DE2618052A1 - Verfahren und reagenz zur quanititativen bestimmung von l-lysin in eiweisshaltigen stoffproben - Google Patents
Verfahren und reagenz zur quanititativen bestimmung von l-lysin in eiweisshaltigen stoffprobenInfo
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Description
74.841 GS Ha/un
A/S N. Foss Electric
Hiller0d
Dänemark
Verfahren und Reagenz zur quantitativen Bestimmung von L-Lysin in eiweisshaltigen Stoffproben.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von L-Lysin in proteinhaltigen Stoffproben, insbesondere Substanzen
pflanzlichen Ursprungs wie Getreideprodukten, Hackfrüchten, Saatgut und ähnlichen Stoffen. Die Erfindung betrifft desweiteren
ein Reagenz zur Ausübung des Verfahrens.
In biologischer Hinsicht ist das L-Lysin (L-2,6-Diaminohexansäure)
für Mensch und Tier eine essentielle Aminosäure in dem Sinne, als der Organismus nicht oder nur in geringem Ausmass imstande ist,
die baimStoffwechsel und Wachstum des Organismus verbrauchte Menge
L-Lysin selbst zu bilden. Die erforderliche Menge Lysin muss daher dem Organismus entweder in freier Form oder in Eiweissstoffen gebunden
zugeführt werden, aus denen das Lysin mit Hilfe der Ver-
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2 6 "I 8 O b 2
dauungs enzyme herauslö^oer ist. Dae-· herausgelöste Lysin wird danach
in "biologisch aktiver Form und in hinreichenden Mengen vom
Organismus aufgenommen.
Beim Füttern von Tieren mit einem einzelnen Magen, beispielsweise Schweinen und Geflügel ist der Mangel an frei verfügbaren Lysin
erfahrungsgemäss derjenige Faktor, der bei diesen Tierarten häufig
die Entwicklungsgeschwindigkeit begrenzt, weshalb das Lysin oft als "die erste begrenzende Aminosäure" bezeichnet wird.
Man kann zwar nicht ein minderwertiges Putter allein durch Zusatz
von Lysin in ein hinsichtlich des Nährwertes optimales Futter verwandeln, eine wesentliche Verbesserung ist jedoch durch den Zusatz
von Lysin fast immer erzielbar.
Die Tatsache, dass das Lysin die erste begrenzende Aminosäure ist,
ist mehreren speziellen Umständen zuzuschreiben:
1) Viele natürliche Proteinquellen, beispielsweise Gerste, Weizen,
Roggen, Mais und Reis haben einen, unzureichenden Lysingehalt.
2) Das Lysin kann in schwer verdaulichen Proteinen vorkommmen, so dass es aus dem Protein nur langsam und unvollständig abspaltbar
ist.
3) Wegen der reaktionsfähigen £. — Aminogruppe wird das Lysin durch
Reaktion mit anderen in der Proteinquelle enthaltenen Bestandteilen leicht derivatisiert, wodurch die zur Verfügung 'stehende Lysinmenge
und damit der Nährwert herabgesetzt werden.
Wegen der Bedeutung des Lysins für das Wachstum von Tieren mit nu einem Magen ist es sehr wichtig, die verfügbare Lysinmenge in
Futtermitteln verschiedener Art messen zu können.
Die Erschliessbarkeit von Lysin ist durch biologische Versuche korrekt bestimmbar. Diese Versuche sind jedoch langwierig und aufwendig
und daher nur in sehr begrenztem Ausmass verwendbar.
Es iäind chemische Analysen zur Bestimmung von Lysin und/oder zugänglichem
Lysin bekannt, die billiger und schneller ausführbar
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sind als die biologischen Versuche. Keine dieser bekannten Methoden,
deren Durchführung dennoch schwierig ist und 1-2 Tage beansprucht, •wird jedoch in grösserem Ausmass verwendet. Die besonderen chemischen
Verhältnisse bezüglich der iL-Aminogruppe des Lysins sind
folgende:
!) Die Maillard-Reaktion
Enthält eine Proteinquelle reduzierende Zucker (Glukose, Lactose),
erfolgt unter gewissen Bedingungen eine spontane Reaktion zwischen der iL-Aminogruppe des Lysins und der Aldehydgruppe des Zuckers.
Es wird zunächst eine Schiff-Base gebildet, die später einer Amadori-Umlagerung
in ein N -Ketosyl-lysin unterworfen wird. Dieses Lysinderivat
ist biologisch inaktiv. Der Organismus ist nicht imstande, daraus Lysin zurückzugewinnen. Auch im N -Ketosyl-lysin
hat die e_-Aminogruppe basische Eigenschaften.
