DE2638526A1

DE2638526A1 - Traeger fuer die elektrophorese und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2638526A1
Application number: DE19762638526
Authority: DE
Inventors: Nobuo Hiratsuka; Nakatsugu Yaginuma
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1975-08-29
Filing date: 1976-08-26
Publication date: 1977-07-14
Also published as: GB1519385A; JPS5229296A; JPS5531418B2

Description

PATENTANWÄLTE A. GRÜNECKER

OPU-INS.

H. KINKELDEY

K. SCHUMANN

or her NKr.-an.-mrs,

P. H. JAKOB

G. BEZOLD

Dft REaNCC- OfLOEU

8 MÜNCHEN 22

MAXIMILIANSTRASSE 43

26. Aug. 1976 P 10 735

Fuji Photo Film Co., Ltd.

No. 210, Nakanuma, Minami Ashigara-Shi, Kanagawa, Japan

Träger für die Elektrophorese und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft einen Träger für die Elektrophorese und ein Verfahren zu seiner Herstellung. Die Erfindung betrifft insbesondere einen für die isoelektrische Fokussierung geeigneten Träger und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Die Elektrophorese wird für die Trennung und Reinigung geladener Teilchen verwendet. Sie ist besonders für die Trennung und Fraktionierung von Proteinen nützlich. Elektrophoretische Verfahren sind zusätzlich zu den allgemeinen elektrophoretischen Verfahren elektrophoretische Scheibenverfahren, bei denen die Trennung unter Verwendung eines diskontinuierlichen Pufferlösungssystems erfolgt, ein immunoelektrophoretisches Verfahren, bei dem die Trennung und Erfassung über eine Immunodiffusionsreaktion erfolgt, und ein isoelektrisches Fokussierungsverfahren, bei dem ein pH-Gradient zwischen den Elektroden gebildet wird und die Trennung und Fraktionierung in diesem pH-Gradienten erfolgt, usw.

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Bei der oben beschriebenen isoelektrischen Fokussierung wird zwischen den Elektroden ein pH-Gradient gebildet. Ampholyten, wie Proteine u.a., werden in diesem pH-Gradienten getrennt und fraktioniert. Da sich die Proteine an dem Ort konzentrieren, wo der pH-Wert dem isolelektrischen Punkt entspricht, ist die Fraktionierung sehr scharf, und somit ist dieses Verfahren wegen der Auflösungskraft das beste elektrophoretische Verfahren. Verglichen mit bekannten elektrophoretischen Verfahren, bei denen die Bestimmung des isoelektrischen Punktes schwierig ist, ist es bei der isoelektrischen Fokussierung leicht, den isoelektrischen Punkt zu bestimmen.

Die iso elektrische Fokussierung besitzt weiterhin den Vorteil, daß sich die fraktionierten Zonen der Proteine nicht von der Stellung des isoelektrischen Punktes wegbewegen und daß sich durch den Einfluß der Kraft der elektrischen Fokussierung die Schärfe der getrennten Zone · ■ durch Diffusion nicht verschlechtert. Im Gegensatz zu bekannten elektrophoretischen Verfahren ist es nicht erforderlich, unterschiedliche spezifische Pufferlösungen, abhängig von der Art der Enzyme, zu verwenden. Die Fraktionierung kann so unter den gleichen Bedingungen unter Verwendung eines Trägerampholyten mit dem gewünschten pH-Bereich durchgeführt werden.

Die isoelektrische Fokussierung umfaßt ein Verfahren, bei dem die Fraktionierung in einer Lösung in einer Säule durchgeführt wird, und ein Verfahren, bei dem eine dünne Schicht aus Polyacrylamidgel als Träger verwendet wird. Das erstere Verfahren, bei dem die Fraktionierung in einer Säule erfolgt, ist für die Fraktionierung und Trennung gut, da dabei die Fraktionierung einer großen Menge möglich wird. Dieses Verfahren ist jedoch nicht als analytisches Verfahren geeignet, da nur eine Probe zur Zeit fraktioniert werden kann und da eine große Menge an TrägeramphoIyt erforderlich ist. Die Kosten für die Fraktionierung erhöhen sich und es ist eine lange Zeit erforderlich.

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Andererseits ist bei der isoelektrischen Fokussierung, bei der eine dünne Schicht aus Polyacrylamidgel als Trägermedium verwendet wird, die Fraktionierung von mehreren Proben zur gleichen Zeit möglich. Die Zeit, die für die Fraktionierung erforderlich ist, wird auf ein Drittel, oder weniger der Zeit vermindert, die bei einer Säule erforderlich ist. Die Menge an TrägeramphoIyt ist geringer als bei der Säule, und dadurch werden die Kosten, die für das Verfahren erforderlich sind, erniedrigt. Dieses Verfahren ist als analytisches Verfahren besser geeignet als das Säulenverfahren. Die Verwendung einer dü^inen Schicht aus Polyacrylamidgel als Trägermedium ergibt jedoch die Schwierigkeit, daß lange Zeiten für die Herstellung der dünnen Gelschicht erforderlich sind. Da das Gel weich und brechbar ist, muß man während des Verfahrens sehr sorgfältig und vorsichtig vorgehen. Dieses Verfahren besitzt außerdem den Nachteil, daß die Verfahrenszeit !lang ist, die Kosten hoch sind und daß die Schicht beim Trocknen schrumpft.

