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Verfahren zur Herstellung von Ergolinderivaten auf
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fermentativer Basis Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur industriellen
Gewinnung von Ergolinderivaten, insbesondere von-Alkaloiden und.9,10-Dihydroalkaloiden
der Ergotoxin gruppe sowie von Ergometrin, bei welchem ein neuer Stamm von Claviceps
purpurea (Fr.) Tul. submers in künstlichen Medien kultiviert und die dabei gebildeten
Mutterkornalkaloide aus der Fermentionsflüssigkeit gewonnen und ggf. 9,10-dihydriert
werden. Diese Alkaloide und 910-Dihydroalkaloide sind wegen ihres hohen therapeutischen
Wertes bekannt und werden in der Inneren Medizin, Neurologie und Gynäkologie eingesetzt.
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Die industrielle Gewinnung von Mutterkornalkaloiden erfolgt bekanntlich
heute noch in großem Umfang durch eine feldbaumäßige Anzucht alkaloidhaltiger Sklerotien
des auf Roggen parasitierenden Mikroorganismus Claviceps purpurea. Um die damit
verbundenen erheblichen Nachteile zu umgehen, werden seit längerem Versuche unternommen,
Claviceps auch unter nichtparasitären Bedingungen zu einer Alkaloidbildung zu veranlassen.
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Nach den allgemeinen Erfahrungen sind zu einer solchen, bei Kultivierung
in kunstlichen Medien erfolgenden Biosynthese von Mutterkornalkaloiden allerdings
nur sehr wenige, eigens zu diesem Zweck gezüchtete Stämme von Clavicepg befähigt.
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Da die Zusammensetung des Alkaloidspektrums dieser Stämme dem Erbgut
entsprechend unterschiedlich ist, bildet wiederum nur ein Teil von ihnen Alkaloide
der Ergotoxingruppe, die innerhalb der besonders wertvollen Mutterkernalkaloide
vom Peptidtyp therapeutisch differenziert ist.
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Trotz der Existenz einiger solcher, im einzelnen näher beschriebener
Stämme (vgl. ungarische Patentschrift r.
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150 631, Patentschrift der DDR Er. 41.967, britische Patentschrift
Nr. 1.158,380, deutsche Patentschriften Nr. 1.806.984, 1.909.216) ist aber das Problem
einer saprophytischen Gewinnung von Alkaloiden der Ergotoxingruppe allein oder in
Kombination mit anderen Mutterkornalkaloiden im industriellen Maßstab keineswege
gelöst.
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Für eine kontinuierliche Produktion ist es Voraussetzung, daß laufend
ein leitstungsfähiges Ausgangsmaterial des Stammes als Inokulum für den Fermentationsprozeß
in großer Menge sowie methodisch einfach und sicher zu erzielender Preise zur Verfügung
steht. Die in der technischen Mikrobiologie hierbei übliche und günstigste Methode
besteht in der Verwendung von speziellen Vermehrungseinheiten des Organismus (Konidiosporen),
die es gestatten, nicht nur die gewünschten Eigenschaften des Stammes über viele
Jahre hinweg durch lyophilisierte Sporenkonserven, also ohne eine, wie in der deutschen
Patentschrift Nr.
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1.206.384 dargestellt, äußerst komplizierte und aufwendige Stammführung
stabil zu erhalten, sondern vor allem auf Grund ihrer hohen Zahl/Volumeneinheit
mit einer geringen Menge Inokulum große Mengen Nährlösung zu beimpfen.
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Die Anwendung dieser Methode setzt eine bestimmte, ebenfalls im Erbgut
fixierte Eigenschaft des Stammes voraus, nämlich unter entsprechenden Bedingungen
eine große Zahl von Sporen mit einer hohen Potenz zur Biosynthese der Alkaloide
zu bilden, so daß die Beimpfung der Nährlösung auch unter großtechnischen Bedingungen
mit einer Suspension von Konidiosporen erfolgen kann. Gerade diese Eigenschaft fehlt
aber, wie aus der ungarischen Patentschrift Er. 150 631 sowie bei AMICI.u.a. (Appl.
Microbiology 18 (1969), S. 464-468) klar ersichtlich ist, den beschriebenen in saprophytischer
Kultur Alkaloide der Ergotoxingruppe bildenden Stämmen von Claviceps purpurea völlig
oder nahezu völlig, so daß wegen der notwendigen Zwischenvermehrung des Impfmaterials
auf festen Nährböden und der erforderlichen Homogenisierung des so gewonnenen Myzels
unter sterilen Bedingungen für die Anlage von Vorkulturen in industriellem Umfang
ungünstige Voraussetzungen bestehen.
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Aus den genannten Quellen geht ebenfalls hervor, daß bei diesen Ergotoxinbildnern
bis zum Ende des Fermentationsprozesses nur der geringere Teil des in den Zellen
entstehenden Ergotoxins durch die Zellwand in das umgebende wäßrige Kulturmedium
übertritt.