2) Beim Erhitzen proteinhaltiger Substanzen erfolgt zwischen der ε-Aminogruppe des Lysins und Asparagin oder Glutaminseitenketten
eine Reaktion, die zur Bildung von ß-Asparagyl- und γ-Glutamyl-lysin
führt. Da die acylierte ε-Amino gruppe keine basischai Eigenschaften
hat, sind die Verdauungsenzyme, zum Beispiel das Trypsin nicht imstande, die Verbindung aus dem Proteinstoff abzuspalten. Es ist jedoch
zu erwähnen, dass t-acyliertes Lysin im Organismus, in den
Nieren, weitgehend in biologisch aktives Lysin abbaubar ist.
Es sind verschiedene Methoden zur LysinbeStimmung bekannt, die jedoch
alle mit wesentlichen Begrenzungen und Nachteilen behaftet sind.
Bei einer konventionellen Aminosäureanalyse wird ein Proteinstoff längerer Zeit, meistens Zk Stundenlang, einer Hydrolyse mit kochender
starker Salzsäure unterworfen. Daraufhin werden die dabei freigewordenen Aminosäuren durch Flüssigkeitschromatographie von
einander getrennt, wonach die Menge nach Einfärbung mit Ninhydrin kolometrisch bestimmt wird.
Bei der sauren Hydrolyse werden jedoch die eventuell vorhandenen Lysinderivate ganz oder teilweise in freies Lysin abgebaut, so dass
man bei der quantitativen Analyse einen Ausdruck für "totales Lysin"
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VBIBOb2
erhält. Bei "biologischen Versuchen mit gewissen Stoffen war es
jedoch nicht immer möglich, in bei der Aminosäureanalyse gefundenen Lysinmengen entsprechende Mengen wiederzufinden. Dies hat
zur Bezeichnung "Zugänglichkeit" geführt, womit der biologisch aktive Anteil des Totallysins gemeint ist. Die Zugänglichkeit von
Lysin ist in vielen Stoffen so veränderlich, dass die konventionelle Aminosäureanalyse nur in sehr wenigen Fällen eine zuverlässige
Beurteilung der biologisch aktiven Lysinmenge ermöglicht.
Die FDNB-Methode - die Carpenter-Methode - wurde speziell zum Messen
reaktiven Lysins, d.h. derjenigen Lysinmenge entwickelt, deren £ -Aminogruppe nicht derivat!siert worden ist. Man lässt den Proteinstoff
einige Stundenlang mit l-Fluor-2,4-dinitrobenzol. (FDNB) reagieren, wobei das reaktive Lysin in N -(2,4-dinitrophenyl)lysin
umgebildet wird, das dann durch eine 24-stündige saure Hydrolyse abgespalten und daraufhin kolometrisch gemessen wird.
Diese Methode ist zur Zeit die zuverlässigste Methode zur Bestimmung
reaktiven Lysins (entsprechend zugänglichem Lysin), abgesehen von Stoffen (Getreide und Saatgutsorten) mit beträchtlichem Kohlenhydratgehalt,
der die Analysenergebnisse sehr stark beeinflusst.
Man verfügt über mehrere Varianten der FDNß-Methode. Keine dieser
Varianten weist jedoch über die erwähnten Vorteile hinaus wesentliche Vorteile auf.
Die DBC-Methode, die Farbbindungsmethode, die auf der Bindung eines
sauren Farbstoffs an die von Lysin, Aginin und Histidin herrührenden basischen Gruppen eines Proteinstoffs fusst, ist in gewissen Fällen
zur schnellen Ermittelung der zugänglichen Lysinmenge verwendbar.
Es ist erwiesen, dass mit Asparagyl- und Glutamyllysin keine Farbbindung
stattfindet, dagegen jedoch mit Ketosyllysin. Dies bedeutet,
dass die DBC-Methode zur Beurteilung der Zugänglichkeit von Lysin in Substanzen Verwendung findet, wo die Protein-Proteinreaktion
vorhersehend ist (Fischmehl, Knochenmehl), jedoch nur schlecht die
durch die Protein-Zuckerreaktion (Milchpulver) verursachte reduzierte
Zugänglichkeit wiederspiegelt.
.Diese verschiedenen Umstände führen dazu, dass die ideelle Methode
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zur Bestimmung reaktiven. Ly sins, auf der die Ermittlung der Menge
zugänglichen Lysins fusst, folgende Eigenschaften aufweisen muss:
1) Die Methode muss schnell durchführbar und unkompliziert sein.
2) Die Beeinflussung durch die übrigen Bestandteile des Probematerials
muss unterdrückt \^erden.
3) Mit Hilfe der Methode muss spezifisch die an Protein gebundenem
Lysin entstammende Menge primäre Aminogruppe ermittelbar sein, die voraussichtlich die biologisch zugängliche Lysinmenge repräsentiert.
Die vorliegende Erfindung bezweckt die Schaffung einer die obengenannten
Bedingungen erfüllenden Analysenmethode.