Wäre es möglich, die isoelektrische Fokussierung unter Verwendung eines porösen Polymerfilms, wie eines Celluloseacetatfilms, durchzuführen, wie er üblicherweise bei der elektrophoretischen Analyse verwendet.wird, so würden die obigen Nachteile beseitigt werden.· Jedoch ist es mit bekannten porösen Polymerfilmen, wie mit Celluloseacetatfilmen u.a., unmöglich, eine isoelektrische Fokussierung durchzuführen, bedingt durch ihre Elektroendosmose (vergl. z.B. D.H. Leaback und A.C. Rutter, Biochem.Biophys.Res.Commun., Band 32, Seiten 447 bis 453, 1968, B). ·

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen Träger aus einem porösen Polymerfilm für die Elektrophorese zu schaffen,, der eine niedrige Elektroendosmose zeigt und der bei der isoelektrischen Fokussierung verwendet werden kann.

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Erfindungsgemäß soll ein Träger für die Elektrophorese geschaffen werden, auf den. eine Probe ausgetragen werdea kann und der für die isoelektrische Fokussierung geeignet ist.

Erf indungs gemäß soll ein Träger für die Elektrophorese geschaffen werden, der bei der . Anfärbung : " "=- ''ν-'*"'» bei der Entfärbung und bei ähnlichen Verfahrensstufen nicht bricht und der gute Handhabungseigenschaften besitzt und für die isoelektrische Fokussierung geeignet ist.

Erfindungsgemäß soll ein Träger für die Elektrophorese geschaffen werden, der beim Trocknen nicht schrumpft, leicht gelagert werden kann und für die "isoelektrische Fokussierung geeignet ist.

Erf indungs gemäß soll ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Träger für die isoelektrische Fokussierung geschaffen werden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein poröser Polymerfilm mit einem Elektroendosmosefaktor von 0 bis plus etwa 10 mm verwendet, wobei der Elektroendosmosefaktor nach dem im folgenden beschriebenen Verfahren bestimmt wird.

In den beigefügten Zeichnungen werden bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen näher erläutert; es zeigen:

Fig. 1 und 2 Filmproben, die bei dem Meßverfahren für den Elektroendosmosefaktor verwendet werden können, der den Grad der Elektroendosmose-Erscheinung bei der vorliegenden Erfindung anzeigt; und

Fig. 3 den pH-Gradienten, der gemäß Beispiel 1 erhalten wird.

Erfindungsgemäß wird ein Träger für die Elektrophorese, der einen porösen Polymerfilm mit einem Elektroendosmosefaktor

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von O bis plus etwa 10 mm enthält, und ein Verfahren zu seiner Herstellung geschaffen.

Der obige Elektro endo smo sef akto r wird nach dem folgenden Verfahren bestimmt. Auf eine rechteckige Filmprobe mit der Größe von 50 mm χ 60 mm werden sechs Markierungen 12 auf die Mittellinie der 60 mm Seite, wie in Fig. 1 dargestellt, mit einem Bleistift aufgetragen. Dieser Film- wird in eine 0,07 M Veronal-Pufferlösung (pH 8,60) der folgenden Zusammensetzung eingetaucht:

Diäthylbarbitursäure 2,17 g

Natrium-diäthylbarbiturat 12,0 g
Wasser bis zu 1 1

Nachdem der Überschuß der Pufferlösung an der Oberfläche mit Filterpapier abgetrocknet wurde, wird die Filmprobe auf eine elektrophoretische Mikroanalyse-Vorrichtung Typ 238 (hergestellt von Joko Sangyo Co., Ltd.) unter Verwendung der gleichen Veronal-Pufferlösung, wie sie oben verwendet wurde, als Elektrolyt gegeben. Auf die so angebrachten Markierungen der Filmprobe wird eine O,5?oige Lösung von Blue Dextran (Blue Dextran 2000, hergestellt von Pharmacid Fine Chem.Co.) in Wasser in einer Menge von 1,6/ul/cm (auf nasser Grundlage) so aufgetragen, daß zwei Markierungen miteinander verbunden sind, wie in Fig. 2 dargestellt. . In Fig. 2 bedeuten 21 den porösen Polymerfilm, 22 eine Markierung, die mit einem Bleistift aufgetragen wird, und 23 die Fläche, wo das Blue Dextran aufgetragen wurde. Anschließend wird die Filmprobe bei konstanter Spannung von 15 V 45 min der Elektrophorese unterworfen.