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Dementsprechend ist zur vollständigen Gewinnung der gebildeten Alkaloide
die separate Aufarbeitung sowohl des Kulturfiltrats als auch des Mycels erforderlich.
Der hohe Pigment- und Ballaststoffanteil, der in der Regel von solchen Stämmen,
die zur Biosynthese von XCutterkornalkaloiden in submerser Kultur befähigt sind,
gebildet wird, bedingt überaus kompliierte Verfahrensweisen der Aufarbeitung bei
nicht befriedigenden Stoffausbeuten So werden
nach dem britischen
Patent Nr. 1 158 380 das erhaltene Kulturfiltrat mit Chloroform bei pH 9 extrahiert,
der erhaltende Extrakt mit wäßriger Weinsäure extrahiert, der so gewonnene wäßrige
Extrakt erneut mit Chloroform bei pH 9 extrahiert und dieser Extrakt mit dem auf
ähnlich komplizierte Weise erhaltenen und gereinigten Mycelextrakt vereinigt, eingedampSt
und mit Hexan die Alkaloidrohbasen gefällt. Aus dem erhaltenen Niederschlag wird
mit Eisessig, Methanol und Schwefelsäure Ergotaminsulfat entfernt, der Rückstand
eingedampft, seine wäßrige Lösung bei pH 9 erneut mit Chloroform extrahiert, der
konzentrierte Chloroformextrakt an der 100-fachen Menge Silikagel chromatographiert
und schließlich das so gereinigte Ergokryptin aus Benzol als Base isoliert. Aus
einer weiteren chromatographischen Praktion wird nach Eindampfen und Lösen des RUckstandes
in wäßrigem Aceton weiteres Ergotamin gewonnen.
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Die Nacharbeitung der in der britischen Patentschrift Nr.
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1 158 380 und US-Patentschrift Nr. 3 485 722 angegebenen allgemeinen
Verfahren zur Isolierung von Mutterkornpeptidalkaloiden führte bei den Kulturen
eines unten näher beschriebenen neuen Stammes von Claviceps purpurea nicht zum Erfolg.
Störend wirkte sch dabei vor allem die starke Neigung des Kulturfiltrats und Mycelextrakts
zur Emulsionsbildung bei Chloroformextraktion aus. Es gelang ferner weder das Ergotoxin
in eine kristalline Base zu überführen, noch die in o,a. Patentschriften genannten
Auebeuten bei nichtkristallisierten Rein- oder Rohalkaloidkonzentraten zu erreichen.
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Gemäß DDR-Patent Nr. 41 967 wird ein in an sich bekannter Weise aus
einer geringe Alkaloidkonzentrationen enthaltenden - Kulturflüssigkeit gewonnener
Extrakt, der nebeneinander Ergotoxin und Ergometrin enthält, mit zunehmend polaren
Elutionsmitteln
chromatographiert und die Einzelalkaloide in an sich bekannter Weise kristallisiert.
Es ist jedoch allgemein bekannt, daß die Elution mit methanolhatigen Lo,-sungsmitteln
zu unbefriedigend hohen Pigmentanteilen im Ergometrin führt.
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Die Druckhydrierung von Ergotoxin wird nach der deutschen Patentschrift
Nr. 883 153 und dem Can. Patent Nr. 470 573 mit hochaktivem Pd bzw. trägerfixiertem
Pd ausgeführt, Ein solches Verfahren führt, offenbar bedingt durch nicht befriedigende
Selektivität, zu unerwünschten Pigmentierungen des Hydrierproduktes, weshalb zusätzliche
Reinigungsschritte erforderlich sind.
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Die Erfindung bezweckt, die industrielle Herstellung von Ergolinderivaten,
insbesondere von Alkaloiden und 9,10-Dihydroalkaloiden der Ergotoxingruppe sowie
von Ergometrin, zu verbessern. Ihr liegt die Aufgabe zugrunde, ein entsprechendes
Verfahren anzugeben.
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Es wurde gefunden, daß ein Stamm von Claviceps purpurea (Fr.) Tul,
der mit Hilfe künstlicher, anorganische Sticlrstoffverbindungen, Zucker, organische
Säuren und übliche anorganische Salze enthaltender Nährmedien in Submerskultur Alkaloide
der Ergotoxingruppe, Ergometrin sowie weitere Ergolinderivate bildet, sowohl eine
für eine industrielle Nutzung sehr günstige Alkaloidsynthese aufweist, als auch
auf festen oder in flüssigen Medien unter bes timmten Bedingungen eine für fermentationstechnische
Belange äußerst vorteilhafte Menge von Sporen mit einer hohen Potenz zur Alkaloidsynthese
bildet.