Eine wesentliche Komplikation bei der Analyse von Protein in Naturstoffen
sind die in diesen in wesentlichen Mengen enthaltenen Fette und Kohlenhydrate. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemässen Verfahrens wird daher das Probematerial
speziell vorbereitet derart, dass das Protein isoliert und in einer zur Messung reproduzierbaren und zugänglichen Form vorliegt.
Diese Vorbereitung kann dadurch erfolgen, dass die Stoffprobe einer Extraktion zu Isolierung der verdaulichen Proteinfraktion unterworfen
wird, wonach diese mit dem Aldehydreagenz in Überschuss umgesetzt wird und dann die Restkonzentration des Aldehydreagenzes
nach der Umsetzung gemessen wird.
In der Praxis ist diese Vorbereitung wie folgt durchführbar:
Das Probematerial wird nass mit einer zu gleichen Teilen aus einer
Natriumhydroxid-Natriumsulfit~Lösung und einer Kupfersulfat-äthylengly^ol-lösung
bestehenden Extraktionsflüssigkeit vermählen, wonach zentrifugiert wird. Im blauvioletten Zentrifugat liegt der verdauliche
Proteinanteil nun in der Form eines Kupferkomplexes vor, der die intensivviolette Färbung bedingt. Der Gehalt an Fett und Kohlenhydrat
ist verschwindend klein.
Ein besonderes Problem bei der Behandlung stärkehaltiger Stoffe mit
starkem Alkali ist die Stärkeverkleistörung. Es hat sich jedoch
C η η Q /. 1 ι η
herausgestellt, dass dieses Phänomen aufgrund des Gehalts der Extraktionsflüssigkeit an Kupfer nicht in Erscheinung tritt, weshalb
das obengenannte Reagenz zur selektiven Isolation und Präparation der verdaulichen Proteinfraktion in einer Reihe von natürlichen
Proteinquellen mit grossem Stärkeanteil ausserordentlich
gut geeignet ist.
Die genannte Isolierung von Protein beansprucht in der Praxis nur etwa 10 Minuten.
Als Basisreaktion bei der LysinbeStimmung hat man die Schiff-Basenbildung
aus einem primären Amin (Lysin £.-amino gruppe) und einem Aide hyd
gewählt. Bei einem primären Amin verläuft diese Reaktion normalerweise schnell und hochspezifisch. Es können jedoch auch oc-Aminogruppen
reagieren, weshalb das Aldehyd eine sterische Hinderung aufweisen sollte derart, dass nur eine endständige Aminogruppe
(die ε.-Aminogruppe) mit der Aldehydgruppe reagieren kann.
Es dürfte auch zweckmässig sein, dass das Aldehyd innerhalb eines
grossen pH-Bereichs wasserlöslich, spektrophotometrisch messbar,
sowohl als Trockensubstanz als in gelöster Form stabil sowie in reiner Form herstellbar ist.
Es hat sich herausgestellt, dass diese Bedingungen erfüllt sind, wenn erfindungsgemäss das benutzte Aldehydreagenz ein substituiertes
y-Formyl-pyridin-derivat mit der allgemeinen Formel:
1 2
ist, wo R und R jeweils aliphatische Kohlenstoffketten mit höch
stens 4 Kohlenstoffatomen bezeichnen oder zusammen mit den angeschlossenen Kohlenstoffatomen des Pyridinrings aromatische Ringe
bilden derart, dass entweder ein ß-substituier1es Chinolin oder
ein Acridin gebildet wird. Ausserdem sollte das Molekül eventuell Gruppen zur Erzielung einer Wasserlöslichkeit (-S(XH) sowie einer
erhöhten oder verminderten Reaktivität (Me2N-, NOp-) enthalten.
cnno/.
Bevorzugte Verbindungen aind folgende;
26 Ί 8052
9-Formylacridin (FA):
CHO
9-Formylacridin-2-sulfonsäure (FAS):
CHO
6~Dimethylamirio-9-formylacridin-2-sulfonsäure (DMA-FAS):
CHO
Me2N
7-Nitro-9-formyl-acridin-2-sulfonsäure (Nitro-FAS)
CHO
NO,
SO3H
Das FA ist aus der Literatur bekannt, während die übrigen drei Verbindungen unbekannt sind. Von diesen wird das FAS bevorzugt, das
sich zur Lysinbestimmung als besonders gut verwendbar erwiesen hat. Das DMA-FAS hat theoretisch eine grössere Reaktionsgeschwindigkeit
als das FAS. Das Nitro-FAS reagiert voraussichtlich langsamer als das FAS, ist vermutlich jedoch selektiver und wegen der grosseren
Lichtabsorption leichter messbar.
Die nachstehende Tabelle gibt die bezüglich der Reaktion verschiedener
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Aldehyde mit der t-NH2-Gruppe des Lysins gemessenen Geschwindigkeitskonstanten
an.
