DE2462152C3 - Mikroorganismus der Art Lactobacillus bavaricus - Google Patents

Description

Die milchsaure Vergärung verschiedener Gemüse und Früchte gehört zu den ältesten Arten der Haltbarmachung und Steigerung der Bekömmlichkeit pflanzlicher Produkte (Sauerkraut, saure Gurken, Mixed Pickels usw.). Üblicherweise erfolgt eine spontane Gärung mit einer gemischten Bakterienflora. Bakteriologische Untersuchungen ergaben, daß im wesentlichen vier verschiedene Milchsäurebakterienarten an der milchsauren Gärung beteiligt sind, nämlich die heterofermentativen Leuconostoe mesenteroides und Lactobacillus bravis (Synonym L buchneri) und die homofermentativen Lactobacillus plantarum (synonym L oucumeris) und Pediococcus cerevisiae. Es ist ferner bekannt, Reinkulturen vorstehend genannten und anderer Organismen als Animpfkulturen zuzusetzen, um eine raschere Säuerung und einen besseren Geschmack zu erzielen, bzw. um unerwünschte Fremdinfektionen zu vermeiden.

Ferner ist aus der DE-AS 20 01 874 ein Verfahren zur Herstellung von milchsauren Gemüse- und Fruchtsäften bekannt, bei dem Gemüse- oder Fruchtmaischen bzw. -safte mit Milchsäurebakteriengemischen von Stämmen der Arten Lactobacillus salivarius und L casei und Streptooccus lactis und Str. cremoris vergoren werden. Diese Milchsäurebakterien bilden fast nur L(+)-Milchsäure, die vom menschlichen Organismus physiologisch sehr gut verwertet wird, was für die D(-)-Milchsäure nicht der Fall ist

Bei dem bekannten Verfahren ist es notwendig, das Ausgangsmaterial vor dem Vergären durch Erhitzen zu entkeimen, um eine durch die immer vorhandene Wilflora bedingte Spontangärung zu vermeiden. Weiterhin wird die Gärung bei relativ hohen Temperaturen, z. B. bei etwa 30 bis 40⁰C, durchgeführt

Bei Gemüsen und Früchten ist jedoch in der Regel eine auch teilweise Entkeimung vor dem Animpfen mit der Reinkultur bzw. dem Reinkulturgemisch nicht möglich. Dies gilt besonders für Sauerkraut und alle anderen Gemüse, deren Verarbeitung in der kalten Jahreszeit erfolgt Die Vergärung dieses Materials erfolgt bei sehr niederen Temperaturen von meist unter 10⁰C, vielfach sogar unter 5"C, da ein Aufwärmen technisch schwierig und kostspielig ist

Auch andere bekannte Arten von Milchsäurebakterien, die L(+)-Milchsäure bilden, eignen sich nicht zur

ίο milchsauren Vergärung von pflanzlichen Lebensmitteln bei niedrigen Temperaturen, da sie unter diesen Bedingungen viel zu langsam wachsen. Bei der Vergärung von Weißkohl, Gurken usw. kommt als weiterer wachstumshemmender Faktor noch der relativ hohe Salzgehalt des Ausgangsmaterials hinzu. Es gelang beispielsweise nicht, Streptococcus latis, der L(+)-Milchsäure bildet, in Sauerkraut zur Entwicklung zu bringen. Auch Lactobacillus salivarius und Lactobacillus casei, die beiden anderen bekannten L(+)-Milchsäurebildner, erwiesen sich als ungeeignet, bei niederen

Temperaturen pflanzliche Lebensmittel, wie Früchte, Gemüse und daraus hergestellte Maischen und Säfte, zu

säuern und di& spontane Flora zu verdrängen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue

Art von Milchsäurebakterien zu finden, die auch bei niedrigen Temperaturen, z. B. bei weniger als 10° C und möglichst auch noch bei weniger als 5° C, in pflanzlichem Material, wie Gemüse, Früchten und den daraus hergestellten Maischen und Säften, ein gutes Wachstum

jo zeigt und praktisch ausschließlich L(+^Milchsäure erzeugt.