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Darüber hinaus sind das gebildete Ergotoxin zu einem erueblichen Teil
und das Ergometrin wie-üblich praktisch vollständig in dem das Mycel umgebenden
Fermentationsmedium enthalten Es wurde weiter gefunden, daß sich ein durch Filtrat
ion der Kulturflüssigkeit des neuen Stammes von Claviceps purpurea ohne, jedoch
besser nach Verdünnung mit demselben Volumen Wasser erhaltenes, mit Ammoniak auf
pH 8-9 eingestelltes Kulturfiltrat mit niederen Alkylcarbonsäureestern, vorzugsweise
Äthylacetat, bei der Verdünnungsvariante jedoch auch mit chlorierten Kohlenwasserstoffen,
voræugsweise Methylenchlorid, praktisch erschöpfend und ohne störende Emulsionsbildung
e trahieren läßt. Dabei ergibt sich bei der Verdünnungsvariante neben der angestrebten
Senkung das spezifischen Ballaststoffanteils überraschend eine bedeutende Steigerung
der im Kulturfiltrat enthaltenen Ergotoxinmenge.
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Die nach der Filtration anfallende Biomasse kann in Ashängigkeit vom
Alkaloidrestgehalt mit Aceton extrahiert, der durch Filtration erhaltene Klarextrakt
nach Binetellung mit wäßrigen Säuren, vorzugsweise Phosphorsäure, auf pH 2-3 durch
Kohlenwas-serstoffgemische, wie Petroläther oder Petroläther-Xylol gereinigt, die
abgeschiedene wäßrige Phase nach Einstellung mit wäßriger Ammoniaklösung auf pH
8-9 mit niederen Alkylcarbonsäureestern, vorzugsweise Äthylacetat, extrahiert und
der erhaltene Extrakt mit Wasser gewaschen werden.
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Es wurde ferner gefunden, daß es darüber hinaus tberraschend und in
eleganter Weise auch möglich ist, die Mutterkornalkaloide aus der mit Ammoniak alkälisierten
Kulturflüssigkeit des neuen Stammes von Clavicepa purpurea ohne vorherige Abtrennung
der Biomasse unter Zusatz von Ammoniumsulfat mit niederen Alkylcarbonsäureestern,
vorzugsweise Äthylacetat, direkt zu extrahieren und durch Plüssig-flüssig-Extraktion
mit verdünnten wäßrigen Säuren, vorzugsweise Phosphorsäure, sowie anschließende
Flüssig-flüssig-Extraktion des erhaltenen wäßrigen Extraktes bei pH 8-9 mit niederen
Alkylcanonsäureestern, vorzugsweise Äthylacetat, von störenden Begle-itstoffen zu
befreien, Die in vorstehender Weise gereinigten Alkaloidextrakte können bei t c
+ 30 °C eingedampft und Bie erhaltenen Konzentrate der differenzierten Endreinigung
der Alkaloide angeführt werden.
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Es wurde weiter gefunden, daß es, vergleichend zur DDR-Patentschrift
Nr. 41 967, zur Gewinnung der Reinalkaloide von Vorteil ist, die in o.a. Weise erhaltenen
Rohalkaloidkonzentrate in 1 bis 3 Volumenteilen Chloroform zu lösen, die Lösungen
bei t # + 10 ° aufzubewahren, das überraschend praktisch quantitativ auskristallisierende,
pigmentarme Ergometrin-Chloroformaddukt absutirennen und in Säureadditionssalze
hohen Reinheitsgrades, vorzugsweise Hydrogenmaleinat, zu überführen. Das nach Abtrennung
des Ergometrins erhaltene Filtrat kann nunmehr bei t s + 30 °C störungsfrei aufkonzentriert,
vorteilhaft durch Adsorption und nachfolgende Desorption im Batch-Verfahren oder
im säulenchromatografischen Verfahren unter Einsatz von Aluminiumoxid im vorteilhaften
Verhältnis von 1 : 20 oder im Verhältnis 1 : 5, berechnen auf die Gesamtalkaloidmenge
im Alkaloidkonzentrat, bei einem Zusatz von Aktivkohle (Adsorptionsmittelverhältnis
Aluminiumoxid : Aktivkohle 5 : 1) und niederen Alkylcarbonsäureestern, vorzugsweise
Äthylacetat oder Chlorkohlenwasserstoffen,
vorzugsweise Chloroform,
oder Zvweikomponentengemischen vorstehender Lösungsmittel miteinander oder mit aromatischen
Kohlenwasserstoffen, vorzugsweise Benzol, nach Eindampfen der Extrakte oder Eluate
bei t # +30 0C in Ergotoxin-Ergotoxinin-Gemische, diese durch Kristallisation aus
aromatischen Kohlenwasserstoffen wie Benzol, Toluol oder Xylol in epimerenfreie,
hochreine, kristalline Ergotoxin-Aromatenaddukte und letztere ggf. in Säureadditionssalze
des Ergotoxins, vorzugsweise Äthansulfonat, überfulirt werden.