Nachdem der Strom 45 min. durchgeleitet wurde, wird die Filmprobe entnommen und die Entfernung und Richtung, in der sich das Blue Dextran von der Stelle wegbewegt, an der es aufgetragen wurde, werden bestimmt. Die Entfernung wird

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in "mm" ausgedrückt, und wenn die Verbindung in Richtung auf die Anode wandert, wird das Zeichen "plus" verwendet, und wenn sie in Richtung auf die Kathode wandert, wird das Zeichen "minus" verwendet. Wenn sie beispielsweise 3 nun in Richtung auf die Anode wandert, wird "plus 3 nun" verwendet, und wenn sie 3 mm in Richtung auf die Kathode wandert, wird "minus 3 mm" verwendet.

Der durchschnittliche Wert dieser drei in Fig. 2 gezeigten aufgetragenen Linien 23 der Bewegungsentfernung und -richtung wird als Elektroendo smo sef aktor der Filmprobe definiert .

Dieses Verfahren ist sehr praktisch und ermöglicht die genaue Bestimmung des Grades der Elektroendosmose einer Filmprobe. Nur solche porösen Polymerfilme mit einem Elektroendosmosefaktor von 0 bis plus etwa 10 mm, bestimmt nach dem obigen Verfahren, ermöglichen die Durchführung der isoelektrischen Fokussierung. Insbesondere sind solche porösen Polymerfilme mit einem Elektro endo smo sef aktor von 0 bis 5 mm bevorzugt.

Die Bestimmung des Elektro endo smo sef aktor s von bekannten Celluloseacetatfilmen zeigt, daß Separax (hergestellt von Fuji Photo Film Co., Ltd.) einen Faktor von etwa minus 20 mm besitzt. Da der Elektroendo smo sef aktor minus ist, wird der pH-Gradient,_wenn der Film als Träger bei der isoelektrischen Fokussierung verwendet wird, gestört, .wegen der Bewegung der Pufferlösung in Richtung auf die Kathode, bedingt durch die Elektroendosmose, und es ist somit nicht möglich, eine isoelektrische Fokussierung auf gute Weise durchzuführen.

Keiner der zur Zeit verwendeten oder bekannten porösen Polymerfilme besitzt einen Elektro endo smo sef aktor, der im Bereich von 0 bis plus etwa 10 mm liegt.

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Bei der Herstellung der .e^findungsgemäßen' porösen Polymerfilme mit einem Elektroendosmosefaktor von 0 bis plus etwa 10 mm ist es bevorzugt, daß die nichtionisehen oberflächenaktiven Mittel und/oder der Celluloseäther usw.' zu der Lösungsmittelmischung, die mindestens ein polymeres Material für die Bildung des Films und ein Lö sungsmittel enthält, zugegeben werden (diese Lösungsmittelmischung wird im allgemeinen als "dicke Flüssigkeit" oder "Schmiere" bezeichnet).

Das polymere Material, das den erfindungsgemäßen porösen Polymerfilm ergibt, ist ein nichtionisches Polymer, das Celluloseester, wie Nitrocellulose, Acetylcellulose, Acetylbutylcellulose, Cellulosepropionat u.a., ein Polyamidharz, ein Polyvinylchloridharz usw. gefaßt.

Von diesen polymeren Materialien werden bevorzugt Celluloseester und Polyamidharz verwendet. Insbesondere ist Acetylcellulose bevorzugt.

Besonders bevorzugte, nichtionische Polymere, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, besitzen ein Molekulargewicht von etwa 10 000 bis etwa 50 000 und werden natürlich am meisten bevorzugt unter den Verbindungen der oben erwähnten Klasse ausgewählt.

Bei der Herstellung des porösen Polymerfilms wird das obige polymere Material zuerst in einem Lösungsmittel gelöst,

Das bei der vorliegenden Erfindung verwendete Lösungsmittel enthält alle, nämlich ein gutes Lösungsmittel, ein schiechtes Lösungsmittel und ein Nicht-Lösungsmittel. In der vorliegenden Anmeldung bedeutet der Ausdruck "gutes Lösungsmittel" solche Lösungsmittel, die die polymeren Materialien auflösen können; der Ausdruck "schlechtes Lösungsmittel" bedeutet solche Lösungsmittel, die sich in den guten Lösungs-