Geschwindigkeitskonstanten der Reaktion
RCHO + Lysin S-NH2 -> RCH - £N-Lys + H2
RCHO + Lysin S-NH2 -> RCH - £N-Lys + H2
Aldehyd | pH | , mol | kp/k |
9-Antracenaldehyd | 10,2 | Kt 1 min | -ο 20 |
9-Antracenaldehyd | 13,0 | Ό 8 | |
'9-Acridinaldehyd | 10,2 | 8,0 | ~j 4 |
9-Antracenaldehyd, sulfoniert | 10,2 | 27 | so 10 |
9-Formylacridin 2-Sulfonsäure | 9,2 | - | 1,5 |
do | 10,2 | 40 | /ο 4 |
do | 11,2 | 90 | |
140 |
Das Reagenz 9-Formyl-acridin-2-sulfonsäure hat im Vergleich mit den zur Lysinbestimmung bisher benutzten Reagenzien folgende "Vorteile:
Es ist gegenüber der £.-NH2-Gruppe des Lysins spezifisch in dem Sinne,
dass die Reaktion mit der a-NH2~Gruppe von der sterischen Hinderung
des Kohlenstoffskelets des Aldehyds entscheidend unterdrückt wird, und dass eventuell nach wie vor alkalische und somit acylier-
oder alkylierbare derivate des Typs ε-NH-R überhaupt nicht reagieren.
Die erwähnte Analysenmethode ist in einigen Fällen direkt mit der nichtbehandelten Stoffprobe durchführbar, falls diese lediglich
unwesentliche Mengen Fett und Kohlenhydrate enthält. Anderenfalls ist es erforderlich, die Probe einer Vorbehandlung zur Isolierung
der Proteinstoffe in konzentrierter Form zu unterziehen.
Eine solche Vorbehandlung kann darin bestehen, dass die Probe 1-2Minuten mit einem Gemisch aus 62,5 mm 0,2 molaren Kupfersulfat
in 20 prozentigem Sthylengly kol und 62,5 ml 1,0 miolaran Natriumhydroxyd in 0,25 klaren Natriumsulfit behandelt wird. Nach dem
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Zentrifugieren (50.000 g χ min.) eier dem Filtrieren der erhaltenen
Suspension wird die violette Proteinlösung isoliert, die praktisch nur den verdaulichen Proteinanteil des Probematerials
enthält, da Stärke, Zellulose und Fett in diesem Reagenz praktisch unlöslich sind. Es hat sich herausgestellt, dass zwischen der
Extraktionseffektivität und der nach der Pepsin-Salzsäuremethode ermittelten Verdaulichkeit des Proteins ein inniger Zusammenhang
besteht.
Mit der obenerwähnten Proteinlösung wird die LysinbeStimmung wie
folgt durchgeführt:
Es wird der Lösung ein Aliquot entnommen, das einer Lösung von FAS im Überschuss zugesetzt wird. Die Reaktion erfolgt im Verlauf
von 5-15 Minuten bei pH 11-12, wonach ein kleiner Überschuss in Dimethylformamid geLöstes Natriumborhydrid zugesetzt wird. Danach
wird bis pH <1 SuIfosalicylsäurelösung zugesetzt und filtriert oder
zentrifugiert. Die Restkonzentration von reduziertem Reagenz wird durch spektophotometrische Messung bestimmt. Mittels Blindproben
lässt sich der Verbrauch an FAS ermitteln und daraus der Mengenanteil an reaktivem Lysin im Probematerial berechnen.
Das Reagenz 9-Formyl-acridin-2-sulfonsäure wird wie folgt hergestellt:
Ausgehend von 2-Chlorbenzoesäure und Anilin wird N-£ henylantranilsäure
hergestellt, die mit Schwefelsäure zyklisiert und zu Acridon-2-sulfonsäure
sulfoniert wird. Durch Behandlung von Acridon-2-sulfonsäure mit Phosphoroxy-chlorid und anschliessende selektive Hydrolyse
des primär gebildeten 9-Chloracridin-2-sulfonchlorids erhält man 9-Chloracridin-2-sulfonsäure. Durch Malonsäuresynthese wird mit
9-(üiäthylmalonyl)-acridine-sulf onsäure als Zwischenprodukt 9-Methyl-acridin-2-sulfonsäure
hergestellt.
Diese Verbindung wird mit p-Nitrosodimethylanilin zu Natrium-9-(p-dimethyl-aminophenylazomethinyl)-acridin-2-sulfonat
kondensiert, das.durch saure Hydrolyse 9-Formylacridin-2-sulfonsäure ergibt.