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Es wurde ferner gefunden, daß das in o.a. Weise erhaltene Ergotoxin
entweder in Gegenwart weniger aktiven Raney-Nickels bei +50 - 7Ö0C, vorzugsweise
+60 0C, und einem: Wasserstoffdruck von 30 - 70 atü, vorzugsweise 50 atü, in Dioxan
oder aber bei Normaldruck und +20 bis 30 OC, vorzugsweise +25 OC, in Gegenwart eines
5-10gOigen Palladiumkohlekatalysators in wäßrigem Dioxan in einem Umlaufverfahren
zu pigmentfreiem 9,10-Dihydroergotoxin hydriert werden kann. Die hydrierten Basen
werden in ansich bekannter Weise in die galenisch verwertbaren Säureadditionssalze,
vorzugsweise Hydrogenmaleinat und Äthansulfonat, überführt.
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Der neue, durch Züchtung erhaltene Stamm mit bisher unbekannten Merkmalen
für eine technisch günstige und ökonomisch vorteilhafte industrielle Erzeugung von
MutterRornalkaloiden, insbesondere von Alkaloiden der Ergotoxingruppe und von Ergometrin4
wurde beim Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena der
Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin hinterlegt und trägt die Nummer
DREHT PA 130.
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Der Stamm wurde aus einer Kultur selektioniert, die von einem Sklerotium
aus einer Versuchaparzelle stammt und mutagen behandelt wurde. Er eigt die in Tabelle
1 zusammengefaßten morphologischen Eigenschaften.
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Die Erfindung soll nachstehend an einigen Ausführungsbeispielen näher
erläutert werden: Beispiel 1: Zur Anzucht von Konidiosporen wird aus einer in Magermilch
lyophi;L getrocknete Sporen enthaltenden Stammkonserve eine Suspension hergestellt,
die auf ein 3%iges Agarmedium (pH 6,0) mit 15% Bierwaürze, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5%
(NH1)2PO1 und 0,1 ß Ammoniumzitrat übertragen und als Schrägagarkultur 14 Tage bei
19 °C bebrütet wird.
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Als Impfmaterial für Submerskulturen werden nach diesem Verfahren
in 1000 ml-Jenaer Weithalsflaschen 1 , io10 Sporen/Kulturgefäß erhalten, mit denen
bei Bedarf bis zu 120 1 Nährlösung beimpft werden können.
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Beispiel 2: Die Herstellung des Inokulume erfolgt durch Suspension
der gemäß Beispiel 1 angezogenen Sporen, die in einer Konzentration von 1 . 105
Sporen/ml in ein Flüssigmedium das 15 % Bierwürze und 2 % Hefeextrakt enthält, übertragen
werden.
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Die Kultivierung erfolgt bei 22 °C in 500 ml-Rundkolben mit 120 ml
Flüssigmedium auf einer Rundschwingschüttelmaschine. Die Kultur enthält nach 14
Tagen 6 . 109 Sporen/ Kolben, die als Impfmaterial für die Alkaloidfermentatioion
verwendet werden.
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Beispiel -3: Die Herstellung des Inokulume zur Sporenanzucht erfolgt
gemäß Beispiel 1. Als Nährboden wird ein 3%iges Agarmedium (pH 6,8-6,9) verwendet,
das 3 % Saccharose, 0,3 % NaN03, 0,1 Io K2HP04, 0,05 ffi MgS04 . 7H20, 0,05 % KCl,
0,001 u FeS04 . 7H20 und 1 % Maisquellwasser enthält.
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In 500 ml-Industrieglas-Enghalsflaschen awerden in Schrägagarkultur
nach 14-taglger Bebrütung bei 24 °C 3.109 Sporen/Kulturgefäß erhalten, die als Ausgangsmaterial
für SNbmarskulteren zur Alkyloidsynthese verwendet werden können.
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Beispiel 4: ile Sporen einer gemäß Beispiel 1 angezogenen Impf-materialkultur
werden suspendiert und ein Teil davon als Inokulum in gleichen mengen auf Stehrundkolben
(Fassungsvermögen 500 ml) mit je 120 ml Vorkulturmedium (10 % Saccharose, 1,5% Ammoniumzitrat,
0,01% Ca(NO3)2, 0,025% KN2PO4, 0,01% KCl, 0,03% MgSO4, =,001% FeSO4, 0,0004% ZnSO4;
aqua dest.; pH 5,5; Sterilisation 30 min bei 0,5 atü) verteilt. Die Kolben werden
bei 24 °C auf einer Rundschwingschüttelmaschine (175 U/min) geschüttelt. Nach 7
Tagen wird der Inhalt der Kolben im Verhältnis 1:10 auf Erlenmeyerkolben (Fassungsvermögen
500 ml) mit je 120 ral Haupkulturmedium (20% Saccharose, 1% Ammoniumzitrat, 0,1%
Ca(NO3)2, 0,025% KH2PO4, 0,01% KCl, 0,03%MgSo4, 0,001%FeSO4, 0,0004 5 ZnS04; aqua
dest.; pH 5,5; Sterilisation 30 min bei 0,5 atü) überimpft, Diese Kolben werden
unter den gleichen Bedingungen wie zuvor geschüttelt.