Es konnte nun überraschenderweise ein Mikroorganismus aufgefunden und in Reinkultur gewonnen werden, der diesen Anforderungen genügt Der

j5 Mikroorganismus erwies sich als eine neue Art, die als Lactobacillus bavaricus bezeichnet werden soll. Ein Stamm dieser Art mit der Bezeichnung 136 wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen (DSM) am 10. August 1974 unter der Nr. 20 269 und bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 8. August 1974 unter der Nr. 31 063 hinterlegt.

Beschreibung von L bavaricus:

Folgende Eigenschaften zeigen, daß der neu isolierte Organismus zur Gattung Lactobacillus zu stellen ist;

-,ο Gram-positive unbewegliche Stäbchen etwa 1 μ dick und 2—5μ lang, gelegentlich leicht gebogen (Fig. 1), keine Sporenbildung, Katalase negativ; Benzidintest (Oxydasetest) negativ, mikroaerophil; stark saccharolytisch, mehr als 95% der vergorenen Glucose liegen als

Milchsäure vor (homofermentativ).

Innerhalb der Gattung Lactobacillus ist der neue Organismus in die Untergattung Streptobacterium einzuordnen, denn er wächst bei 15° C, zeigt Tendenz zur Kettenbildung, vergärt im Gegensatz zur Untergat-

bo tung Thermobacterium neben Hexosen auch Ribose (Essigsäure und Milchsäure als Gärprodukte), bildet aber nicht, wie die 3. Untergattung Betabacterium, aus Hexosen CO2. Die Abgrenzung von allen anderen bis heute beschriebenen Arten der Streptobakterien (B e r g e y) ergibt sich aus der Zusammenstellung der Merkmale in Tabelle I. Die Merkmale der nach den Beispielen 2—5 isolierten Mikroorganismen sind in den Tabellen II und III zusammengestellt

Tabelle: Vergleich der Merkmale von L bavaricus mit denen der anderen Arten der Untergattung Streptobacterium — =negativ bzw. fehlend; + =positiv; (+)=schwach positiv.

Konfiguration der
Milchsäure

N AD-abi längige: D-LDH L-LDH

L-LDH aktivierbar durch FDP

+Mn⁺ + Elektroohoretische
Wanderung
der L-LDH
(Kaninchen
iso 1 = 1,0)
pH=73

Milchsäureracemasse

Peptidoglycan-Typ

G+

C%

L. plant|Tum
L coryniformis ssp.
coryniformis
ssp. torquens

ssp. casei
ssp. rltiamnosus
ssp. alactosus
ssp. tolerans
ssp. pseudo-pJantarumt

L curvatus

L sake

L. xylosus

L bavaricus

(nach Bsp. 1)

DL
DL

UD)
DL

DL
DL
L
L

1,28

0,93 033 0,93 033 033

1,6 1,6 1,44 1,6 meso-DAP direkt 45

Lys-D-Asp 45

Lys-D-Asp 45,4

Lys-D-Asp 46,4

Lys-D-Asp 46,4

Lys-D-Asp 46,4

Lys-D-Asp 463

Lys-D-Asp 453

Lys-D-Asp 433

Lys-D-Asp 42£

Lys-D-Asp 34,9

Lys-D-Asp 403

U Vergärung von verschiedenen Kohlehydraten

CA

inos

rabi
ylos

Xylose

ibose

Sor

κ a

ο 2

·§ i§ i

oi S ei

nose
Saccharose

S S

Lactos

obios

3 ö ~

ΰ I 1

L. plan ta ram L. coryniformis

ssp. coryniformis
ssp. torquens

L. casei
ssp. csisei
ssp. rhiamnosus
ssp. alactosus
ssp. tolerans
ssp. püeudoplantarum

L. curvatus

L. sake

L. xylosus

L. bavaricus

(nach Bsp. 1)

Bestimmung der in Tabelle 1 angegebenen Parameter Konfiguration der Milchsäure

Die Konfiguration der Milchsäure würde mit stereospezifischen Lactatdehydrogenasen im optischen Test bestimmt (vgl. H ο h ο r s t, H. J.: L-Lactatbestimmung in: Methoden der enzymatischen Analyse (H. U. Bergmeyer) 266-270,Weinheim[1966]).

