DE2621015A1

DE2621015A1 - Einrichtung zum messen der enzymaktivitaet

Info

Publication number: DE2621015A1
Application number: DE19762621015
Authority: DE
Inventors: Mitsuo Fukuda; Shoji Kawai; Kenichi Nishimura
Original assignee: Kyoto Daiichi Kagaku KK
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1975-05-17
Filing date: 1976-05-12
Publication date: 1976-11-25
Also published as: JPS51134691A; DE2621015B2; FR2312033B1; JPS5444467B2; IT1061285B; GB1499643A; DE2621015C3; US4065358A; FR2312033A1

Description

PATENTAMWALTE

HELMUT SCHROETER KLAUS LEHMANN

DIPL-PHYS. DIPL.-INC.

Kabushiki Kaisha Kyoto Daiichi Kagaku _y_icy-l2

Se/P II.5.I976

Einrichtung zum Messen der Enzymaktivität

Einige Probleme bei der Messung der Enzymaktivität können anhand folgenden Beispieles erläutert werden.

Folgende Reaktionsformel gibt z.B. die Reaktion wieder, die bei der Messung des Aktivitätswertes von LDH (Laktat-Dehydrogenase) in einer Serumprobe stattfindet. LDH wirkt als Katalysator für die Reaktion in der Richtung des Pfeiles

CH-, FLÖH] CH-j3 « ' |3

C-O + NADH + H⁺ > CHOH + NAD⁺

1 1

COOH COOH

Brenztraubensäure Milchsäure

Während die tatsächliche Reaktion umkehrbar ist, verlagert sich das Reaktionsgleichgewicht bedeutend nach der rechten Seite, wenn Brenztraubensäure als Träger und NADH als Coenzym verwendet wicrd. Am Anfang der Reaktion ist der Verbrauch von NADH bestimmend für die Geschwindigkeit des Ablaufs der Reaktion. Es ist möglich, die Konzentration von NADH in Form der Absorbtion von ultraviolettem Licht der Weilenlänge von z.B. J>ko nm zu messen, und der Wert der Enzymaktivität kann durch die Geschwindigkeit des Verbrauchs von NADH , d.h. der Geschwindigkeit der Änderung der Absorption dargestellt werden.

Es ist von Bedeutung, daß der tatsächliche Wert der Enzymaktivität als Veränderung der Absorption feststellbar ist.

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D-707 SCHWABISCH GMOND GEMEINSAME KONTEN: D-8 MÜNCHEN

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H. SCHROETER Telegramme: Schroepat Schwäbisch Gmünd 02/00 535 (BLZ 613 700 86) K.LEHMANN Telegramme: Schrocpat

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Vorliegende Erfindung betrifft eine Einrichtung zum Messen der Enzymaktivität mittels eines fotoelektrischen Kblorimeters oder eines Spektrofotometers und betrifft insbesondere die Reaktionsgefäße für eine genaue Regelung derEnzymreaktions-Temperatur.

Die Messung der Enzymaktivität aufgrund der UV-Absorption durch das Köenzym NADH hat die klinische biochemische Prüfung bedeutend gefördert und die Technik medizinischer Untersuchung und Behandlung stark verbessert.

Diese Art der Messung der Enzymaktivität hat das charakteristische Merkmal, daß die Reaktionsgeschwindigkeit zwischen einer als Träger bezeichneten chemischen Substanz und einem Enzym mit einer spezifischen katalytischen Wirkung auf diesen Träger direkt und optisch beobachtbar ist. Dies hat es ermöglicht, die Enzymakt ivitäts werte mit einer einheitlichen Methode und schnell auch bei einer Vielzahl von Enzymen auf diese Weise zu messen.

In der Praxis hat diese kinetische Probenmethode allerdings verschiedene Probleme, so daß sie nicht ohne weiteres von Vielen, die klinische Untersuchungen durchzuführen haben, angeeignet werden kann.