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mitteln lösen bzw. diese "beiden Lösungsmittel sind gegenseitig ineinander löslich und die die polymeren Materialien nicht wesentlich lösen, sondern sie nur quellen, und einen höheren Siedepunkt besitzen als die guten Lösungsmittel; der Ausdruck "Nicht-Lösungsmittel" bedeutet solche Materialien, die gegenseitig in den guten oder schlechten Lösungsmitteln löslich sind, die aber die polymeren Materialien weder lösen noch quellen und einen höheren Siedepunkt besitzen als die guten Lösungsmittel. Bevorzugte gute Lösungsmittel besitzen einen Siedepunkt von höchstens etwa 100⁰C, bevorzugt 20 bis 100⁰C; bevorzugte schlechte Lösungsmittel besitzen einen Siedepunkt, der höher ist als der der guten Lösungsmittel, am meisten bevorzugt von etwa 100 bis etwa 300⁰C, noch bevorzugter von etwa 100 bis 150°C; bevorzugte Nicht-Lösungsmittel besitzen die gleichen Siedepunkts eigenschaften wie die schlechten Lösungsmittel. Dies soll jedoch keine Begrenzung darstellen.

Beispiele von guten Lösungsmitteln sind Methylenchlorid, Aceton, Methylformiat u.a. .für Acetylcelluose; Diäthyläther, Methylacetat, Aceton, Essigsäure u.a. für Nitrocellulose; und Methanol, Äthanol u.a. für Polyamidharze, usw.

Beispiele von schlechten Lösungsmitteln sind Tetrahydrofuran, Methanol u.a. für Acetylcellufose; Butanol, Äthanol u.a. für Nitrocellulose; Tetrahydrofuran, Dioxan, Äthylacetat u.a. für Polyamidharze, usw.

Als Nicht-Lösungsmittel wird häufig Wasser verwendet. Die Hauptforderung für ein geeignetes Nicht-Lösungsmittel ist die, daß es den Polymerfilm nicht quellen oder lösen soll und daß es mit den guten und schlechten Lösungsmitteln löslich sein muß. Wie oben angegeben, ist der Siedepunkt höher als der des guten Lösungsmittels. Obgleich Wasser am meisten bevorzugt ist, können mehrwertige Alkohole, wie Glycerin, Äthylenglykol usw. gegebenenfalls ebenfalls verwendet werden.

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Das gute Lösungsmittel ist für die Herstellung des porösen Polymerfilms zwingend. Das schlechte Lösungsmittel und das Nicht-Lösungsmittel sind bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht unbedingt erforderlich, und sie werden hauptsächlich bei bevorzugten Ausfuhrungsformen verwendet.

Ohne daß man das polymere Material kennt, kann keine eindeutige Grenzlinie zwischen den guten Lösungsmitteln, den schlechten Lösungsmitteln und den Nicht-Lösungsmitteln gezogen werden. Aus den oben angegebenen Beispielen folgt, daß gute Lösungsmittel für bestimmte polymere Materialien manchmal schlechte Lösungsmittel oder Nicht-Lösungsmittel für andere polymere Materialien sind. Weiterhin können Gemische aus zwei oder mehreren Lösungsmitteln als gute Lösungsmittel oder schlechte Lösungsmittel oder als Nicht-Lösungsmittel verwendet werden.

Die Beziehung gründet sich jedoch auf die chemischen und physikalischen Eigenschaften des polymeren Materials und die Wahl der polymeren Materialien. Die drei Arten von Lösungsmitteln können leicht vom Fachmann ausgewählt werden. Es erübrigt sich daher eine nähere Erklärung.

Die vorliegende Erfindung ist hinsichtlich der gewählten Art für die Auflösung und das Vermischen der polymeren Materialien, der guten, schlechten und Nicht-Lösungsmittel nicht besonders beschränkt. Bei der vorliegenden Erfindung können die folgenden Verfahren verwendet werden. Ein Verfahren, bei dem das polymere Material in dem guten Lösungsmittel gelöst und dann das schlechte und das Nicht-Lösungsmittel zugegeben werden; ein Verfahren, bei dem das polymere Material zu einem Gemisch aus gutem Lösungsmittel und einem Teil des darin gelösten schlechten Lösungsmittels gegeben wird und das restliche schlechte Lösungsmittel zu der oben hergestellten Lösung gegeben wird und weiterhin ein Nicht-Lösungsmittel

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2 f Π R S ? R

zugegeben wird. Man kann bei der vorliegenden Erfindung auch viele andere Verfahren verwenden. Andere Bedingungen, wie das Mischverhältnis von jedem der Lösungsmittel, die Temperatur, bei der das Mischen erfolgt, usw., sind in keiner Weise beschränkt (obgleich das Mischen unter dem Siedepunkt des(der) Lösungsmittel oder Nicht-Lösungsmittel, die verwendet werden, e.-ⁿalgen sollte).