9-Methylacridin-2-sulfonsäure ist auch durch Kondensation von ο Aminoacetophenon
und p-Brombenzolsulfamid zu 9-Methylacridin-2-sul-
faraid herstellbar, das durch Djazotierung in 9-Methylacridin-2-sulfonsäure
umgebildet wird, deren Oxydation zum Aldehyd auch mit Hilfe von Selendioxid durchführbar ist.
Die LysinbeStimmung wird nachstehend anhand einiger Beispiele
veranschaulicht.
Zur Analyse werden folgende Reagenzien benutzt:
Reagenz I:
49,94 g CuSO4, 5H2O in 800 ml Η£0 + 200 ml Äthylenglykol
Reagenz II;
40,00 g NaOH + 31,51 g Na2SO3 auf 1000 ml
g-Formylacridin-Z-sulfon-säure (FAS):
20,0 fflnolar in 7,5% Na2HPO4 Lösung
S, H2°J 1V = 305,30
Abwiegen von 1,2578 g FAS, 2 Studen bei 100°C trocknen, getrock netes Gewicht = 1,2272 g, nachfüllen bis 200 ml mit 7,5%
7,5% Na2HPO4: " ι-
75 g Na2HPO4, 12H2Q in 10000 ml ausgekochtem H2O
Natriumborhydrid (NaBH4):
mw = 37,84, 0,15 molar /o
567,6 mg in 100 ml N,N-Dimethylformamid 5-Sulfοsalicylsäure (SSS);
mw Dihydrat = 254,22, 0,75 molare
190,67 g in 1000 ml Η£0
6 0 9.84 7 /0 95
11 2613052
Verfahren
In einem kleinen "Foss-Let" Reaktorbecher werden eine Probenmenge
von 0,35 g - 0,10 g Protein abgewogen und 12,5 ml Reagenz I +
12,5 ml Reagenz + 12,5 ml Reagenz II zugesetzt. Der Becher .wird in den Foss-Let Reaktor gestellt. Die Reaktionszeit beträgt 2 Minuten.
Die Aufschlämmung wird in ein 50 ml Zentrifugenglas eingeführt und 10 Minuten lang bei 10.000 Umdrehungen zentrifugiert.
Es werden 2,5 ml Extrakt + 2,5 ml FAS in einen mit magnetischem
Umrührer versehenen 50 ml Erlenmeyerkolben abpipettiert, Reaktionszeit 10 Minuten. Danach ist 1 ml NaBH^-Lösung zuzusetzen, wonach
20 ml SSS-Lösung zugesetzt werden. Überführung in kleine Zentrifugenrohre
und 5 Minuten zentrifugieren bei 20.000 Umdrehungen.
Die Extinktion der überstehenden Flüssigkeit wird in einer 0,5 mm
Durchlaufkuvette im Spektrophotometer gemessen.
Blindprobe = 2,5 ml Reagenz I + III + 2,5 ml FAS und fortsetzen wie die Analyse *υ E,-, .
E = ' 100° Konzentration = 20 ' 2>3 = 1,9231 millimolar
konz. mm 26
τρ
.* E) * 26 = mol Lysin/ g Probe
. 1000
^ E) · 26 · 10 =
= mol Lysin/ g Probe
. 1000 . a
j E) . 26 . 10 . 100 . 146
SL . 1000 . a
= o/o Lysin
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Kürzung
(Ebl. * E) 26 . 146 = (Ebl.^ E)
2. . a SL · a
3796 - % Lysin
26 = 2,5 + 2,5 + 1 + 20 ml 146 = m von Lysin
Die vorstehende Analysenmethode wurde zur LysinteStimmung an verschiedenen
eiweisshaltigen Stoffproben wie Fischmehl, Gerste und Knochenmehl verwendet. Zum Vergleich wurden entsprechende Analysen
mit FDNB nach Carpenter durchgeführt. Für Proben mit bis zu 10%
Lysin wurde eine Regressionslinie mit folgender Gleichung ermittelt:
% FAS-Lysin = 0,78 χ % FDNB-Lysin +0,18 r = 0,98
Sd = 0,55 η = 62
Die Verwendung von 9-Formylacridin (FA) zur Lysinbestimmung ergibt
sich aus folgendem:
100 mg Gerstenglutelin (2,97% zugängliches Lysin) werden 1 Stunde
mit 10 ml 3 mM FA in 0,05 m'Triethylamin in 80-prozentigem Äthanol
behandelt. Nach dem Abzentrifugieren des Niederschlags wird die Extinktion in der vorgenannten Flüssigkeit bestimmt. Durch Subtrahieren
dieses Wertes vom Extinktionswert für die Ausgangslösung wird die absorbierte Extinktionsmenge ermittelt. Hieraus lässt sich
die in der Probe enthaltene Lysinmenge berechnen.
Beim Versuch wurde ein Lysingehalt von 0,89% ermittelt.
