DE2536646A1

DE2536646A1 - Vorrichtung zur ausfuehrung von verfahren zur doppelten und radialen immundiffusion

Info

Publication number: DE2536646A1
Application number: DE19752536646
Authority: DE
Inventors: Alberto Bracciali; Sergio Prof Piazzi; Sandra Dr Sordi
Original assignee: Istituto Sieroterapico e Vaccinogeno Toscano Sclavo SpA
Current assignee: Istituto Sieroterapico e Vaccinogeno Toscano Sclavo SpA
Priority date: 1974-08-20
Filing date: 1975-08-16
Publication date: 1976-03-04
Also published as: US3990852A; DE2536646B2; FR2282469A1; IT1018223B; GB1512417A; DE2536646C3; FR2282469B1

Description

Istituto Sieroterapico e Vaccinogeno Toscano "SCLAVO" S p.A. Via Fiorentina 1, SIENA, Italy

Vorrichtung zur Ausführung von Verfahren zur doppelten und radialen Immundiffusion

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Ausführung von Verfahren zur doppelten und radialen Immundiffusion mit einer Agargelschicht oder dergleichen mittels mit Löchern versehenen Trägerplatten.

Gemäß der Erfindung ist die Vorrichtung im wesentlichen gekennzeichnet durch ein erstes Plattenelement, welches durchgehende Löcher bildet, deren Bodenöffnung an der ersten ihrer Flächen eine verminderte Fläche aufweist, an der die Agargelschicht oder dergleichen im Innern einer umfänglichen Kante gebildet wird, während an den gegenüberliegenden Öffnungen der Löcher eventuell ein Klebefilm zur Abdeckung anbringbar ist, sowie durch eine zweite Deckplatte, welche auf die umfängliche Kante zur Bildung einer Kammer, welche die Agargelschicht oder dergleichen einschließt, aufgebracht werden kann.

Bei einer vorteilhaften Ausführungsform ist die Agar-

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gelschicht oder dergleichen auf einer Fläche angeordnet, die durch einen umfänglichen Rand begrenzt ist, dessen Höhe gleich der Schichthöhe ist. So vermeidet man, daß die Agar gelschicht mit dem Rand einen Meniskus bildet. Dieser umfängliche Rand kann eine Stufe zwischen der umfänglichen Kante und der Platte bilden.

Für RadialimmundifEisionsverfahren ist vorteilhafterweise in der Mitte der Platte eine umfängliche, vorstehende Kanbe vorgesehen, deren Abstand von den unteren Öffnungen gleich dem des umfänglichen Randes ist.

Für Doppelimmundiffusionsverfahren sind die unteren Öffnungen der Löcher vorteilhafterweise außermittig in Bezug auf die Löcher und nach der Mitte verschoben. Das mittige Loch kann eine weite Bodenöffnung aufweisen, die mit einer siebartigen Wand versehen ist.

Die Zeichnung stellt eine nicht einschränkende Ausführung sform der Erfindung dar. Es zeigen Fig. 1 eine Draufsicht einer Radial immundif fus ionsp latte Fig. 2 einen Schnitt auf der Linie II-II von Fig I,

welcher die getrennten Teile erkennen läßt Fig. 3 einen gleichen Schnitt wie Fig. 2 mit den zusammengepaßten Teilen

Fig. 4 eine Draufsicht einer Platte für Doppelimmundiffusion

Fig. 5 einen Schnitt auf der gebrochenen Linie V-V von Fig.4, der die verschiedenen getrennten Teile erkennen läßt

Fig.6 einen gleichen Schnitt wie Fig. 5 mit den zusammengepaßten Teilen.