Wenn die hergestellte Polymerlösung stabil ist, sind die folgenden Verfahrenestufen einfach, und daher erfolgen das Auflösen und das Vermischen bevorzugt so, daß eine stabile Lösung erhalten wird. Der Ausdruck "stabile Lösung" bedeutet Lösungen, in denen das polymere Material kein Gel bildet und keine Phasentrennung stattfindet. Zur Herstellung einer stabilen Lösung können verschiedene Verfahren verwendet werden. Man kann ein Verfahren verwenden, bei dem die Menge an gutem Lösungsmittel in der Lösung größer ist als die der anderen Lösungsmittel. Man kann auch ein Verfahren verwenden, bei dem das polymere Material zu einem Gemisch aus dem gesamten guten Lösungsmittel und einem Teil des darin gelösten schlechten Lösungsmittels gegeben wird und dann das restliche schlechte Lösungsmittel zugegeben wird.

Erf indungs gemäß ist es am meisten bevorzugt, daß das gute, schlechte und Nicht-Lösungsmittel in einem Mischverhältnis von etwa 20 bis etwa 80 Gew.% an gutem Lösungsmittel mit etwa 1 bis etwa 20 Gew.% an Nicht-Lösungsmittel verwendet werden und daß als Rest 0 bis etwa 60 Gew.%, schlechtes •LösungsmA.tiel (sofern es verwendet wird) bezogen auf 100 Gevi.% Lösungsmittel, vorhanden ist (wobei dieser Ausdruck das gute, das schlechte und das Nicht-Lösungsmittel umfaßt).

Das Vermischen erfolgt bevorzugt bei Temperaturen von etwa 0 bis etwa 100°C, mehr bevorzugt von etwa 20 bis 40°C,

ORIGINAL INSPECTED

im Verlauf einer Zeit von etwa 2 bis 3 min "bis etwa 24 h. Die Zeit ist nicht besonders wesentlich und kann stark variiert werden. Im allgemeinen sind kürzere Zeiten im Hinblick auf den Nutzeffekt des Verfahrens bevorzugt.

Bei der vorliegenden Erfindung werden bei einem Verfahren zur Herstellung des porösen 'Polymerfilms mit einem Elektroendosmosefaktor von 0 bis plus etwa 10 min nichtionische oberflächenaktive Mittel zu der oben beschriebenen dicken Flüssigkeit bzw. Schmiere .gegeben.

Im allgemeinen kann bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung irgendeine Art von nichtionischen oberflächenaktiven Mitteln verwendet werden. Bevorzugt, werden solche nichtionischen oberflächenaktiven Mittel verwendet, die ein Molekulargewicht von etwa 300 bis etwa 50 000, bevorzugter von 500 bis 10 .000 besitzen. Im folgenden werden.Beispiele für nichtionische oberflächenaktive Mittel aufgeführt,, die verwendet werden können. (Diese Beispiele sollen keine Beschränkung sein, .und im folgenden enthalten irgendwelche Alkylgruppen bevorzugt 1 bis 30 Kohlenstoff atome, mehr bevorzugt 4 bis 20 Kohlenstoffatome.)

. Polyäthylenglykol-alkylester, Glycerin-monoalkylester, Sorbitan-monoalkylester, Saccharoseester u.a.;

Polyoxyalkylen-alkyläther, Polyoxyalkylen-alkylaryläther u.a.;

Polyoxyalkylen-alkylamin u.a. ;

Polyoxyalkylen-alkylamid, aliphatisches Äthanolamid, Methylolamid u.a., und

Polyoxyalkylsorbitan-alkylester, Polyoxyalkylenglykolalkylester u.a..

Von diesen nichtionischen oberflächenaktiven Mitteln sind solche nichtionischen oberflächenaktiven Mittel mit

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2638S7R

At

einem Molekulargewicht von etwa 500 bis etwa 10 000, wie sie aufgeführt wurden, bevorzugt.

Insbesondere sind Polyoxyalkylen-alkylaryläther und Polyoxyalkylensorbitan-alkylester bevorzugt.

Po lyoxyalkylen-alkylarylä ther wird dargestellt durch die allgemeine Formel (I)

R{Ar}O{AO>_nH (I)

R eine verzweigte oder geradkettige Alkylgruppe mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen bedeutet, z.B. Butyl, t-Butyl, Octyl, γ-Butyloctyl u.a.,

Ar eine Phenyl- oder Naphthylgruppe bedeutet,

4AO)- eine Alkylenoxidgruppe mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen bedeutet, z.B. Äthylenoxid oder Propylenoxid, und

η eine ganze Zahl von 5 bis 100, bevorzugt 15 bis 50, bedeutet.

Von diesen Verbindungen, die durch die Formel (I) dargestellt werden, sind Polyoxyäthylen-alkylphenyläther besonders bevorzugt.