Eines der Probleme ist die zeitliche Beschränkung des Zustandes, in dem die zu untersuchende Größe bestimmend für die Geschwindigkeit des Reaktionsablaufes ist, wobei nur in diesem Zustand während des anfänglichen Teiles der Reaktion gemessen wird. Der tatsächliche Wert ist nicht zu erhalten, wenn die Reaktion mit der Zeit nach rechts fortschreitet und dabei eine Umkehr der Reaktion veranlaßt oder reaktionsfremde Substanz erzeugt wird. Außerdem wird die Enzymaktivität bedeutend durch die Temperatur beeinflußt. Z.B. hat sie in der Nähe von ~j>0° C einen Temperaturgradienten von 7$ pro 1° C, so daß für eine genaue Messung eine ziemlich aufwendige Temperaturregelung erforderlich ist. So

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müssen bei der Messung der Enzymaktivität alle das Reaktionssystem darstellenden Elemente geregelt werden, so daß sie zur Zeit des Beginns der Reaktion die vorbestimrnte Temperatur haben, und nach Beginn der Reaktion muß die Temperatur des Reaktionssystems bei dem Wert der vorbestimmten Temperatur gehalten werden, bis die Messung abgeschlossen ist.

In der Praxis ist dies jedoch sehr schwierig. Wenn z.B. die Serumprobe, der Träger und die NADH-Lösung getrennt erwärmt werden, bis sie die vorbestimmte Temperatur erreichen, kann die Temperatur des Reaktionssystems bedeutend vom vorbestimmten Wert abweichen, und zwar als Folge von Wärmeverlusten, die durch Messung mittels Pipette, durch Mischen, durch die Überführung zur Absorptionszelle usw. veranlaßt werden.

Um einer solchen Schwierigkeit aus dem Weg zu gehen, könnte in Betracht gezogen werden, den Meßwert unter Berücksichtigung der Temperatur zur Zeit der Reaktion zu berichtigen. Klinisch würde dies jedoch wenig zuverlässige Werte ergeben, was in der Natur des Enzyms liegt, das im allgemeinen aus verschiedenen Isomeren zusammengesetzt ist.

Angesichts der obengenannten Probleme schafft vorliegende Erfindung eine Einrichtung zum Messen der Enzymaktivität, mittels der das Prinzip der Enzymaktivitäte-Meßmethode unverfälscht durchführbar ist und mit der eine hochgenaue Messung erzielbar ist.

In der nachfolgenden Beschreibung sind Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnungen erläutert. Es zeigen

Fig. 1 eine auseinandergezogene Darstellung der Bestandteile eines Ausführungsbeispiels der Erfindung,

Fig. 2 eine Unteransicht des unteren Endes des in Fig.l mit bezeichneten Teiles,

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Pig. 3 eine Draufsicht auf das obere Ende des in Fig.l mit 6 bezeichneten Teiles,

Fig. 4 einen Schnitt durch die unteren zwei Bestandteile der Einrichtung gemäß Fig.l , wobei eine ihrer Funktionen dargestellt ist,

Fig. 5 einen Schnitt durch die zusammengestellte Anordnung einschließlich der zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe und der Reagenz lösung für die Enzymmessung in einem temperaturgeregelten Wärmeblock:,

Fig. 6A-6E Schnittdarstellungen zur Veranschaulichung des Ablaufs der Messung der Enzymaktivität mittels des in den Fig. 1-5 dargestellten Ausführungsbeispieles,

Fig. 7 eine perspektivische Ansicht eines Teils eines anderen Ausführungsbeispiels der Erfindung.

Gemäß Fig.l enthält eine kleine Reagenzflasohe 1 eine vorher genau abgemessene Reagenzlösung für die Enzymmessung, bestehend aus dem genannten Träger, dem Koenzym, einem Reagens zur Einstellung des p„-V/ertes usw. Die Reagenzflasche hat einen

Il

flachen Boden und ihr oberer Teil oberhalb der Schulter3 ist etwas schmaler und hat eine Öffnung 2, die mittels eines Gummistopfens oder ähnlichem dicht verschlossen werden kann. Eine Probenflasche 4-, die etwas kleiner ist als die Reagenzflasche 1, enthält eine vorher genau abgemessene, zu untersuchende Probe, z.B. Serum. Die Probenflasche 4 hat einen flachen Boden 5 und ist so geformt, daß sie in die Reagenzflasche 1 eingestellt werden kann und dort aufrecht steht, wie in Fig.l durch die strichpunktierte Probenflasche 4¹ angedeutet ist. Ein Zwischenstück