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Nach 14 Tagen werden mit Hilfe der van Urk-Reaktion 2470 mg Alkaloide/l
Kulturflüssigkeit nachgewiesen, berechnet als Ergotoxinbimaleinat. Die Alkaloide
werden mit Methylenchlorid extrahiert, analog der Methode von HOHMANN & ROCHELMEYER
(Arch. Pharmazie 297 (1964) S. 186/187) auf formamidiprägnierter Kieselgur dünnechichtchromatographihsch
getrennt und UV-spektralphotometrisch bestimmt. Es werden 1280 mg Ergotoxin und
340 mg Ergometrin/l gefunden, der Rest entfällt auf, zwei bisher noch nicht bekannte
native Peptidalkaloide und auf einfache Ergolinderivate wie Agroclavin, Chenoclavin
u.a.
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Eine parallel dazu durchgeführte Bestimmung des durch Saugfiltration
getrennten Myzels und Filtrats ergibt, daß das Ergometrin vollständig und darüber
hinaus 90 % des insgesamt gebildetsn,Ergotoxins im Filtrat enthalten sind.
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Beispiel 5: 10 Glaefermenter (Fassungsvermögen 2 1) werden mit einer
gemäß Beispiel 2 hergestellten Submerssporenkultur beimpft.
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Die Fermenter enthalten je 1,3 l Nährlösung A mit 10 % Saccharose,
1,5 % Ammoniumzitrat, 0,05 % KH2P04, 0,03 % MgS04, 0,001 % FeSO4 und 0,0004 % ZnS04
in Leitungswasser (pH 5,5); Sterilisation 30 min bei 0,5 atü). Die Fermentation
erfolgt bei 24 °C und einer Rührung von 400 Ulmin bzw.
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einer Belüftung von 0,3 1 Luft/min. Nach 7 Tagen wird der Inhalt eines
der Fermenter in einen 18 l-Edelstahlfermenter mit 10 1 Nährlösung B überführt.
Die Nährlösung B enthält 10% Saccharose, 1,4%Zitronensäure, 1,0%Ammonkiumhydroxid
(25%ig), 0,05% Ca(NO3)2, 0,025% KH2PO4, 0,01% KCl, 0,03% MgSO4, 0,001% FeSO4 und
0,0004%ZnSO4 in Leitungswasser; pH 5;5. Nach einer Kultivierung bei 24 OC, 360 U/min
und 2,-5 1 Luft/min wird am 5. Tag die Hälfte des Fermenterinhalte als Inokulum
für einen 63 1-Edelstahlfermenter mit 40 1 Nährlösung C verwendet. Die Nährlösung
C enthält 20 % Saccharose, 1,75% Zitronensäure, 0,075% KH2PO4, 0,02%KCl, 0,03 ç
MgS04, 0,003 % FeS04, 0,0012 % ZnS04 in Beitungswasser; Zugabe von Ammoniumhydroxid
bis pH 5,3; Sterilisation 60 min bei 110 OC, Die Kultur wird 7 Tage bei 24 °C mit'300
U/min gerührt und mit 27 1 Luft/min belüftet, nach Bedarf erfolgt eine Antischaummittelzugabe.
Mit Kulturende enthält die Kulturflüssigkeit 2640 mg Gesamtalkaloide/l.
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Eine entsprechend Beispiel 4 vorgenommene Analyee zeigt, daß davon
1300 mg auf Ergotoxin und 550 mg auf Ergometrin entfallen.
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Beispiel 6: Die Sporenmenge einer gemäß Beispiel 3 angezogenen Impfmaterialkultur
wird als Inokulum gleichmäßig in 2 Edelstahlfermenter (Fassungsvermögen 18 1) mit
je 10 1 Nährlösung A entsprechend Beispiel 5 verteilt, Die Permenter werden 7 Tage
lang bei 24 °C mit 360 U/min gerührt und mit 2,5 1 Luft/min belüftet. Danach wird
der Inhalt von 2 Fermentern in einen 250 l-EdelstahlSermenter überführt, der 180
1 Nährlösung B gemäß Beispiel 5 enthält, und bei 24 OG, 160 U/min und 0,5 1 Luft/Liter
Nährlösung x min kultiviert.
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Nach 5 Tagen wird die Kultur in einen 2000 l-Edelstahlfermenter mit
1400 1 Nährlösung C nach Beispiel 5 übertragen, jedoch enthält die Nährlösung zusätzlich
0,0005 % NiS04.
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Die Kultivierung erfolgt bei 24 00, 160 U/min und. 0,61 Luft/Liter
Nährlösung x min. Bei Bedarf erfolgt in allen Fermentern die Zugabe eines Antischaummittels.