Polyoxyalkylensorbitan-alkylester wird durch die folgende allgemeine Formel (II) dargestellt

C CHCH₂OCOR¹

OHC „CH04ACU ,H
^C ⁿ

04A0}

ORIGINAL INSPECTED

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-(AO)- die zuvor gegebene Bedeutung besitzt, R¹ eine verzweigte oder geradkettige Alkylgruppe, z.B.

Dodecyl, Pentadecyl, Heptadecyl u.a., bedeutet, und n¹, n" und ri^IfI je ganze Zahlen von 5 bis 100 bedeuten.

Von den Verbindungen, die durch die Formel (II) dargestellt werden, sind Polyoxyäthylensorbitan-alkylester besonders bevorzugt.

Nichtionische oberflächenaktive Mittel, die im Handel erhältlich sind, sind Nissan Nonion, Nissan Naimin und Nissan Naimid, hergestellt von Nippon Oil & Fats Co., Ltd.; Emusol und Emuigen, hergestellt von Kao Soap Co., Ltd.; Emulex, hergestellt von Japan Emulsion Co., Ltd.; Emulox und Sumit, hergestellt von Yoshimura Oil Chemicals Co., Ltd.; Noigen, hergestellt von Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.: und Livonox, hergestellt von Lion Oil & Fats Co., Ltd.

Bei der vorliegenden Erfindung beträgt die Menge an zugegebenem nichtionischem oberflächenaktivem Mittel bevorzugt ' etwa 1 bis etwa 15 Gew.%, bezogen auf das Gewicht des in der dicken Flüssigkeit enthaltenen polymeren Materials.

Zur Herstellung eines porösen Polymerfilms mit einem Elektroendosmosefaktor von 0 bis plus etwa 10 mm können zu der obigen dicken Flüssigkeit Celluloseäther zusammen mit einem nichtionischen oberflächenaktiven Mittel und/oder nichtionische oberflächenaktive Mittel zugegeben werden.

Bei der vorliegenden Erfindung werden als Celluloseäther solche verwendet, worin die Hydroxygruppen teilweise veräthert sind, z.B. Methylcellulose, Äthylcellulose u.a. Es ist bevorzugt, daß die Methylcellulose und die Äthylcellulose bevorzugt ein durchschnittliches Molekulargewicht von 'etwa 60 000 bis etwa 500 000, bevorzugt von 80 000 bis 200 000,

ORIGINAL INSPECTED

- Vr-

besitzen. Besonders "bevorzugt sind Methylcellulose und Äthylcellulose mit einem durchschnittlichen Substitutionsgrad von etwa 1,0 bis 1,9. Der Ausdruck "Substitutionsgrad" bedeutet, wieviele .der in der Cellulose, 'enthaltenen Hydroxygruppen (3 Hydroxygruppen/1 Einheit Cellulose) substituiert sind. Wenn beispielsweise eine Hydroxygruppe durch eine Methoxygruppe substituiert ist, beträgt der Substitutionsgrad" 1. Die erfindungsgemäßen Celluloseäther umfassen solche Äther, deren Substituenten teilweise durch Hydroxyalkoxygruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen substituiert sind, z.B. eine Hydroxypropoxygruppe, eine Hydroxyäthoxygruppe u.a. (Substitionsgrad etwa 0,1 bis 0,3), usw.

Die Menge an zugegebenem Celluloseäther beträgt bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 15 Gew.$, bezogen auf das Gewicht des in der dicken Flüssigkeit enthaltenen polymeren Materials.

Bei der erfindungsgemäßen Herstellung des porösen Polymerfilms für die Elektrophorese werden solche Zusatzstoffe, wie sie im allgemeinen auf diesem Gebiet verwendet werden, z.B. Weichmacher (wie Triphenylphosphat, Dibutylphthalat), hydroskopische Mittel (z.B. Glycerin, Äthylenglykol), Hilfsmittel für die Bildung-,.feiner Poren (z.B. anorganische Salze, wie Zinkchlorid, Magnesiumperchlorat), Mittel für die Kontrolle des Porendurchmessers (z.B. Triacetin) und ähnliche, zugegeben. Es ist am meisten bevorzugt, daß die Menge an irgendwelchen Zusatzstoffen, die in diesem Absatz aufgeführt wurden, von 0 bis 50 Gew.% beträgt, bezogen auf das filmbildende Polymer, am meisten bevorzugt (sofern verwendet) von 1 bis 20 Gew.%, für jede Art von Zusatzstoff, wobei jedoch die Gesamtmenge an Zusatzstoffen 50 Gew.% oder weniger beträgt, bezogen auf das filmbildende Polymer.

Aus der so hergestellten dicken Flüssigkeit kann man nach den in den japanischen Patentanmeldungen 28845/1974 und

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677'/'1975 beschriebenen Verfahren einen Film herstellen.

Das obige Herstellungsverfahren ist ein Beispiel für die Herstellung des erfindungsgemäßen Trägers für die Elektrophorese.

