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Tablettiertes pflanzliches Proteasepräparat mit
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Inaktivierungsindikator sowie dessen Herstellung und Verwendung Die
Erfindung betrifft ein pflanzliches Proteasepräparat, das durch Tablettenform sowie
durch eine neue Art, die Inaktivierung der Protease anzuzeigen, gekennzeichnet ist
sowie die Herstellung dieser Präparate. Insbesondere betrifft sie ein tablettenförmiges,
sich in wäßrigem Medium von selbst auflösendes Papainpräparat mit Inaktivierungsindikator,
das in hervorragendem Maße zur Kälte stabilisierung ("chillproofing") von Bier geeignet
ist.
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Pflanzliche Proteasepräparate - wie z.B. Papain, Ficin und Bromelin
- sind seit langem bekannt und finden u.a. vielfältige Verwendung bei der Lebensmittelbe-
und verarbeitung.
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Sehr verbreitet ist der Einsatz pflanzlicher Proteasen zum Kältestabilisieren
("chillproofing") von Bier.
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Die bisher bekannten, marktüblichen Proteasepräparate sind jedoch
flüssig (s. DT-OS 1 517 872) oder pulverförmig Sie müssen z.B. mit einer Mensur
oder einer Waage abgemessen werden, wenn man sie einem zu stabilisierenden Bier
in einer gewünschten Menge zusetzen will, s. "BrauweltZ', Jahrgang 109 (1969) Nr.
84/85 S. 1593. Pulverförmige Präparate (Festpräparate) sind zwar im allgemeinen
stabiler als Flüssigpräparate, sie müssen jedoch vor der Anwendung mit etwas Flüssigkeit
sorgfältig vorgelöst werden, da sie bei direkter Zugabe (z.B. in einen Bier-Lagertank)
leicht verklumpen. Je nach Aufbewahrungstemperatur werden alle Enzympräparate mehr
oder weniger schnell inaktiv und damit unbrauchbar. Diese Inaktivierung ist den
Präparaten äußerlich nicht anzusehen, sie kann nur durch eine relativ komplizierte
Aktivitätsbestimmung im Labor festgestellt werden.
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Es wurde nun gefunden, daß bei pflanzlichen Proteasen im Gemisch mit
Ascorbinsäure eine sich von rosa über rot zu braun entwickelnde Verfärbung eintritt.
Diese Verfärbung ist abhängig von der Zeit und der Außentemperatur, d.h.
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den maßgeblichen auch die Inaktivierung beeinflussenden Parametern.
Sie kann daher ausgenützt werden, um die Inaktivierung des Protease-Präparats anzuzeigen.
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Das Tempo der Verfärbung ist überdies abhängig von der Schüttungsdichte.
Eine etwa gleichmäßige Verfärbung unter sonst gleichen Bedingungen läßt sich aber
dadurch erreichen, daß man die pulverförmigen Substanzen zusammen verpreßt, z.B.
tablettiert.
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Grundsätzlich eilt die Hotfärbung der Inaktivierung beträchtlich voraus.
Es wurde jedoch gefunden, daß eine recht gute Übereinstimmung zwischen Grad der
Verfärbung und der jeweils eingetretenen Inaktivierung erreicht wird, wenn die Ascorbinsäure
vor dem Vermischen und Abpressen mit der pflanzlichen Protease zunächst hydrophobiert
wird. Dies geschieht zweckmäßig mit einem Fett bzw. einer fettähnlichen Substanz,
die im Bereich zwischen 480C und 580C schmilzt. Als besonders geeignet hierfür hat
sich das Produkt "Boeson (Warenzeichen der Anmelderh), ein Gemisch von Mono-, Di-und
Triglyceriden mit überwiegendem riglyceridanteil, erwiesen. Eine Beeinträchtigung
der Schaumqualität des Bieres durch die zur Hydrophobierung verwenite Substanz konnte
nicht beobachtet werden.