Am 7. Tag enthält die Kultur 2430 mg Gesamtalkaloide/l Kulturflüssigkein. Bei einer
analytischen Bestimmung gemäß Beispiel 4 werden 1150 mg Ergotoxin und 490 mg Ergometrin/l
Kulturflüssigkeit gefunden, Beispiel 7: 200 1 Kulturfiltrat, erhalten aus einer
entsprechenden Menge gemäß Beispiel 6 hergestellter Kulturflüssigkeit, die vor der
Abtrennung des Mycels durch Zusatz von Wasser im Volumenverhältnis 1:1 unter Rühren
verdünnt wurde, alkalisiert man mit 25%igem Ammoniakwasser auf pH 8,5 und extrahiert
die- Ergotoxinalkaloide und Ergometrin mit 50 1 Äthylacetat unter Verwendung einer
2-stufigen Gegenstromextraktionsanlage. Den Äthylacetatextrakt konzentriert man
im
Vakuum bei # +30 °C auf 1/20 des Ausgangavolumens, versetzt den Eindampfrückstand
mit 2 Volumenteilen Chloroform, läßt zur Auskristallisation des Ergometrin-Chloroformadduktes
15 Std. bei +4 °C stehen, saugt ab und erhält 35,4 g gelbliches Ergometrin-Chloroformaddukt
in 75%iger Ausbeute.
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35,4 g Ergometrin-Chloroformaddukt löst man in Gegenwart von Aktivkohle
unter Erwärmen in 3,1 1 Aceton, fügt zum Piltrat die berechnete Menge Maleinsäurelösung
in Aceton hinzu, saugt das erhaltene kristalline Ergometrin-bimaleinat ab und trocknet
die Substanz bei +70 00. Man erhält das Alkaloidsalz als dc-reines, weißes bis gelblichee,
kristallines Pulver in 9iger Ausbeute mit einem Reinheitsgrad von 98 bis 100% Spezifische
Drehung (α)20 = +50 OC (c = 1 in Wasser).
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Nach weiterer Konzentration des erhaltenen ergotoxinhaltigen Filtrats
auf 0,297 1 a) chromatographiert man unter Verwendung einer, berechnet auf die Gesamtalkaloidmenge
im Alkaloidkonzentrat, 20-fachen Menge Aluminiumoxid der Akt.-Stufe I neutral über
eine Säule mit Äthylacetat und eluiert mit 3,-8 1 des gleichen Lösungsmittels,.
Den nach Eindampfen des Eluates im Vakuum bei # +30 °C zur Trockne erhaltenen Eindampfrückstand
(74,2 g) überführt man durch Aufnehmen in 0,212 1 Benzol und Stehenlassen der Lösung
innerhalb 15 Std. bei +4 °C in das Ergotoxin-Benzpladdukt, saugt das auskristallisierte
Produkt ab, wäecht mit Benzol nach und trocknet im Vakuumexeikkator.
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Man erhält 55,2 g dc-reinee, weißes kristallines Ergotoxin-Benzoladdukt
mit einem Reinheitsgrad von 95 %. Spezifische Drehung (α)D20 = -183° (c=1,8
in CHCl3) oder
b) rührt man mit der 20 fachen Menge Aluminiumoxid
der Akt.-Stufe I neutral, berechnet auf die Gesamtalkaloidmenge im Alkaloidkonzentrat,
bis die Mischung farblich homogen ist. Nach 15 min Stehenlassen extrahiert man 3mal
mit je 3,82 1 Äthylacetata, engt den vereinigten Extrakt bei + 30 0-C ur Trockne
ein, verfährt in der weiteren Aufarbeitung in analoger Buise nach a) und erhält
52,5 g dd-reines weißes, kristallines Ergotoxin-Benzoladdukt mit einem Reinheitsgrad
von 95 % Spezifische Drehung (α) 2D0 = - 183 =1,8 in CHCl3).
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c) chromatografiert man unter Verwindung einer, berechnet auf die
Gesamtalkaloidmenge im Alkaloidkonzentrat, 5fachen Menge Aluminiumoxid der Akt.-Stufe
I neutral unter Zusatz von Aktivkohle (Adsorptionsmittelverhältnis Aluminiumoxid
; Aktivkohle 5 :1) über eine Säule mit Athylacetat und eluiert mit 4 1 des gleichen
Lösungsmittels, verfährt in der weiteren Aufarbeitung in analoger Weise nach a)
und erhält 55 g DG-reines, weißes, kristallines Ergotoxin-Benzoladdukt mit einem
Reinheitsgrad von 98%. Spezufische Drehung (α)20 = -183°(C=1,8 in CHCl3).
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d) rührt man unter Verwendung einer, berechnet auf die Gesamtalkaloidmenge
im Alkaloidkonzentrat, 5fachen Menge an Aluminiumoxid der Akt.-Stufe I neutral unter
Zusatz von Aktivkohle (Adsorptionsmittelverhältnis Aluminiumoxid : Aktivkohle 5
:1) in einer Rühr-Filtrationseinrichtung mit 3 1 ÄthYlacetat aus, extrahiert noch
zweimal mit Je 2,5 1 Äthylacetat, engt den vereinigten Extrakt bei + 30 °C zur Trockne
ein, verfährt in der weiteren Aufarbeitung in analoger Weise nach a) und erhält
55 g DC-reines, weißes, kristallines Ergotoxin-Benzoladdukt mit einem Reinheitsgrad
von 96%. Spezififsche Drehung (α)20= -183°(C=1,8 in CHCl3).