Der erfindungsgemäße Träger für die Elektrophorese kann ■auch nach anderen, als den oben erwähnten Verfahren hergestellt werden. Sämtliche porösen Polymerfilme, die einen Elektroendosmosefaktor von 0 bis plus etwa 10 mm besitzen, sind erfindungsgemäße Träger für die Elektrophorese.

Als erfindungsgemäße Träger für die Elektrophorese kann man solche Träger mit einem Porendurchmesser von etwa 0,1 bis etwa 10/u, mit Zellen von nicht weniger als 50?£ und einer Dicke von etwa 30 bis etwa 1000/u verwenden. Bevorzugt werden solche Träger verwendet, die einen Porendurchmesser von 0,3 bis 3|0 /u, 70 bis 90% Zellen und «- eine Dicke von 100 bis 300yu besitzen. Der Ausdruck "Zellen" (V), wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird folgendermaßen definiert:

Leerraumverhältnis V = W/S

Testverfahren: Ein Blatt bzw. ein Film wird in Wasser eingetaucht, und die in dem Film enthaltende Wassermenge wird bestimmt, wobei W das Wasservolumen bedeutet, das in dem Film enthalten ist, und S das Volumen des Films bedeutet.

Träger für die Elektrophorese, die die erfindungsgemäß hergestellten polymeren Materialien enthalten, zeigen eine niedrige Elektroendosmose und besitzen einen Elektroendosmosefaktcr von 0 bis plus etwa 10 mm, bestimmt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. Es ist so möglich, einen linearen pH-Gradienten zu erhalten, wenn ' man das isoelektrische Fokussieren unter Verwendung eines Trägerampholyten durchführt, und somit wird ein isoelektrisches Fokussieren möglich.

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Verwendet man als Träger für die Elektrophorese einen erfindungsgemäßen.Polymerfilm, so kann man eine Reihe von Proben gleichzeitig fraktionieren. Man kann weiterhin die Fraktionierung mit einer sehr geringen Menge an Trägerampholyten durchführen, und dadurch werden die Betriebskosten gesenkt. Außerdem sind die erfindungsgemäßen Träger für die Elektrophorese wesentlich fester als die bekannten Träger, die eine dünne Polyacrylamidgelschicht enthalten. Die erfindungsgemäßen Träger besitzen insbesondere eine gute Wärmestabilität und eine ausgezeichnete DimensionsStabilität und werden bevorzugt für eine genaue isoelektrische Fokussierung verwendet.

Die Erfindung betrifft somit einen Träger für die Elektrophorese, enthaltend einen porösen Polymerfilm mit einem Elektroendosmosefaktor von 0 bis plus etwa 10 mm, und ein Verfahren zur Herstellung des Trägers. Zur Herstellung : · d.es porösen Polymerfilms wird ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel und/oder ein Celluloseäther zu einer Lösungsmittelmischung zugegeben, die mindestens ein polymeres Material für die Bildung eines Films und ein Lösungsmittel enthält.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung; in den Beispielen werden, sofern nicht anders angegeben, alle Teile und Prozentgehalte durch das Gewicht ausgedrückt.

Beispiel 1

Zu einer Lösung (dicke Flüssigkeit), die 3 Teile Cellulosetriacetat, 3 Teile Cellulosediacetat, 2 Teile Triacetin, 60 Teile Methylenchlorid, 28 Teile Methanol und 4 Teile Wasser enthält, gibt man 0,3 Teile Polyoxyäthylen-nonylphenyläther (Zahl der Polyoxyäthylen-Einheiten = 15; Molekulargewicht = etwa 860), ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel,Emulex NP-15, hergestellt von Japan Emulsion Co., Ltd.) zur Herstellung einer einheitlichen Lösung,

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Diese Lösung wird auf eine Glasplatte in einer Dicke von 1 mm gegossen. Die so gegossene Lösung wird zuerst bei 25⁰C getrocknet,und wenn die gesamte Oberfläche des entstehenden Films weiß geworden ist, wird der Film von der Glasplatte abgeschält, in einen Rahmen gespannt und 1 h bei 100⁰C getrocknet. Der so erhaltene Film ist 150 Ai dick und und enthält etwa 70% Zellen und sein durchschnittlicher Porendurchmesser beträgt 0,4/U.

Der so hergestellte poröse Film besitzt einen plus 0,5 mm Elektro endo smo s ef akto r, bestimmt nach dem oben beschriebenen Verfahren.