NAD-abhängige D-LDH bzw. L-LDH

Das Vorkommen der stereospezifischen Lactatdehydrogenasen (D-LDH und L-LDH) wurde im partikelfreien Homogenisat der Mikroorganismen geprüft. Dazu wurden die Substrate D- bzw. L-Lactat und das

Coenzym I (Nicotinamid-Adenin-Dinucleo-

tid = NAD+) zugesetzt und die im positiven Fall eintretende Extinktionsänderung bei 366 nm aufgrund der Reduktion der NAD gemessen (vgl. Hohorst a. a.O.).

^b0 L-LDH aktivierbar durch FDP+Mn⁺ +

Die Aktivierbarkeit der L-LDH durch Fruktose-1,6-Diphosphat (FDP) und zweiwertige Manganionen wurde in ähnlicher Weise wie die NA D-Abhängigkeit to geprüft; zusätzlich wurde der Einfluß dieser beiden Reagenzien auf die Reaktionsgeschwindigkeit geprüft (vgl. De Vries, W. Kapteijn, W.M.C, Van der B e e k, E. G. und A. H. S t ο ·■'. t h a m e r: Molar growth

yields and fermentation balances of Lactobacillus casei L3 in batch cultures and in continuous cultures. J. Gen. Microbiol.63,333-345[1970]).

Milchsäureracemase

Die Anwesenheit der Milchsäureracemase wurde durch 3stündige Inkubation des partikelfreien Homogenats der Mikroorganismen mit D- bzw. L-Laktat und anschließende Prüfung der Entstehung des jeweils anderen Stereoisomeren des Laktats nachgewiesen (vgl. Stetter, K.O. und O. Kandier: Untersuchungen zur Entstehung von DL-Milchsäure bei Lactobacillen und Charakterisierung einer Milchsäureracemase bei einigen Arten der Untergattung Streptobacterium. Arch. Microbiol. 94,221 -247 [1973]).

Elektrophoretische Wanderung der L-LDH

Das partikelfreie Homogenat der Mikroorganismen wurde der Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei pH 7,8 unterworfen (vgl. Stetter, Karl O.: Physiologischbiochemische Untersuchungen zur Bildung von Milchsäureisomerengemischen bei Lactobacillen. Dissertation T. U. München S. 44-55 [1973]).

Die Fehlerbreite der Bestimmung beträgt rd. 3%. Alle voneinander verschiedenen Werte wurden durch Coelektrophorese der jeweiligen Lactatdehydrogenasen in der gleichen Gelsäule abgesichert.

Peptidoglycantyp

Der Peptidoglycantyp wurde durch Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung der isolierten Zellwände nachgewiesen (vgl. Schleifer, K. H. und O. K a η d ler: The peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications. Bacteriol. Rev. 36, 407-477 [1972]).

G + C%

Der Anteil von Guanin (G) und Cytosin (C) in der Desoxyribonucleinsäure des Organismus wurde aufgrund der optisch ermittelten Schmelztemperatur bestimmt(vgLMarmur, ].undDοty, P.:Determination of the base composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturation temperature. J. Mol. Biol. 5,109 [1962]). Die Fehlerbreite der Bestimmung beträgt ±1%.

Wachstum bei 45° C

Bestimmung der Trübungszunahme in MRS-Bouillon nach zweitägiger Bebrütung (Man, J. C de, Rogosa, M. and M. E-Sharpe: A medium for the cultivation of Lactobacilli. J. AppL Bact 23,130-135 [I960]) bei 45° C.

Vergärung von verschiedenen Kohlehydraten

Ersatz der Kohlenhydratquelle der MRS-Bouillon durch das betreffende Kohlenhydrat und Bestimmung der Säurebndung während des Wachstums durch Indikatorumschlag (Chlorphenolrot). Die Werte für L. bavaricus beziehen sich auf die beiden nach Beispiel 1 gewonnenen Stämme (München bzw. Schleswig-Holstein). Weitere Werte über die Kohlenhydratvergärung sind in Tabelle ΓΠ angegeben.