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aus Silikongurnmi, Neoprengurami oder ähnlichem weist eine Durchgangs öffnung 7 auf. Das Zwischenstück 6 ist an seinem äußeren Mittelabschnitt mit einem Plansch 10 versehen und sein unterer Abschnitt ist, wie in Fig.2 gezeigt, als zylindrische Wand 8 ausgebildet, die in die öffnung 2 der Reagenzflasche hineingedrückt werden kann, um einen dichten Verschluß zu bilden. Der obere Abschnitt des Zwischenstückes 6 ist dagegen, wie in Pig· 3 gezeigt, als prismatische Wand 9 ausgebildet, die in die öffnung 12 A einer Küvette hineingedrückt werden kann. Die Küvette 11 ist im allgemeinen aus lichtdurchlässigem Material z.B. Quarz, Glas usw. hergestellt. Sie kann auch aus hochmolekularem Material, z.B. Polystyren, Polyolefin usw. bestehen. Was ihre äußere Gestalt betrifft, kann sie nicht nur quadratisch prismatisch, sondern auch zylindrisch ausgebildet sein. Wird allerdings eine zylindrische Küvette benutzt, muß die prismatische Wand 9 des Zwischenstückes 6 durch eine zylindrische Wand ersetzt werden.

In Fig. 4 ist dargestellt, daß die Reagenzflasche 1 in ihrem Inneren die Bobenflasche 4 hält, wobei die öffnung 2 schräg nach unten gerichtet ist. Wenn die öffnung 2 direkt nach unten weist, kann die Probenflasche 4 leicht aus der Reagenzflasche 1 durch die öffnung 2 entnommen werden. Wird dagegen die Reagenzflasche 1 mit ihrer öffnung 2 etwas schief nach unten gehalten, so wird die Probenflasche 4 von der Schulter J> der Reagenzflasche 1 unterstützt, so daß sie nicht gegen den Willen des Benutzers aus der Reagenzflasche 1 gelangt.

In Fig. 5 ist die ganze aus ihren Bestandteilen zusammengesetzte Anordnung gezeigt. Die Reagenzlösung 12 für die Enzymmessung und die zu untersuchende Probe Ij5 sind in der Reagenzflasche bzw. in der Probenflasche 4 enthalten und diese Flaschen sind, als ein Stück, in einer Wärmeübertragungsbohrung 15 in einem

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Wärmeblock 14 angeordnet. Wie aus Fig. 5 klar hervorgeht;, sind die Reagenzlösung 12 für die Enzymmessung und die zu untersuchende Flüssigiceitsprobe I3 voneinander durch die Wand der Probenflasche 4 getrennt, wobei aber die Bedingungen für einen guten Wärmeausgleich gegeben sind, so daß eine zwischen ihnen bestehenden Temperaturdifferenz sehr schnell verschwindet. Außerdem kommt es nicht vor, solange sie in diesem Zustand gehalten werden, daß sich die Reagenzlösung für die Enzymmessung und die zu untersuchende Plüssigkeitsprobe 13 vermischen, um die Enzymreaktion auszulösen. Die Reagensflasche 1 und alle anderen Bestandteile in der WärmeÜbertragungsbohrung 15 erreichen bald eine Temperatur, die der Temperatur des einer Temperaturfeinregelung unterliegenden Wärmeblocks entspricht, so daß der Zustand des Wärmegleichgewichtes erreicht wird. Es ist klar, daß zu dieser Zeit die Reagenzflasche 1 und alle anderen Bestandteile nicht nur mechanisch, sondern auch thermisch einen Körper bilden. Dasselbe Ergebnis wird durch Verwendung eines Wasserbads anstelle des Wärmeblocks 14 erreicht.

Im folgenden wird die Arbeitsweise mit der Anordnung gemäß der Erfindung unter Bezugnahme auf die Fig. 6k - 6E erläutert, in denen die Vorgänge bis zum Beginn der Messung der Enzymaktivität in alphabetischer Reiheirßlge dargestellt sind.

Gemäß Fig. 6k wird die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe mittels einer Pipette 16 genau abgemessen und dann in die Probenflasche 4 gegeben. Darauf wird die Reagenzlösung 12 für die Enzymmessung mittels einer Pipette I7 genau abgemessen und in die Reagenzflasche. 1 gegeben. In diesem Fall ist es auch möglich, das Reagens in gefriergetrocknetem pulvrigen Zustand zu benutzen. Ein solches Reageiß wird genau abgemessen und dann in die Reagenzflasche 1 gegeben. Es wird eine entsprechende Menge destillierten Wassers hinzugegeben, so daß die Reagenzlösung für die Enzymiaessung erhalten wird. (Es ist erwünscht, daß alle

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verwendeten Instrumente sauber und trocken sind).