Andere Aldehyde (9-Anthracenaldehyd, 2-Methoxy-l-naphthaldehyd und
6-Sulfo-2-methoxy-l-naphthaldehyd) ergeben jeweils 0,28%, 0,07% und 0,07%. Das FAS ergibt unter den gleichen Bedingungen 2,05%
Lysin.
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Im nachstehenden Beispiel wird die Synthese des Reagenzes 9-Formyl-acridin-2-sulfonsäure beschrieben:
Redestilliertes Anilin (310 g, 3,32 mol), reine 2-Chlor-benzoesäure
(82 g, 0,52 mol), .frisch getrocknetes Calciumcarbonat
(4 g, 0,6 mol) und Cuprioxyd (2,0 g) werden 2 Stunden auf Ölbad im Rücklaufkühler gekühlt. Der Anilinüberschuss wird zunächst
durch Destillation im Vakuum und später mit Wasserdampf entfernt. Die verbleibende Lösung (500 ml) wird 15 Minuten mit 40 g
Aktivkohle gekocht und filtriert. Das Filtrat wird in eine Mischung aus konzentrierter Salzsäure (60 ml) und Wasser (120 ml) eingerührt.
Nach erfolgter Abkühlung wird der Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und bei 1200C getrocknet. Dieses blaugraue Produkt
wird durch Lösen von 50 g in 1000 ml 25 g Natriumcarbonat enthaltendes
Wasser und 5 Minuten langes Kochen mit 25 g Aktivkohle gereinigt. Danach wird filtriert und mit konzentrierter Salzsäure
(heftiges Schäumen) ausgefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und bei 120°C getrocknet.
Theoretische Ausbeute: 111 g
Praktische Ausbeute: 87 g cremeweisses Pulver Relative Ausbeute: 78%
N-Phenylanthranilsäure (87 g) wird bei 1000C (Wasserbad) 2 Stunden
mit 1310 g Schwefelsäure (^ 98%) behandelt. Die tiefgrüne Lösung
wird gekühlt und in 8 1 kaltes Wasser gegossen. Nach zweistündigem Umrühren wird der klare gelbe Niederschlag abfiltriert und auf dem
Filter gepresst.
Der Filterkuchen wird in 1600 ml Wasser aufgeschlämmt, und es werden
40% Natriumhydroxydlösung bis zur klaren oder fast klaren Lösung
zugesetzt. Es wird 15 Minuten mit 20 g Kohle behandelt und filtriert.
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Dem klaren gelben Filtrat verden 270 ml konzentrierte Salzsäure
zugesetzt, wonach die Kristallisation spontan eintritt. Nach 1 1/2 stündigem Umrühren unter Abkühlung mit ELswasser wird der
Niederschlag abfiltriert, mit 5% Salzsäure gewaschen und bei 100 C
getrocknet.
Theoretische Ausbeute: 117 g (Monohydrat) Praktische Ausbeute: 87 g zitronengelbe Substanz
Relative Ausbeute: 74%
Acridon-2-sulfonsäure monohydrat (87 g) wird mit 260 ml Phosphoroxychlorid
auf Ölbad (130°C) behandelt. Nach dem Klarwerden der Lösung wird 2 Stunden im Rücklaufkühler gekühlt. Der Überschuss
an Phosphoroxy chlorid wird in Vakuum abdestilliert, so dass man
einen dickflüssigen Rest erhält. Nach dem Abkühlen wird dieser Rest in Portionen von 300 ml Chloroform bis insgesamt ca. 1500 ml
gelöst. Diese Portionen werden allmählich 2600 ml einer 20-prozentigen Natriumcarbonatiösung zugesetzt. Es wird 1/2 Stunde lang umgerührt,
wonach das Chloroform abgeschieden wird. Die obere Phase wird
mit weiteren 300 ml Chloroform gewaschen, das der Hauptmenge beigegossen wird, die dann filtriert wird.
Der ChTrarofonnphase werden 41,5 ml Triäthylamin sowie 160 ml Apeton
zugegeben. Danach werden 450 ml 1,0 m Natriumhydroxyd zugesetzt. Es wird 2-3 Stunden umgerührt, wobei die Temperatur 25°C nicht überschreiten
sollte. Die untere Phase wird durch die (Verdampfungsprobe
auf unhydrolysierte Substanz geprüft und darf allenfalls einen farblosen, ölartigen Verdampfungsrest hinterlassen. Die obere Phase
wird abgeschieden, mit 100ml Chloroform gewaschen und filtriert.
Nach dem Abkühlen bis auf 10°C wird schnell 1/2 Volumen eiskalte konzentrierteSalzsäure zugesetzt, wonach die Auskristallisation
einer klaren gelben Substanz stattfindet. Nach halbstündigem Umrühren wird niedergeschlagene Substanz abfiltriert und mit 1/3
konzentrierter Salzsäure, Äthanol (96%) und trockenem Äthylether gespült. Es wird im Exsikkator über Natriumhydroxyd im Vakuum
getrocknet.