Von dem als häufiger Vertreter in Sauerkraut und anderen milchsauer vergorenen Gemüsen beschriebenen L.plantarum unterscheidet sich L. bavaricus in zahlreichen biochemischen Merkmalen, die besonders in jüngster Zeit in den Vordergrund gestellt werden. So liegt der Prozentgehalt der Purinbasen Guanin und Cytosin (G + C%) an der genetischen Substanz (Desoxyribonukleinsäure) um rund 4% niedriger, das Peptidoglycan (Zellwandsubstanz) ist von einem anderen Chemotyp, und durch das Vorkommen beider sterisch verschiedener Milchsäurehydrogenesen (LDH)

-. in L plantarum bildet dieser DL-Milchsäure. L bavaricus besitzt demgegenüber nur eine L-LDH und bildet daher ausschließlich L(+)-Milchsäure. Außerdem ist diese L-LDH durch FDP und Mn⁺+ in spezifischer Weise aktivierbar. Auch die Ladung der L-LDH, wie sie

Ht in der Wandergeschwindigkeit bei der Gel-Elektrophorese zum Ausdruck kommt, ist unterschiedlich. Schließlich bestehen Unterschiede im Spektrum der vergärbaren Kohlehydrate, doch werden diese Merkmale neuerdings nicht so stark bewertet, da auch zwischen

r? den Stämmen einer Art Unterschiede hinsichtlich der Zuckervergärung auftreten können, die also mehr stamm- als artspezifisch sind.

Ähnlich zahlreiche Unterschiede wie zu L plantarum bestehen auch zu L coryniformis, wenn man vom Peptidoglycantyp absieht, der mit Ausnahme von L. plantarum innerhalb der Untergattung einheitlich ist Mit L. casei und dessen Unterarten hat L. bavaricus die FDP und Mn⁺⁺ aktivierbare L-LDH gemeinsam, aber der G + C%-Geha!t ist ebenso wie die eiektrophoretisehe Beweglichkeit der L-LDH deutlich verschieden. Die beiden Arten Lcurvatus und L. sake sind hinsichtlich einiger Eigenschaften der L-LDH dem L bavaricus gleich, liegen aber hinsichtlich des G + C°/o-Gehalts etwas höher und weisen eine

jr, Milchsäureracemase auf, die zur Bildung von DL-Milchsäure führt Das unterscheidet sie eindeutig von L bavaricus. Der wie L bavaricus reine L(+)-Milchsäurebildner L xylosus ist durch die andere elektrophoretische Beweglichkeit der L-LDH und einen sehr niedrigen Wert des G + C%-Gehalts ebenfalls klar unterschieden.

Weitere Merkmale von L bavaricus Die Temperaturabhängigkeit des Wachstums von

4(i L bavaricus im Bereich von 3 bis 16°C ist in Fi g. 2 im

Vergleich zu anderen L(+)-Milchsäure bildenden Milchsäurebakterien dargestellt Die Wachstumskurven

beziehen sich auf folgende Mikroorganismen:

(1) L. bavaricus

^4> (2) L. casei ssp. alactosus

(3) L. casei ssp. tolerans

(4) L casei ssp. rhamnosus

(5) L casei ssp. casei

(6) L. casei ssp. xylosus

Die Werte von Fig.2 wurden hierbei wie folgl erhalten:

Die Kulturen wurden l%ig in je 10 ml MRS-Bouillon angeimpft und bei verschiedenen Temperaturen bebrütet Nach 6 Tagen wurde mit Hilfe eines Photometen die Trübungszunahme (optische Dichte o. D.) bei einei Wellenlänge von 578 nm als Maß für das Wachstum bestimmt

Die Temperaturabhängigkeit des Wachstums von L.bavaricus im Bereich von 3 bis 16°C ist in Fig.3 inVergleich zu den wichtigsten Vertretern der aui Sauerkraut wachsenden Spontanflora dargestellt Die Wachstumskurven beziehen sich auf folgende Mikroorganismen:

(1) L. bavaricus

(2) L. plantarum

(3) Lcurvatus

(4) Pediococcus cerevisiae

(5) Leuconostoc mesenteroides

(6) L brevis

Die Werte von F i g. 3 wurden in entsprechender Weise wie die Werte von F i g. 2 erhalten.