Beispiel 2

Zu einer Lösung, die 3 Teile Cellulosetriacetat, 3 Teile Cellulosediacetat, 2 Teile Triacetin, 60 Teile Methylenchlorid, 28 Teile Methanol, una 4 Teile Wasser enthält, gibt man 0,5 Teile Methylcellulose (hergestellt von Shin-etsu Chemical Industry Co., Ltd., Metholose SM 4000; durchschnittliches Molekulargewicht = 86 000) zur Herstellung einer einheitlichen Lösung. Diese Lösung wird auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgegossen und getrocknet. Der so erhaltene Film ist 150/U dick, enthält etwa 80% Zellen und besitzt einen durchschnittlichen Porendurchmesser von 0,5/U.

Der so hergestellte Film zeigt einen Elektroendosmosefaktor von plus 3»3» bestimmt nach dem oben beschriebenen Verfahren.

Der Film wird in Stücke von 5 x 10 cm geschnitten, in eine 2%ige Ampholine-Lösung (hergestellt von LKB, Schweden; pH 3,5 bis 10), die 10% Saccharose enthält, eingetaucht und anschließend an einer Glasplatte befestigt und unter ' Verwendung einer isoelektrischen Vorrichtung mit isoelektrischem

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to

Punkt (hergestellt von Giaman Co., Ltd.) 2 h bei 300 bis 800 V der isoelektrischen Fokussierung unterworfen. Eine Elektrodenlösung für die Anode wird hergestellt, indem man zwischen die Elektrode und den porösen Cellulosefilm ein 6 χ 60 mm Filterpapier, das mit einer 0,5%igen Phosphorsäurelösung, die 20% Saccharose enthält, befeuchtet ist, gestellt. Die für die Kathode wird hergestellt, indem man ein 6 χ 60 mm Filterpapier, das mit einer 0,5%igen Äthylendiaminlösung, die 5% Sacchrose enthält, befeuchtet ist, stellt.

Die Mitte des Films mwird mit einer 1?6igen Hämoglobinlösung in einer Menge von 1,6/ul/cm mit einer Mikropipette benetzt.

Bei der isoelektrischen Fokussierung wird das Hämoglobin durch den obigen porösen Film in vier Teile fraktioniert. Wird der pH-Gradient mit einer Mikro-pH-Elektrode gemessen (hergestellt von Fuji Kagaku Keisoku Co., Ltd.), so erhält man, wie in Fig. 3 dargestellt, eine gerade Linie für den pH-Gradienten.

Beispiel 5

In 50 Teilen Methanol und 23 Teilen Wasser werden 16 Teile in Alkohol löslichem Nylon gelöst (lösliches Nylon CM-4000, hergestellt von Toray Co., Ltd.). Anschließend werden 10 Teile Diäthylenäther als Zusatzstoff zugegeben. Dann werden zur Herstellung einer einheitlichen Lösung 0,4 Teile Emulex NP-15 (das gleiche, wie es in Beispiel 1 verwendet wurde) zugegeben.

Diese Lösung wird auf eine Glasplatte gegossen und auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt; man erhält einen porösen Nylonfilm.

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Der so hergestellte Film zeigt einen Elektroendosmosefaktor von plus 1,0 mm, bestimmt nach dem oben beschriebenen Verfahren.

Wird mit diesem Film eine isoelektrische Fokussierung auf gleiche Weise, wie in Beispiel 2, durchgeführt, so erhält man einen linearen pH-Gradienten, der im wesentlichen gleich wie der von Beispiel 2 ist.

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Claims

Patentansprüche

1. Träger für die Elektrophorese, dadurch gekennzeichnet, daß er einen porösen Polymerfilm mit einem Elektroendosmosefaktor von 0 bis plus etwa 10 mm enthält.

2. Träger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer, das den porösen Polymerfilm ergibt, ein nichtionisches Polymer.mit einem Molekulargewicht von etwa 10 000 bis etwa 50 000 ist.

3. Träger nach mindestens einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer, das den porösen Polymerfilm ergibt, Nitrocellulose, Acetylcellulose, Acetylbutylcellulose, Cellulosepropionat, ein Polyamidharz und/oder ein Polyvinylchloridharz ist.

4. Verfahren zur- Herstellung eines einen porösen Polymerfilm enthaltenden Trägers für die Elektrophorese, dadurch gekennzeichnet, daß man ein nichtioriisches oberflächenaktives Mittel und/oder einen Celluloseäther zu einer Lösungsmittelmischung zugibt, die mindestens ein polymeres Material für .die filmbildung 'und ein Lösungsmittel enthält, und einen porösen Polymerfilm herstellt .

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel ein gutes Lösungsmittel, ein schlechtes Lösungsmittel und ein Nicht-Lösungsmittel für das Polymer enthält.

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das nichtionische oberflächenaktive Mittel ein Molekulargewicht von etwa 500 bis etwa 10 besitzt.

709828/05U original inspected

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 4, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß als nichtionisches oberflächenaktives Mittel Polyoxyalkylen-alkylaryläther und/oder Polyoxyalkylen-sorbitan-alkylester verwendet werden.

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