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Es wurde ferner festgestellt, daß eine besonders gute Ubereinstimmung
zwischen Grad der Verfärbung und eingetretener Inaktivierung dann besteht, wenn
folgende Mengenverhältnisse in dem erfindungsgemäßen Präparat eingehalten werden:
5 bis 25 °> pflanzliche Protease mit 5 Anson-Einheiten pro Gramm (Falls das Präparat
höhere oder geringere Aktivität als 5 AE/g aufweist, ändert sich dieser Mengenbereich
entsprechend.) 50 bis 90 ß L(+)-Ascorbinsäure 2 bis 10 (,v Fett oder fettähnliche
Substanz mit einem Schmelzpunkt von 48-580C.
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Die Lösungseigenschaften der erfindungsgemäßen Proteasetablette werden
ferner durch Zusatz üblicher Sprengnittel wie Alkalikarbonate bzw. -hydrogenkarbonate
verbessert, die in Mengen von 2-30% anwesend sein können.
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Gewünschtenfalls können auch noch andere geeignete Stoffe wie Sulfit,
Cystein, Glutathion o.ä. in solcher Menge zugefügt werden, daß die oben genannten
Einsatz spannen der vier Grundstoffe nicht gesprengt werden.
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Die Herstellung des erfindungsgemäßen Präparats erfolgt so, daß zunächst
die pulvrige L(+)-Ascorbinsäure mit dem pulverförmigen oder flockigen Fett bzw.
der fettähnlichen Substanz mit Schmelzpunkt bei 55 - 650C in an sich üblicher Weise
hydrophobiert.wird. Die Hydrophobierung kann zum Beispiel durch halbstündiges intensives
Vermischen der beiden Komponenten in einem Dragierkessel oder Mischer bei Raumtemperatur
erfolgen. Die hydrophobierte Ascorbinsäure wird dann mit der pulvrigen pflanzlichen
Protease und mit dem Karbonat oder Hydrogenkarbonat gemischt und in an sich üblicher
Weise tablettiert. Die Tabletten können, um die Haltbarkeit zu erhöhen, auch noch
mit einem durchsichtigen Überzug, z. B. einer Zuckerschicht versehen werden.
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Gegenüber der üblichen Anwendung pulverförmiger Proteasen hat das
erfindungsgemäße Präparat den Vorteil, daß es wegen seiner handlichen Tablettenform
ohne Waage, Mensur o.ä. in einfachster Weise zu dosieren ist. Ein Braumeister im
Lagerkeller braucht z.B. nur die erforderliche Anzahl Tabletten (z.B. 1 große Tablette
pro 10 hl oder 1 kleine Tablette pro hl) ab zuzählen und dem zu stabilisierenden
Bier zuzusetzen.
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Das erfindungsgemäße tablettenförmige Präparat erreicht damit die
hohe Stabilität der Festpräparate, ohne ihre sonst üblichen Nachteile hinsichtlich
umständlicher Auflösung zu haben. Das erfindungsgemäße Präparat kann direkt zu Bier
in einen großen Bier-Lagertank geworfen werden; es löst sich unter X&2-4hatw}sklung
von selbst auf. Die aufsteigenden C02-Blasen sorgen außerdem für eine gute Durchmischung
der Flüssigkeit.
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Die fortschreitende Inaktivierung des Präparates wird durch augenfällige
Färbung deutlich. Die voll aktive Tablette ist weiß, sie färbt sich bei allmählicher
Inaktivierung über rosa, rot in braun. Sobald eine Tablette kräftig rosa gefärbt
ist, ist ihre Verwendung nicht mehr angezeigt.
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Das erfindungsgemäße Präparat weist zudem eine höhere stabilisierende
Wirkung auf Bier aus als reine Proteasepräparate gleicher Aktivität. Dieser Effekt
wird deutlich, wenn man z.B. gleiche Aktivitätsmengen eines Papains einmal als Papain
allein und zum anderen in der zum erfindungsgemäßen Präparat weiterverarbeiteten
Form einem Bier zusetzt.
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Es zeigt sich dann die höhere Stabilisatorwirkung des erfindungsgemäßen
Präparates (vgl. die Beispiele). In gleicher Weise zeigte sich auch neben der Kältestabilisierung
eine Verbesserung der reduzierenden Kraft des Bieres. Dadurch werden unerwünschte
Oxydationen verhindert und der Bildung des unerwünschten sogenannten "Altgeschmacks"
entgegengewirkt.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken:
lIerstellun,gsbeisDiel 750 Gramm krist. L(+)-Ascorbinsäure (DAB 7) wurden mit 50
g Boeson VP (R) (Warenzeichen der Anmelderin) eine halbe Stunde intensiv in einem
Tubusmischer bei Raumtemperatur gemischt.