Es ist offensichtlich, daß Lbavaricus in Bereichen unter 10° C wesentlich besser als andere L(+)-Milchsäurebildner und zumindest ebenso gut wie die anderen Arten der Spontanflora wächst. Bei einer Animpfung des Gemüses mit einem 10- bis lOOfachen Überschuß an Lbavaricus gegenüber der Spontanflora kommt es daher mit Sicherheit zu einer mehr oder weniger vollständigen Verdrängung der letzteren und daher zum starken Dominieren der L(+)-Milchsäure, was bei Verwendung anderer L(+)-Milchsäure bildenden Stämme nicht der Fall wäre.

So wurde z. B. bei einer entsprechenden Animpfung von geschnittenem Kohl, Blumenkohl, Karotten, Zwiebeln und anderen Gemüsen (etwa 10 Liter Stammkultur mit 10⁸ bis 10⁹ Keimen pro ml auf 1000 kg Gemüse) und sonstiger üblicher Behandlung (z. B. Zusatz von Kochsalz) festgestellt, daß L bavaricus bei Temperaturen von 3 bis 30⁰C eine fast reine L(+)-Milchsäuregärung bewirkt und die auf den Gemüsen normalerweise zur Entwicklung kommende Milchsäureflora, die zu DL-Milchsäure führt, verdrängt

Das Endprodukt enthält 0,3—1,2% Milchsäure, die zu mehr als 75% aus L( + )-Milchsäure besteht Darüber hinaus werden die häufigen Fehler, wie Schleimbildung (bedingt durch die Bildung von Dextran und Lävan in saccharosehaltigen Lösungen), Erweichen des Gemüses, Verfärbung oder Fehlgeschmack verhindert, da die dafür verantwortlichen Infektionskeime dank der raschen Säuerung durch Lbavaricus ebenfalls unterdrückt werden. Das Produkt zeichnet sich daher auch durch seine Regelmäßigkeit in Geschmack und Aussehen gegenüber den bisherigen Produkten aus. Da Lbavaricus zu den homofermentativen Bakterien gehört, werden nur Spuren von flüchtigen Säuren, wie Essigsäure oder Ameisensäure, und von Alkohol gebildet Im Falle von Sauerkraut macht sich dies durch einen milden Geschmack (kein Essigstich) bemerkbar, und es entstehen auch beim Kochen sehr viel weniger der vielfach als lästig empfundenen flüchtigen Aromastoffe (Ester; unangenehmer Sauerkohlgeruch).

Ein weiterer überraschender Effekt des L bavaricus besteht darin, daß er trotz einer nur mittleren Endsäuerung bis auf einen pH-Wert von etwa 3,7 bis 4,0 das Aufkommen von normalerweise stärker säuernder Spontanflora hemmt Es wäre zu erwarten gewesen, daß diese Spontanflora nach dem Aufhören des Wachstums von L bavaricus weiterwächst, bis der für diese Flora charakteristische niedrige End-pH-Wert erreicht ist Dies ist aber nicht der FaIL Der Grund für dieses Verhalten ist noch nicht bekannt; man nimmt an, daß L bavaricus dem Medium in größerem Umfang bestimmte Nährstoffe entzieht, welche die Spontanflora für ihr normales Wachstum bei niedrigeren pH-Werten benötigt

Das gute Wachstum des L bavaricus bei niedrigen Temperaturen ist insbesondere bei der Herstellung von Sauergemüse, insbesondere von Sauerkraut, vorteilhaft, da das Gemüse, wie schon gesagt, in der Regel in der kalten Jahreszeit verarbeitet wird und eine vorherige Sterilisierung zur Unschädlichmachung der Spontanflora praktisch nicht möglich ist Die Tieftemperaturaktivität von L bavaricus kann aber auch vorteilhaft bei der Verzögerung von Gemüse- und Fruchtmaischen und -saften ausgenützt werden, da bei einer Vergärung dieser Produkte bei niedrigen Temperaturen die temperaturempfindlichen Bestandteile, wie Vitamine,

·> Aromastoffe und Farbstoffe, geschont werden. Es ist auch nicht unbedingt notwendig, die Vergärung unter Ausschluß von Luftsauerstoff durchzuführen.