Gernäß Fig. 6B wird die Probenflasche 4 mit der darin enthaltenen zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe IJ behutsam in die Reagenzflasche 1 mit der Reagenzlösung 12 für die Enzymmessung eingesetzt

Gemäß Fig. 6C werden die zylindrische Wand 8 und die prismatische Wand 9 des Zwischenstückes 6 in die Öffnung 2 der Reagenzflasche 1 bzw. die öffnung 12A der Küvette 11 gedruckt, bis der Flansch 10 die öffnungen 2 und 12A dicht verschließt.

Gemäß Fig. 6D werden die Reagenzflasche 1 und alle anderen damit vereinigten Elemente in die Wärmeübertragungsbohrung 15 des Wärmeblocks 14 eingeführt. Damit die zusammengebauten Bestandteile schnell das thermische Gleichgewicht erreichen, ist der Innendurchmesser der Wärmeübertragungsbohrung 15 so bemessen, daß er dem Außendurchmesser der Reagenzflasche 1 entspricht und die Länge der Bohrung 15 gerade so groß, daß die Handhabung zum Einsetzen und Herausnehmen der ganzen Einheit möglich ist.

Gemäß Fig. 6E wird nach einer zum Erreichen des thermischen Gleichgewichts aller Bestandteile ausreichenden Zeit die gesamte Anordnung aus der Wärmeübertragungsbohrung I5 herausgenommen und dann zum Zwecke der Mischung einige Male herumgedreht. Beim Herumdrehen fließen die Reagenzlösung 12 für die Enzymmessung und die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe Ij5 aus der Reagenzflasche 1 bzw. der Probenflasche 4 und gelangen durch die Durchgangsöffnung 7 in das Innere der Küvette 11, wo sie sich miteinander mischen. Damit setzt die Enzymreaktion ein. Das mehrmalige Umdrehen erfordert nur sehr geringe Zeit, so daß die während diese Zeitraums ablaufende Enzymreaktion keinen Einfluß auf die Messung hat. Außerdem ist beim Mischen durch Umdrehen die

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enthaltene Lösung von der äußeren Atmosphäre getrennt und der Wärmeverlust sehr gering, so daß sich die Temperatur des Reaktionssystems kaum ändert.

Die gesamte Anordnung wird mit der Oberseite nach unten gehalten, so daß die vollständige Mischung aus Reagenzlösung 12 für die Enzymmessung und zu untersuchender Flüssigkeitsprobe IJ in die Küvette 11 gelangt, wo sie unmittelbar der Messung der zeitlichen Änderung der Absorption mittels eines fotoelektrischen Eolorimeters oder eines Spektrofotometers unterworfen wird.

Sobald die Bedingungen der vollständigen Mischung und des thermischen Gleichgewichts des gesamten Systems erfüllt sind, tritt die Enzymreaktion sofort in den die Reaktionsgeschwindigkeit maßgeblich bestimmenden Abschnitt ein. Deshalb kann gemäß vorliegender Erfindung die Messung der Knderungsgeschwindigkeit der Absorption unmittelbar beginnen. Bei der Messung der Enzymaktivität gilt die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit als der wahre Wert. Es kann deshalb gesagt werden, daß die Messung der Enzymaktivität gemäß vorliegender Erfindung der genannten Definition sehr genau entspricht.

Wie oben im einzelnen dargelegt, stellt vorliegende Erfindung eine sehr wirksame Einrichtung zum Messen der Enzymaktivität dar. In der nachfolgenden Beschreibung werden einige Erfordernisse angegeben, die sich auf die Bemessung und das Material beziehen, damit die Anordnung praktischer und wirksamer wird, wobei die technische Idee vorliegender Erfindung nicht durch diese Beschreibung eingeschränkt wird.