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Theoretische Ausbeute: Q] g
Praktische Ausbeute: 65 g reine gelbe Substanz Relative Ausbeute: 75%
9-Chloracridin~2-sulfonsäure (65 g, 0,225 mol) wird einer Lösung
von Natriummalonester in Äthanol zugesetzt. Die Lösung ist aus 15,5 g Natrium (0,675 mol) gelöst in 350 ml absolut Äthanol und
101 ml Diäthylmalonester hergestellt. Es wird 24 Stunden im Rücklaufkühler
auf Ölbad (85-900C) rückgekühlt.
Danach wird die tiefrote Lösung bis auf Zimmertemperatur gekühlt,
und es werden unter Umrühren 590 ml 2 m Salzsäure zugegeben. Nach einstündigem Umrühren in kaltem Wasser wird der Niederschlag abfiltriert,
mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser eine türkise Fluoreszenz aufweist, und bei 1000C getrocknet.
Theoretische Ausbeute: 93 g
Praktische Ausbeute: 86 g klare gelbe Substanz Relative Ausbeute: 92%
9-( pLäthylmalonyl)-acridin-2-sulfonsäure (86 g) wird in 500 ml
halbkonzentrierter Salzsäure mit einem Zusatz von 25 ml Iso-amylalkohol
aufgeschlämmt, vorsichtig (Überschäumgefahr) bis zum Kochen
erwärmt und drei Stunden lang im Rücklaufkühler rückgekühlt. Es
wird unter Umrührung in kaltem Wasser abgekühlt und nach 1 1/2 Stunden filtriert. Der Niederschlag wird mit Wasser gewaschen und
bei 1000C getrocknet.
Theoretische Ausbeute: 56 g
Praktische Ausbeute: 53 g scharf gelbe Substanz Relative Ausbeute: 95%
Stufe F: Natrium-9- (dimethylaminophenylazometinyl) - acridin-2- sulfonat
9-Methylacridin-2-sulfonsäure (63 g, 0,196 mol) wird in 400 ml 96%
609847/09 87
Äthanol aufgeschlämmt. 3s werden 8r64 g Natriumhydroxid (1,10 äquv.)
zugesetzt. Es wird eine Stunde im Rücklaufkühler schwach rückgekühlt, wobei man einen dicken Kristallbrei erhält. Es wird leicht
abgekühlt, und es werden 35,4 g p-Nitroso-dimethylanilin zugesetzt
und mit möglichst wenig Äthanol herabgespült. Unter kräftigem Umrühren wird 6 Stunden zurückgekühlt. Die Farbe der ursprünglich
grünen Kristallmasse ändert sich während der Auflösung über braun in tief rot. Nach etwa 45 Minuten erfolgt ein heftiges Ausfällen
der gewünschten Verbindung (falls das Umrühren nicht durchführbar ist, wird etwas mehr Äthanol zugesetzt).
Nach beendeter Reaktion wird der Kolben bei 10-15°C unter Umrühren
mehr als 15 Stunden lang (die Nacht über) abgestellt. Danach wird die ausgefällte Verbindung abfiltriert und auf dem Filter mit
2 χ 60 ml vorher zum Spülen des Reaktionskolbens benutztem kaltem Äthanol gewaschen. Das Filter wird gründlich abgesaugt. Trocknung
im Wärmeschrank (8Ö C).
Theoretische Ausbeute: 83 g
Praktische Ausbeute: 68 g hellrote Substanz Relative Ausbeute: 82%
Natrium-9- (p-dimethylaminophenylla zometinyl)-acridin-2-sulf onat
(68 g) wird in 700 ml Wasser mit einem Zusatz von 125 ml konzentrierter Salzsäure gelöst. Es fällt nach 2-3 Minuten eine gelbe bis
gelbbraune kristallinische Substanz aus. Das Umrühren wird 30 Minuten
lang fortgesetzt. Danach wird filtriert und der Niederschlag mit 3 x 30 ml 1 m Salzsäure und 2 χ 30 ml Wasser gewaschen. Trocknen
im Wärmeschrank (100 C).
Der trockene Niederschlag (38,7 g) wird in 387 ml Wasser aufgeschlämmt,
und es wird Natriumacetat (11,2 g) zugesetzt. Es wird 30 Minuten bei .^100C umgerührt, wonach 7,7 g Aktivkohle zugesetzt
und weitere 15 Minuten umgerührt wird. Danach wird durch ein dichtes Filter filtriert. Der Niederschlag wird mit 3 x 50 ml 0,1 m Essigsäure
gewaschen. Dem Filtrat werden unter Umrühren 54 ml 5 m Salzsäure
(halbkonzentriert) zugesetzt, wodurch spontan eine zitronengelbe kristallinische Substanz ausfällt. Es wird 15 Minuten umge-
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17 2818052
rührt und dann abfiltriert, mit 1 in Salzsäure, danach mit Wasser
und zuletzt mit 56% Äthylalkohol gewaschen. Trocknen bei Zimmertemperatur
im Vakuum.