Eine weitere überraschende Eigenschaft des L bavaricus besteht darin, daß er auch bei verhältnismäßig

ι <> hohen Salzkonzentrationen, z. B. bei einer Kochsalzkonzentration von 5%, im Gegensatz zu anderen L-Laktatbildnern noch gut wächst, was insbesondere für die Vergärungen in Salzlake, z. B. von Salzgurken, wichtig ist.

F i g. 4 zeigt das Wachstum von L(+)-laktatbildenden Milchsäurebakterien in Gegenwart von Kochsalz bei einer Temperatur von 16° C in MRS-Bouillon nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden. Die Wachstumskurven, die wie in den F i g. 2 und 3 bestimmt wurden, beziehen

2u sich auf folgende Mikroorganismen:

(1) Lbavaricus

(2) L casei ssp. alactosus

(3) L casei ssp. tolerans

(4) L casei ssp. rhamnosus

(5) L casei ssp. casei

(6) L casei ssp. xylosus

(7) Sc.lactisl44

L bavaricus gehört in die Gruppe L sake. Diese Gruppe erzeugt normalerweise Racemase, wodurch DL-Milchsäure erhalten wird. Es war überraschend, daß in dieser Gruppe in einer Kochsalzlösung bei niedriger Temperatur eine racemaselose Form auftritt

L bavaricus ist in reproduzierbarer Weise dadurch erhältlich, daß man als Selektionsschritte einmal die Bebrütung bei tiefen Temperaturen auf einem Agar-Nährboden, der eine Kohlenhydratquelle enthält, durchführt und die Kolonien mit einem schleimigen Aussehen eliminiert, die hinterbleibenden Kolonien dann auf einem kochsalzhaltigen Nährboden weiterzüchtet, um diejenigen Kolonien zu eliminieren, die auf diesem Nährboden nicht wachsen, wobei diese beiden Selektionsschritte auch zusammen auf dem kohlenhydrathaltigen Nährboden, dem Kochsalz in einer Menge von 5% zugesetzt worden ist, durchgeführt werden können, dann diejenigen Kolonien eliminiert die ein schleimiges Aussehen haben und die keine stäbchenförmigen unbeweglichen und grampositiven Bakterien

so enthalten, hierauf die Kolonien mit den gasbildenden Keimen und die D(—)- oder DL-Milchsäure bildenden Kolonien eliminiert und dann die verbleibenden, L( + )-Milchsäure bildenden Kolonien in der üblichen Weise weiterzüchtet

Vorzugsweise geht man von milchsaurer vorgorenem Pflanzenmaterial, insbesondere von Sauerkraut, aus. Obwohl Sauerkraut ein bakteriologisch besonders gut untersuchtes Material darstellt, enthält die Literatur keine Hinweise auf die Isolierung des dem L bavaricus vergleichbaren Mikroorganismus, was vermutlich darauf zurückzuführen ist, daß L bavaricus unter den bei den üblichen Isolierverfahren angewendeten Bedingungen gegenüber der anderen Bakterienflora nicht in Erscheinung tritt und erst unter den vorstehend angegebenen Selektionierungsbedingungen isoliert und vermehrt werden kann.

Die Bebrütung bei den tiefen Temperaturen, z. B. bei etwa 5 bis 10⁰C, wird gern als erster Schritt

durchgeführt. Die Bebrütung erfolgt zweckmäßig auf einem Agarnährboden, der als Kohlenhydratquelle vorzugsweise Saccharose enthält. Der Saccharosezusatz ist insofern günstig, als gewisse Lactobacillen mit Saccharose Dextran bzw. Lävan bilden, was sich in einem schleimigen Aussehen der Kolonien äußert. Diese unerwünschten Kolonien können also schon aufgrund ihrer Aussehens eliminiert werden.