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Im Hinblick auf den Temperaturausgleich ist es erwünscht, daß die Reagenzflasche 1 besser aus Glas als aus Kunststoff hergestellt ist. Sofern Kunststoff verwendet wird, ist vorzuziehen,

daß die V/andstärke weniger als ein Viertel der bei Glas ist. Ebenfalls im Hinblick auf den Temperaturausgleich und ferner im Hinblick auf die spezifische Schwerkraftwirkung ist es erwünscht, daß die Probenflasche 4 aus Glas ist, da, wenn sie aus verhältnismäßig leichtem Kunststoff hergestellt ist, ihre Standfestigkeit aufgrund von Auftriebskräften bei der Anordnung in der RQagenzlösung 12 für die Enzymmessung zu wünschen übrigläßt. Aus dem gleichen Grunde ist vorzuziehen, daß die Bemessung und das Passungsvermögen der Reagenzflasche 1 und der Probenflasche 4 im Hinblick auf die am besten geeigneten Werte bestimmt werden, unter Berücksichtigung des zu behandelnden Flüssigkeitsvolumens. Die Innendurchmesser der Probenflasche und der Durchgangsöffnung 7 des Zwischenstückes 6 müssen so bemessen sein, daß die Flüssigkeit ungehindert durch sie hindurchgehen kann. Wennn diese Innendurchmesser weniger als 8 mm betragen, sind die Ein- und Ausfließvorgänge wegen der Viskosität der Flüssigkeit behindert. Vorzugsweise hat die zylindrische Wand 8 des Zwischenstücks 6 gernäß Fig.7 Vertiefungen 16', l6^M,l6^m und l6^Mt!, so daß,beim Umdrehen der Anordnung die Probenflasche 4 nicht von der Schulter 3 der Reagenzflasche 1 abrutschen und die Durchgangsöffnung 7 unter Verhinderung des Flüssigkeitsdurchflusses blockieren kann. Außerdem ist es vorzuziehen, daß die Küvette 11 aus einem Material mit sehr guter Wärmeisolierung ist, z.B. aus Polystyren, soweit es die Lichtdurchlässigkeit erlaubt. Dies ermöglicht es, die vorbestimmte Temperatur in ausreichendem Maße während der Messung der anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeit selbst dann zu erhalten, wenn die Messung der Absorptionsveränderung mittels eines fotoelektrischen Kolorimeters geschieht, dessen der Lichtmessung dienender Teil nicht temperaturgeregelt ist.

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Wie oben erwähnt, ist die Einrichtung zum Messen der Enzymaktivität gemäß der Erfindung sehr vorteilhaft im praktischen Gebrauch.

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Claims

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PATENTANS PRÜCHE

Einrichtung zum Messen der Enzymaktivität, dadurch g e k e nn· zeichnet , daß in eine Reagenzflasche (1) zur Aufnahme einer Reagenzlösung (12) für die Enzymmessung eine offene Probenflasche (4) zur von der Reagenzlösung (12) getrennten Aufnahme der zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe (Ij5) einsetzbar ist und daß eine Küvette (11) mit der Reagensflasche (1) Kopf an Kopf unter Beibehaltung einer Durchgangsöffnung (7) für die zu mischenden Flüssigkeiten (12,13) verbindbar ist.
2. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der Lage der zusammengesetzten Einrichtung, in der die Küvette (11) mit ihrem Boden nach unten und die Reagenzflasche (1) mit ihrer öffnung (2) nach unten gerichtet sind, die Probenflasche (4) gegen unbeabsichtigtes Herausgleiten aus der Reagenzflasche (1) gehalten ist.
3. Einrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e k e η η -

ζ ei c h η e t , daß ein die Durchgangsöffnung (7) enthaltende: Zwischenstück (6) aus Dichtmaterial zwischen Reagenzflasche (1) und Küvette (11) einfügbar ist.
4. Einrichtung nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet ,daß eine in die öffnung (2) der Reagenzflasche (l) ragende Wand' (8) des Zwischenstücks (6) den Durchtritt für die Probenflasche (4) versperrt.
5. Einrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Wand (8) ein Gleiten der Probenflasche (4) verhindernde Vertiefungen £16', 16'',16''', 16¹''') aufweist.

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Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 -5 , gekennzeichnet durch eine Temperiereinrichtung (Wilrmeblock 14) , in die die aus Reagenzflasche (1) Probenflasche (4) und Küvette (11) zusammengesetzte Einrichtung in der Lage einsetzbar ist, in der der Boden der Reagenzflasche (1) nach unten weist und in der demgemäß die Reagenzlösung (12) in der Reagenzflasche (1) von der zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe (13) in der Probenflasche (4) getrennt ist, so daß die Mischung der Flüssigkeiten (12, IJ) und ihre praktisch gleichzeitig damit erfolgende Überführung in die Meß-Küvette (11) nach erfolgter Temperierung des gesamten Systems durchführbar ist.

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