Theoretische Ausbeute: 45 g Monohydrat Praktische Ausbeute: 32 g zitronengelbe Substanz
Relative Ausbeute: 7~L%
2Z°/a ausgehend von 2-Chlorbenzoesäure
RnqßZ.7 /
Claims (8)
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von biologisch zugänglichem
L-Lysin in proteinhaltigen Stoffproben, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit einem Aldehydreagenz
behandelt wird, das aus einem substituierten γ-Formylpyridin-derivat
mit der allgemeinen Formel:
CHO
R1
R1
1 2
besteht, wo R und R jeweils aliphatische Kohlenstoffketten mit höchstens 4 Kohlenstoffatomen bezeichnen oder zusammen mit den angeschlossenen Kohlenstoffatomen im Pyridinring aromatische Ringe bilden, zur Bildung der entsprechenden Schiff-Base, wonach die umgesetzte Aldehydreagenzmenge bestimmt wird.
besteht, wo R und R jeweils aliphatische Kohlenstoffketten mit höchstens 4 Kohlenstoffatomen bezeichnen oder zusammen mit den angeschlossenen Kohlenstoffatomen im Pyridinring aromatische Ringe bilden, zur Bildung der entsprechenden Schiff-Base, wonach die umgesetzte Aldehydreagenzmenge bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzei chnet, dass die Stoffprobe zur Isolierung der verdaulichen Proteinfraktion
einer Extraktion unterworfen wird, die Proteinfraktion dann mit einem Überschuss an Aldehydreagenz umgesetzt und nach diesem Umsatz
die Restkonzentration des Aldehydreagenzes gemessen wird.
3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
dass die Extraktion der verdaulichen Proteinfraktion durch Behandlung der Stoffprobe mit einer wässerigen Lösung eines Fette und Kohlenhydrate
nicht lösenden Kupfersalzes erfolgt.
4. Reagenz zur Verwendung beim Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, dass es· aus einem substituierten ^-Formylpyridin-derivat mit der allgemeinen Formel:
CHO
6Ω9βΛ7/Ω.<3β7
1 besteht, wo R und R jeweils aliphatieche Kohlenstoffketten mit
höchstens 4 Kohlenstoffatomen bezeichnen oder zusammen mit den angeschlossenen Kohlenstoffatomen im Pyridinring aromatische Ringe
bilden.
5. Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
dass es 9-Formylacridin mit der Formel:
CHO
6. Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es 9-Formylacridin-2-sulfonsäure mit der Formel:
CHO
SO3H
7. Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es ö-Dimethylamino-^-formylacridin-^-sulfonsäure mit der Formel:
CHO
Me2N
8. Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es 7-Nitro-9-formyl-acridin-2-sulfonsäure mit der Formel:
609847/0987
CHO
SO^H
δ09847/0ϋϊ
Applications Claiming Priority (1)
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US05/573,215 US3994688A (en) | 1975-04-30 | 1975-04-30 | Method and reagent for quantitative analysis of l-lysine in proteinaceous test substances |
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US (1) | US3994688A (de) |
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FR (1) | FR2309866A1 (de) |
GB (1) | GB1506976A (de) |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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DE102006030976A1 (de) * | 2006-07-03 | 2008-01-17 | Behrens, Meinhard, Dr. | Verfahren zum qualitativen Nachweis von zugesetzten Eiweiß-Stoffen in Lebensmitteln |
WO2018046033A1 (de) | 2016-09-12 | 2018-03-15 | MEMBRAPURE Gesellschaft für Membrantechnik mbH | VERFAHREN ZUM QUALITATIVEN NACHWEIS VON ZUGESETZTEN EIWEIß-STOFFEN IN LEBENSMITTELN |
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US3892530A (en) * | 1974-09-23 | 1975-07-01 | Hoffmann La Roche | Colorimetric and fluorometric method |
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1976
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- 1976-04-29 GB GB17437/76A patent/GB1506976A/en not_active Expired
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102006030976A1 (de) * | 2006-07-03 | 2008-01-17 | Behrens, Meinhard, Dr. | Verfahren zum qualitativen Nachweis von zugesetzten Eiweiß-Stoffen in Lebensmitteln |
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Also Published As
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CA1067805A (en) | 1979-12-11 |
GB1506976A (en) | 1978-04-12 |
SE7604830L (sv) | 1976-10-31 |
US3994688A (en) | 1976-11-30 |
FR2309866A1 (fr) | 1976-11-26 |
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