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Dann wurden dem Mischer 50 g Natriumhydrogenkarbonat und 150 Gramm
Papain mit 5,0 Anson-Einheiten pro Gramm zugeführt und zwei weitere Minuten gemischt.
Das Gemisch wurde dann in üblicher Weise auf einer Tablettiermaschine zu Rundtabletten
von Je 1,0 Gramm Gewicht mit einem Druck von 120 kg/cm? gepreßt.
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Ein Teil der Tabletten wurde bei 7000 gelagert und in Abständen auf
Proteaseaktivität und Aussehen überprüft.
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Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse dieser Lagerungsversuche.
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Tabelle 1: Proteaseaktivität und Färbung der Tabletten gemäß--Herstellungsbeispiel
im Verlaufe einer 70°C-Lagerung.
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Proteaseaktivität Färbung (Anson-Einh./g) (-) O Tage bei 700C 0,45
weiß 3 Tage bei 700C 0,42 weiß 7 Tage bei 700C 0,39 zart rosa 14 Tage bei 700C 0,34
kräftig rosa 28 Tage bei 700C 0,26 hellrot 42 Tage bei 700C 0,19 dunkelrot 96 Tage
bei 700C 0,09 braun
Die Ermittlung der Proteaseaktivität erfolgte
nach Anson (siehe J.gen.Physiol. 22, 79 (1939). Die Anson-Einheit ist definiert
als die Enzymmenge, die bei 35,50C und pH 7,5 das Substrat Hämoglobin mit einer
solchen Anfangs-Umsatzrate abbaut, daß pro Minute eine Menge von Spaltprodukten
freigesetzt wird, die mit dem Phenolreagens nach Folin und Ciocalteu die gleiche
Farbe ergibt wie 1 /u Mol Tyrosin.
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Anwendungsbeiepiel Kältetrubanfäliiges Bier aus einer einheitlichen
Charge, die sich am Ende der Lagerung befand, wurde in Fässer gefüllt und in folgender
Weise behandelt: Faß A: keine Präparatezugabe; Faß B: Zugabe von einer Tablette
gemäß Herstellungsbeispiel auf 50 1 Bier; Faß C: Zugabe von 0,15 g des im Herstellungsbeispiel
genannten Ausgangspapains pro 50 1 Bier. Das Papain wurde in ca. 100 ml Bier vor
der Zugabe zum Faß voraufgelöst.
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Nach Zugabe der Präparate wurden die Fässer wieder verschlossen, einige
Male hin- und hergerollt und eine Stunde stehen gelassen. Dann wurde das Bier in
üblicher Weise über Kieselgur filtriert, auf Flaschen gefüllt und 14 Tage bei 1500
gelagert. Nach der Lagerung zeigten die drei unterschiedlich behandelten Biere die
in Tabelle 2 zusammenge stellten Daten.
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Tabelle 2: Analysendaten der gemäß Anwendungsbeispiel unterschiedlich
behandelten Biere.
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keine Zugabe Tabletten- Reinpapain-Zugabe Zugabe zuge setzte Proteaseaktivität
[AE/50 1] 0,00 0,45 0,45 Reduktionsvermögen nach Steiner [-] 30 71 45 Schaumziffer
nach Ross und Clark [-] 88 95 85 N-Fraktionierung nach Lundin Fraktion A ¼joi 20,0
5,8 8,4 Fraktion B [%] 22,8 36,1 33,5 Fraktion C [%] 57,2 58,1 58,1 Kältetrübung
(Forcigrtest bei 40 C) Blindwert [EBC-Einh.] 0,4 0,4 0,4 1. Warmtag + 24 h bei O
C [EBC-Einh.] 3,9 0,4 0,5 2. Warmtag + 24 h 0,7 0,8 bei O°C [EBC-Einh.]-5. Warmteg
+ 24 h bei O C [EBC-Einh.] -- 0,7 1,0 6. Warmtag + 24 h h bei O C [EBC-Einh.] --
0,7 1,3