Die hinterbleibenden Kolonien werden dann gewöhnlich auf einem kochsalzhaltigen Nährboden weitergezüchtet, um diejenigen Kolonien zu eliminieren, die auf diesem Nährboden nicht wachsen. Zweckmäßig werden aber die beiden ersten Selektionsschritte miteinander kombiniert, d.h. man setzt dem saccharosehaltigen Agarnährboden bereits Kochsalz zu, vorzugsweise in einer Menge von etwa 5%.

Von den nach diesen beiden Selektionsschritten hinterbleibenden Kolonien werden dann diejenigen eliminiert, die ein schleimiges Aussehen haben und die keine stäbchenförmigen unbeweglichen und gram-positiven Bakterien enthalten. Diese Eliminierungsschritte können durch einfache bzw. mikroskopische Betrachtung der Kulturen vorgenommen werden.

Die Kolonien mit den gasbildenden Keimen können im Prinzip ebenfalls bereits auf dem Agarnährboden erkannt werden. Die Erkennung ist aber einfacher, wenn die Kulturen in sterilen Gemüsesaft, insbesondere Sauerkrautsaft, übertragen werden. Die Bebrütung kann nun bei normalen Temperaturen, beispielsweise bei etwa 15 bis 35° C vorgenommen werden, weil bei diesen Temperaturen das Wachstum schneller ist und die Gasbildung rascher festgestellt werden kann.

Auch die Eliminierung der D( —)- oder DL-Milchsäure bildenden Kolonien erfolgt zweckmäßig in der Saftkultur bei den angegebenen Bedingungen, da die enzymatischen Bestimmungen bei Verwendung der abfiltrierten Saftlösung einfacher durchzuführen sind als bei Verwendung des Agarnährbodens.

Es bleiben dann die L( + )-Milchsäure bildenden Kolonien zurück, die nur aus L bavaricus bestehen, der dann in der üblichen Weise weitergezüchtet wird. Zur Sicherheit können dann gegebenenfalls noch die in Tabelle 1 angegebenen Parameter bestimmt werden.

Das Gewinnungsverfahren ist durch die nachstehenden Beispiele 1 bis 5 erläutert

Beispiel 1

5 in München aus dem Handel gezogene Proben von rohem Sauerkraut wurden in üblicher Weise verdünnt und jeweils 10~⁷ ml wurden auf 10 Parallelplatten mit Agarnährboden (modifiziertes MRS-Medium, bei dem die Glucose durch Saccharose ersetzt wurde, mit Zusatz von 5% Kochsalz ausgespatelt Im einzelnen hatte der Nährboden folgende Zusammensetzung:

Pepton aus Casein, tryptisch verdaut	10 g
Fleischextrakt	2g
Hefeextrakt	4g
Saccharose	20 g
Polyäthylensorbitanmonooleat	ImI
Kochsalz	50 g
K2HPO4	2g
Natriumacetat χ 3 H2O	5g
Diammoniumcitrat	2g
MgSO4 x 7 H2O	200 g
MnSO4 χ H2O	50 mg
Agar	15 g
Destilliertes Wasser	1 Liter

Nach 8tägiger Bebrütung unter N₂+ 5% CO₂ bei einer Temperatur von 6° C wurden die Einzelkolonien mikroskopisch untersucht. 356 Kolonien, die nicht schleimig waren und stäbchenförmige, grampositive

ι Bakterien enthielten, wurden mit der öse in Röhrchen mit sterilem Krautsaft eingeimpft, und die Röhrchen wurden 3 Tage bei 15° C bebrütet. Von den kein Gas bildenden Kolonien in den bewachsenen Röhrchen wurde die Konfiguration der Milchsäure des Krautsaftes enzymatisch bestimmt. Nur eine der 356 Kulturen hatte ausschließlich L( + )-Milchsäure gebildet und ergab bei der genaueren Untersuchung die in Tabelle 1 für L. bavaricus angegebenen Merkmale. Alle anderen Kolonien hatten D(-)- oder DL-Milchsäure gebildet.

is Zum Nachweis der Reproduzierbarkeit des Gewinnungsverfahrens wurden 4 Sauerkrautproben aus Schleswig-Holstein verwendet, die in der gleichen Weise wie vorstehend angegeben, selektioniert wurden. Von den 212 geprüften Kolonien der vier verschiedenen Sauerkrautproben zeigte nur eine Kolonie die für L. bavaricus in Tabelle I angegebenen Eigenschaften.