Gemäß Fig. 1 bis 3 besitzt die Platte 11 mit einer vergleichsweise geringen Stärke eine umfängliche Kante 13, welche mit dem Umfang der Platte 11 durch eine Stufe 15 verbunden ist,

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welche einen Rand 15 A zur Begrenzung der Fläche 11 A der Platte bildet. In der Mitte der Fläche 11 A der Platte ist ein (eventuell hohler) Kern 17 vorgesehen. Auf der Fläche 11 A zwischen der Wand 15 A und derjenigen der Stufe 17 C der Seitenwand ¹⁷%es Kerns 17 ist die Agargelschicht 18 verteilt. Von der der Fläche 11 A gegenüberliegenddi Seite der Platte 11 erstrecken sich zylindrische Wände 19 und diese Wände 19 begrenzen Löcher 21 zur Aufnahme der zu analysierenden Proben. Diese Löcher 21 sind am Ende etwas verjüngt und bilden untere LöcherÖffnungen 21 A entsprechend der Fläche 11 A. Die Öffnungen 21 A haben im wesentlichen gleichen Abstand von der Kante 15 A und von der Seitenwand 17 B des Kernes 17, um auf diese Weise unterschiedliche Einflüsse in zentripetalen und zentrifugalen Richtungen auf die Vorgänge, welche auf der Agargelschicht 18 bewirkt werden, zu vermeiden.

Die Anwesenheit der Stufe 15, 15 A und der Stufe 17 C, deren Höhe der Dicke der Agargelschicht 18 entspricht, erlaubt die Vermeidung der Bildung eines (meistens konkaven) Meniskus an der Peripherie der Schicht 18. Durch diese beiden Stufen 15, 15 A bzw. 17 C sind der äußere und der innere Umkreis der Schicht 18 begrenzt. Diese Umkreise haben in der radialen Richtung von den Löchern 21 A gleichen Abstand und keinen Meniskus.

Die Platte 11 ist mit einer Abdeckung 23 versehen, die einen Rand 23 A aufweist zum Eingriff mit dem Endteil der Kante 13. Es ist ein Klebefilm 25 zur Anbringung auf den oberen Rändern der Wände 19 der Löcher 21 vorgesehen. Die Platte, die in Bezug auf die Darstellung von Fig. 2 und 3 umgekehrt und vorteilhafterweise schon mit dem Film 25 versehen ist, wird mit der Agargelschicht 18 vervollständigt und dann wird die Schutzdecke 23 angebracht. Auf diese Weise kann die Einheit bis zum Augenblick der Ver-

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Wendung aufbewahrt werden. Zur Verwendung läßt iran die Einheit in der Anordnung von Fig. 3 und entfernt den selbstklebenden Film 25. Die Löcher 21 werden mit Proben der für die Zwecke von Radialimmundiffusion zu untersuchenden Substanzen gefüllt und dann kann der Film 25 schließlich wieder aufgebracht werden. Die Einführung der Substanzen kann leicht mit Spritzen oder dergleichen erfolgen. Anstatt des Films 25 kann man die aus der Fig. 3 dargestellten Lage entfernte Decke 2 3 auf den oberen Rand der Wände 19 der Löcher 21 legen, wobei dann die Platte 11 direkt mit der Kante 13 auf die Arbeitsebene (Glas,Mariror oder gergleichen) gelegt wird. Als Alternative kann man auch die Löcher auf andere Weise abdecken. Die Messung der Veränderungen, die in der Agargelschicht bewirkt werden, ist leicht wegen der Transparenz der Platte 11 und der Möglichkeit, daß man nachfolgend ein Kaliber jedem Loch entsprechend heranbringen kann.

In Fig. 4 bis 6 ist eine Platte, die sich zur Doppelimmundiffusion eignet, vorgesehen. In diesem Fall besitzt eine Platte 31 eine zentrale zylindrische oder prismatische Wand 33, die ein Loch 35 begrenzt, das mit einem weiten, siebartigen Boden 37 versehen ist. Zusätzliche Löcher 39 sind durch Wände 41 an dem Umfang gebildet, die mit einer umfänglichen Kante 43 verbunden sind. Die Löcher 39 besitzen außermittige Öffnungen 45 in zentripetaler Richtung in Bezug auf die Scheibenplatte 31. Entsprechend der umfänglichen Kante 43 ist auf der gegenüberliegenden Seite in Bezug auf die Platte 31 eine Kante 47 gebildet, die durch eine umfängliche Stufe 49 mit der Platte 31 verbunden ist. Im Innern der Stufe 49 ist auf der Fläche der Platte 31, die der Fläche gegenüberliegt, von der die Wände 33 und 41 der Löcher 35 und 39 ausgehen, eine Agargelschicht 51 verteilt. Diese Schicht dringt nicht in das Loch 35 ein infolge der durch deren Boden 37 erhaltenen Unterteilung während sie nicht einmal in die Löcher 39 eindringt infolge /vergleichsweise begrenzten

der

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Abmessungen der außermittigen Löcher 45. Die Schicht bildet keinen Meniskus, da ihre Dicke der Höhe der Stufe 49 ent ;-pr icht.