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55,2 g Ergotoxin-Benzoladdukt löst man unter' leichtem Erwärmen in
830 ml abs. Äthanol, fügt die berechnete Menge 0,5-molarer äthanoliecher (abs.)
Äthanolsulfonsäure und darauf 4,2 1 wasserfreien Äther hinzu, saugt das erhaltene
Kristallisat ab, trocknet die Substanz bei + 70 °C und erhält in 95%iger Ausbeute
de-reines, weißes, kristallines Ergotoxin äthansulfonat mit einem Reinheitsgrad
von 98-100%.
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Beispiel 8: Man extrahiert 12,0 l.; eines durch Filtration einer entsprechenden
Menge Kulturflüssigkeit erhaltenen Mycels innerhalb 3 h bei 20 °C mit 18 1 Aceton,
bringt den durch Filtration abgetrennten wäßrig-acetonischen Extrakt mittels Phosphorsäure
auf pH 2-3 und entfettet und reinigt durch zweimalige Extraktion mit 17 1 Petroläther
und 11 1 Petroläther/Xylol (Vol,-Verh. 1:1). Die erhaltene alkaloidhaltige schwere
Phase exbrahiert man bei pH 8-9 (Ammoniakwasser) erschöpfend mit insgesamt 7 1 Äthylacetat,
dampft die im Volumenverhäl:tnis 1:1 mit Wasser gewaschene Oberphase bei t = 30
°C auf 0,70 1 ein, versetzt mit 1,40 1 Chloroform und trennt nach Stehen über Nacht,
bei + 4 °C den ausgefallenen schlammartigen Niederschlag ab.
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Man konzentriert das Filtrat unter o.a. Bedingungen auf 0,180 1, chromatographiert
an 1,100 kg Aluminiumoxid (Akt.-StuSe I) mit 2 1.Äthylacetat, dampft die erhaltenen
Eluate im Vakuum zur Trockne und löst die Trockenrückstände in 100 ml Toluol (Benzol
oder Xylol). Nach Stehen über Nacht bei +4 °C trsnnt man die abgeschiedene Substanz
ab, trocknet im Vakuumexsikkator und erhält 14,0 g weißes, kristalliner Ergotoxin-Tolulo-Addukt
mit einem Reinheitsgrad von 98 - 100 %.
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Beispiel 9: Man extrahiert 10,0 l gemäß Beispiel 5 hergestellter IrLulturflüssigkeit
unter Rühren und Zusatz von 10 Gewicjts-Ammoniumsulfat bei pH 8-9 und 20 °C mit
25,0 1 Ätbylacetat, verwirft die schwere Biophase, extrahiert die organische Phase
zweimal mit je 5,0 1 2%iger Phosphorsäure, extrahiert die mit Ammoniakwasser auf
pH 8-9 eingestellten gesammelten wäßrigen Phasen zweimal mit je 5,0 1 Äthylacetat,
dampft die gesammelten organischen Phasen auf.200 ml bei t z +30 0C ein, versetzt
den Eindampfrücketand mit 400 ml Chloroform, saugt die nach Kühlstellung über Nacht
bei 4 °C auskristallisierte Substanz ab, trocknet im Vakuumexsikkator und erhält
4,20 g (71, 2% d.Th) Ergometrin-Chloroformaddukt mit einem Reinheitsgrad von 90,7
%. Das unter o.a. Bedingungen auf 120 ml konzentrierte ergotoxinhaltige Piltrat
chromatographiert man an 300 g Aluminiumoxid (Aktivitätsstufe I) mit Äthylacetat,
dampft das Eluat im Vakuum zur Trockne, löst den Trockenrückstand in 30 ml Benzol,
stellt über Nacht kühl bei t r +10 °, saugt die abgeschiedene Substanz ab, trocknet
im Vakuumexsikkator und erhält 7,95 g (= 73,6 ffi d.Th.) weißes, kristallines Ergotoxinbenzoladdukt
mit einem Reinheitsgrad von 91,6 5t.
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Beispiel 10: Lian hydriert 50,0 g gemäß Beispiel 7 hergestelltes Ergotoxin-Benzoladdukt
in 0,7 1 Dioxan bei 60°C unter einem llasserstoffdruck von 50 atü in einem heizbaren
Schüttel-oder Rührautoklaven in Gegenwart von Raney-Nickel innerhalb 2 Std, zu 9'10-Dihydroergotoxin,
filtriert vom Katalysator ab, dampft das klare Piltrat im Vakuun zur Trockne, läßt
die hydrierte Base bei +4 0C in Äthylacetat auskristallisieren, saugt das Kristallisat
ab und trocknet bei 60 °C Man erhält 47,5 g (= 90% d.Th.) dc-reines, weißes, kristallines
Produkt an Ergotoxinbase mit einem Reinheitsgrad von 90 ro.
