugsweise von der Seite angesaugt werden, wo die Reaktionsstoffe liegen, in Richtung auf die Anzeigesbhicht„ Dann wahrscheinlich ist das BuChE schon gehemmt, bevor es zusammen mit dem DIBIA in die Anzeigeschicht gelangt, lilir die Luft von der Seite von der Indikationsschicht aus angesaugt, dann werden die Cholesterinase-hemmstoffverbindungen ganz am Boden dieser Schicht festgehalten. ÜJenn dann das Enzym und das Substrat von oben die Indikationsschicht erreichen, dann wird eine Hydrolyse des Substrates schon stattgefunden haben, bevor das Enzym auf dem Boden der Schicht gehemmt wird.

Das Auswerten der Farbe nach der abgeschlossenen Nachweisreaktion kann auf zwei Uegen erfolgen. üJenn das Enzym nicht vollkommen inaktiviert worden ist, hydrolisiert die schwache zurückbleibende AktivitMt einen geringen Teil des Substrates und bewirkt

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damit eine schwache Blaufärbung der Indikationsschicht. Trntzdem ist der Unterschied der gebildeten Farbe gegenüber der des Null— testes klar erkennbar und deshalb können sehr geringe Konzentrationen an Cholesterinase hemmenden Verbindungen festgestellt werden und sind für einfache Zwecke Nulltestversuche nicht erforderlich. Ein noch klareres Kriterium ist es, daß an der Grenze der Empfindlichkeit, keine Blaufärbung überhaupt beobachtet uierden soll. Dies erfordert eine vollständige Inaktivierung des Enzymes und umso höhere Konzentrationen c von Cholesterinase hemmenden Verbindungen.

Nichtsdestoweniger können mit der letzterwähnten Farbauswertungsmethode Konzentrationen von noch a,^ mg/m nachgewiesen werden an 0,0 -Dimethyl-G-(2,2-dichlor-vinyl-phosphat (DDDVP, auch bekannt unter dem Handelsnamen "Vapona" oder "Dichlorovos"), wenn mit den beschriebenen Teströhrchen 2 1 Luft, 2o Pumpzüge als Probe dienen.

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Claims (3)

1. (12 736) Patentansprüche:

   Ein Cholinesterasepräparat enthaltendes Prüfröhrchen für den

   Nachweis von Cholinestrase hemmenden Substanzen in der Umgebungsatmosphäre, mit einer gepufferten Flüssigkeit uiie SubstratprMparat und eine für Anzeige dienenden Adsorptionsschicht, dadurch gekennzeichnet, daß das Prüfröhrchen folgende Zonen aufweist

   a) eine bei der Reaktion zu brechende eine wässrige Pufferlösung enthaltende Ampulle;

   b) ein Trockenpräparat eines chromogenen Substrates und ein lösungsbeschleunigendes Füllmittel;

   c) ein Trockenpräparat einer Cholinestrase und ein lösungsbeschleunigendes Füllmittel und

   d) die ein Adsorptionsmittel enthaltende Anzeigezone.
2. 2. Prüfröhrchen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Durchsaugrichtung des zu untersuchenden Fluidums besteht aus

   1) einer mit einer wässrigen Pufferlösung von ph 7,5 bis B,D gefüllten Ampulle;

   2) einer gefriergetrockneten Mischung aus DIBIA und teilhydrolisierter Gelatine;

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   ORIGINAL INSPECTED

   -z-
3. 3) einer gefriergetrockneten Mischung aus Butyryl-cholinestrase

   und teilhydraliester Gelatine;
   U) einer Anzeigezane mit Kieselsäure als Adsorbens.

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