Es kann ein Abdeckbeil 53 auf der Kante 47 angebracht v/erden, un die Kammer, in der sich die Schicht 51 zur aufbewahrung befindet, abzuschließen, wie in Fig. 6 dargestellt ist. Hin aelbstklebender Film 55 ist auf die Ränder der Kante 43 und der Löcher 35 und 39 aufgebracht.

Die /abdeckplatte 53 kann in dsr Fig. 6 dargestellten Lage bleiben, wenn man die Proben in die Löcher 35 und 39 durch Exitfern^n des Films 55 einführt. Alternativ kann die Abdeckplatte 53 zum Verschluß der Löcher 35 und 39 angeordnet werden, irndem man sie mit ihrem eigenen atufenartigan Rand S3 A außrsn und um die Kante 43 einpaßt.

Der Boden der Löcher 39 ist vorteilhafterweise gegen das entsprechende Loch 45 wie ein Trichter geneigt. In jeden- Fall erlaubt die exzentrische Öffnung 45 jedes Locnes 39, das in der zentripetalen Richtung in Bezug auf die Anordnung der Scheibenplatte 31 verschoben ist, den Plattendurchmesser in Bezug auf die geometrischen Bedingungen der Öffnungen der zentrierten ' Löcher und bei einem gleichen Abstand von der umfänglichen Kante, welche die Agargelschicht begrenzt, zu reduzieren.

Die wirkung der äußeren und eventuell inneren Stufe zur Vermeidung der Meniskusbildung in der Agargelschicht erlaubt, Veränderungen in der zentrifugalen Diffusionsrichtung zu vermeiden, da die Anwesenheit des Meniskus - der leichter getrocknet wird - dazu neigt, die diffundierende Lösung anzuziehen.

Die Vorrichtung wird ir.it angebrachtem Stück 23 Coder 53), der aufgelegten Schicht 18 (oder 51) und

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leeren Löchern 21 (oder 35,39) und verschlossen durch den Klebestreifen 25 (oder 55), der lösbar und wiederanbringbar ist, geliefert. Der Benutzer braucht nur mit einer Mikrospritze oder dergleichen die zu untersuchenden Proben in der gewünschten Menge bis zu beispielsweise 12o Mikroliter in die Löcher einzubringen. Zu diesem Zweck wird der Klebefilm, welcher die Löcher verschließt, gehoben, werden die Proben eingebracht und diffundiert, nachdem man die Löcher mit dem Klebefilm verschlossen hat. Die Feuchtigkeitskammer wird nicht benötigt, da die Diffusion unter Umgebungsbedingungen bewirkt wird.

Während die Agargelschicht bei den vorbekannten und erprobten Vorrichtungen zwischen Oberflächen angeordnet ist, welche die Durchdringung verlangsamen und die Diffusionszeiten in Bezug auf die klassische Analyse auf dem Objektträger länger sind, wird man durch die erfindungsgemäßige Vorrichtung zu den klassischen Bedingungen geführt. Die besondere Lage des Agars oder dergleichen in der erfindungsgemäßen Vorrichtung erlaubt und gewähr leistet in der Tat eine vollständige Durchdringung, welche zum Einhalten der Diffusionszeiten benötigt wird, welche mit den höheren Volumen zu lang würden.

Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es möglich, die Volumen der Prüfmuster unabhängig von den unteren Durchmessern der Löcher zu variieren. Wenn man die Durchmesser des Bodens der Löcher und die Entfernung zwischen dem Antigenlochi und dem Antikörper loch festgesetzt läßt, kann das Volumen des Antigens beispielsweise bis zu 12o Mikroliter variiert werden und ebenso kann das des Antikörpers beispielsweise bis zu 12o Mikrolitern variiert werden. Dieses Jferkmal macht die Vorrichtung zur Ausführung einer Radial- und Doppelimmundiffusionsanalyse bereit im Gegensatz zu den herkömmlichen Methoden, wo man jedesmal je nach den zu analysierenden Proben sowohl die Entfernung zwischen dem Antigenloch

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und dem Antikorperloch als auch die Durchmesser dieser Löcher auswählen muß.

Beispiele für mit der Vorrichtung durchführbare Verfahren sind:

die Analyse von Antigenen, welche einen bakterischen Ursprung haben, und der entsprechenden Antikörper; die Analyse all der menschlichen plasmatischen Fraktionen und der biologischen Flüssigkeiten im normalen Zustand und im pathologischen Zustand; die Analyse von Antigenen pflanzlichen Ursprungs; die Analyse von Hormonen ect.. Die Doppel- und Radialdiffusionstechniken gelten im allgemeinen als wenig empfindlich im Hinblick auf andere Techniken - wie die Radio-Immunanalyse, die Komplementenfixierung und dergleichen - aber sie spielen weiter eine bedeutende Rolle in der Immunologie. Die mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung erzielte erhöhte Empfindlichkeit kann diese Techniken zu einer allgemeineren Anwendung führen.

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Claims

Patentansprüche

Vorrichtung zur Ausführung von Doppel - und Radialimmundiffusionsverfahren mit einer AgargeIschicht oder dergleichen, gekennzeichnet durch ein erstes Plattenelement (11J31) mit durchgehenden Löchern (21;39) mit Bodenöffnung, welche durch eine reduzierte Fläche zu einer ersten ihrer Oberflächen besitzt, gegen welche die Agargelschicht (18;51) oder dergleichen im Innern einer einer umfänglichen Kante gebildet ist, während auf den gegenüberliegenden Öffnungen der Löcher ein dichtender Klebefilm (2 5;55) angebracht ist, und durch ein zweites Abdeckstück (23/53), welches auf der umfänglichen Kante des ersten Elements anbringbar ist zur Bildung einer Kammer für die Agargelschicht oder dergleichen.

Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Löcher (21/39) ein erstes zylindrisches Stück und ein zugespitztes Stück besitzen, welches eine Öffnung begrenzt, die an dieser Fläche reduzierten Durchmesser aufweist, gegen welche die Agargelschicht (18,51) oder dergleichen gebildet ist.

Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Agargelschicht (18;51) auf eine Fläche aufgebracht ist, welche durch einen umfänglichen Rand (15;49) begrenzt ist , dessen Höhe gleich der Schichthöhe ist, um zu vermeiden, daß die Agargelschicht einen Meniskus mit der Kante bilden kann. 6 09810/0669

Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der umfängliche Rand zwischen der umfänglichen Kante und der Platte eine Stufe (15,15 A,-17 C;49) bildet.

Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der umfängliche Rand die äußere umfängliche Anlagekante mit dem zweiten Abdeckstück (23;53) bildet.

Verrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicke der Platte (11^31) geringer ist als die Tiefe der Löcher und daß die letzteren von von der Platte herausstehenden Wänden (19_f41) begrenzt sind vind daß auf deren Endrand der Klebefilm (25^55) angebracht ist.

Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine umfängliche Wand (43) der Platte von dem Teil der vorstehenden Wände der Löcher bis zu der Höhe ihres Randes vorsteht, wenn Messungen mit dem Kaliber nicht erforderlich sind.

Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei Radialimmundiffusionsverfahren in der Mitte der Platte ein umfänglicher vorstellender Rand (17 B) vorgesehen ist, dessen Entfernung von den unteren öffnungen der Löcher gleich derjenigen des umfänglichen Randes von diesen Öffnungen ist.

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Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei Doppelimmundiffusionsverfahren die unteren Öffnungen (45) der Löcher in Bezug auf die Löcher außerrittig sind und nach der Mitte verschoben.

Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das mittige Loch(35) eine weite und mit einer siebartigen Wand (37) versehene Bodenöffnung besitzt.

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