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Spezifische Drehung ( 20=- -45,6° (c = 2 in Pyridin).
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Die erhaltene kristalline Dihydroergotoxinbase trägt man in 200 ml
Methanol und die berechnete Menge 1-molarer methanolischer Äthansulfonsäure unter
Ruhren ein, wobei sich nach kurzer Zeit das Alkaloidsalz kristallin abscheidet.
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Nach dem Absaugen und Trocknen des Produktes erhält man 48,5 g (=
95% d.Th.) dc-reines, weißes, kristallines Dihydroergo toxin-äthansulfonat mit einem
Reinheitsgrad von 98 - 100 -.
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Beispiel 11: Man hydriert 7,20 g gemäß Beispiel 9 gewonnenen Ergotoxin-Benzoladduktes
in 250 ml 90%igen wäßrigen Dioxan bei 20 -25 °C unter Lichtausschluß über 2,9 g
5%iger Palladiumkohle in einer speziellen Umlaufapparatur, bestehend aus seinem
Hydriergefäß mit Versorgungs- und Umlaufleitungen, Thermometer, Ejektor, Gasvorratsbehälter
und Laborschlauthpumpe, bei einer Umlaufzahl von 138,5 R-1, einem Ejektorunterdruck
von 120 mm H2SO4-Säule und einem Ejektordüsendurchmesser von 2 mm innerhalb 4 Stunden
zu 9,10-Dihydroergotoxin, filtriert vom Katalysator ab, dampRt das klare Filtrat
im Vakummrotationsverdampfer
bei t= +30°C zur Trockne, löst den
Trockenrv.cketand in 35 ml Chloroform, versetzt mit 35 ml Diäthyläther und fällt
unter intensivem Rühren mit 70 ml gesättgter ätherischer Maleinsäure lösung das
Dihydreoergotoxinbimaleinat vollständig. Man saugt ab, wäscht mit 30 ml Diäthyläther
und trocknet sofort über Phosphorpentoxid im Vakuumxsikkator. Man erhält 6,55 g
(93,5 d.Th.) de-reines, weißes, kristallnes, Dihydroergotoxinbimaleinat mit einem
Reinheitsgrad von 97,9%.
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Tabelle 1 : Morphologische Eigenschaften von Claviceps purpurea,
Stamm IMET PA 130, auf verschiedenen Agarmedien nach 14-tägiger Bebrütung in Petrischalen
bei 24 °C Medium 1 (3 % Saccharose, 0,001 % FeSO4. 7H2O 0,3 % NaNO3 1 % Maisquellwasser,
0,1 % K2HPO4, 3 % Agar; 0,05 % MgSO4. 7H2O pH 6,8-6,9) Kolonieform: Erhabene, kompakte,
unregelmäßig und stark gefaltete Kolonie; Unterseite-glatt, nicht vom Boden der
Platte abgehoben.
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Koloniedurchmesser: 1,0-1,5 cm Koloniefarbe: Oberseite hellbraun
bis violett, Rand weiß; Unterseite braun, Rand hellbraun.
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Durchschnittliche Versporung: 46,3 x 10 Konidien/Kolonie Medium 2
(15 % Bierwürze, 0,1 % Ammoniumzitrat, 0,5 % Hefeextrakt, 3 53 Agar; 0,5 ' (NH4)2PO4,
pH 6,0) Kolonieform: Mitte erhaben, mit kraterförmiger Einsenkung; Rand radial gefaltet;
Agar durchwachsen, Kolonie vom Boden der Platte abgehoben.
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Koloniedurchmesser; 2-3 cm Koloniefarbe; Ober- und Unterseite hellgrau;
Durchschnittliche Vereporung: 34,1 x 106 Konidien/Kolonie
Medium
3 (2 % Glukose, 50 % wässriger Kartoffelex-trakt, 3 % Agar; PH 6,0) Kolonieform:
Mitte erhaben, mit kraterförmiger Einsinkung; Agar durchwachsen, Kolonie vom Boden
der Platta abgehoben.
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Koloniedurchmesser; 1,5 - 2,0 cm Koloniefarbe: Oberseite grauviolett;
Unterseite graubraun.
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Durchsnittliche Versporung: 3,3 x 106 Konidien/Kolonie
Mikroskopische
Charakteristik der Konidien und Hyphen: Die Konidien eisen in allen Fallen eine
ellipsoid Porm mit Abmessungen von 6-10 um (große Achse bzw.
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4-8 um (kleine Achse) auf. Die Substrathyphen haben eine Länge bis
zu 200 um und einen Durchmesser von 4-8 um. Bei blasigen Auftreibungen beträgt der
Durchmesser 8-16 um. Es treten Lufthyphen auf, deren Lange über 200 um und deren
Durchmesser nur 2-4 um betragen.