Beispiel 2 Vier Jahre nach dem Kauf der Sauerkrautproben von

Beispiel 1 wurde von derselben Quelle in München rohes Sauerkraut bezogen und als Ausgangsmaterial für die Isolierung verwendet. Nach entsprechender Verdünnung wurden jeweils 10-⁷ml (bezogen auf die unverdünnte Ausgangslösung) auf 10 Parallelplatten mit Agarnährboden der 5% Kochsalz enthielt und bei dem die Glucose durch Saccharose ersetzt wurde, ausgespatelt (Nährbodenzusammensetzung wie im Beispiel 1). Nach 8tägiger Bebrütung unter N₂ und 5% CO₂ bei einer Temperatur von 8° C wurden die nicht-schleimigen Einzelkolonien mikroskopisch untersucht 210 Kolonien enthielten Gram-positive, stäbchenförmige Bakterien. Sie wurden mit der öse in Röhrchen mit sterilem Krautsaft eingeimpft und 3 Tage bei 15° bebrütet. Von den Isolaten, die kein Gas bildeten, wurden die Konfiguration der Milchsäure enzymatisch bestimmt Nur zwei der 210 Isolate bildeten ausschließlich L(+)-Milchsäure, während alle anderen D(-)- oder DL-Milchsäure gebildet hatten. Von diesen Isolaten wurden die in den Tabellen II und III angegebenen Merkmale bestimmt Das Ergebnis zeigt, daß es sich um Stämme der Art L. bavaricus handelt da alle wesentlichen Merkmale der Tabelle II mii dem Typstamm übereinstimmen.

Beispiel 3

Vier Jahre nach Durchführung der Isolierungen von Beispiel 1 wurde aus einem Reformhaus in Göttingen rohes Sauerkraut bezogen, aus dem in gleicher Weise wie in Beispiel 1 angeführt, L(+)-Milchsäurebildner isoliert wurden. Von insgesamt 71 nicht-schleimbildenden, Gram-positiven Stäbchen erwies sich ein Isolat als L(+)-Bildner und stimmt in allen wesentlichen Merkmalen (Tabelle II) mit L bavaricus überein.

Beispiel 4

Vier Jahre nach Durchführung der Isolierung von Beispiel 1 wurde vom Markt in Landau/Pfalz eine rohe Sauerkrautprobe bezogen und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 zur Isolierung von L(+)-Bildnern benützt Von 230 nicht-schleimbildenden, Gram-positiven, stäbchenförmigen Keimen erwiesen sich 3 als L(+)-Bildner und stimmten in allen wesentlichen Merkmalen (Tabelle II) mit L. bavaricus überein.

Beispiel 5

Vier Jahre nach Durchführung der Isolierungen von Beispiel 1 wurde von einer Metzgerei in Heidelberg eine Sauerkrautprobe bezogen und in gleicher Weise wie in

Beispiel 1 zur Isolierung von L( + )-Bildnern herangezogen. Von 50 nicht-schleimbildenden, Gram-positiven, stäbchenförmigen Keimen erwies sich ein Isolat als L( + )-Bildner und stimmte in alien wesentlichen Merkmalen (Tabelle II) mit L. bavaricus überein.

Tabelle II

die Zuordnung

Herkunft

Ent

es. Keim Platten

zu L. bavaricus wesentlichen Merkmale der

Beispiel

nach den

Beispielen 2 bis 5

3SBl

."2 ^

Wachstum

# υ

Übersieht i

selektionierten L( + )-Milchsäurebildner.

nahme

Die nach

1 isolierten beiden Stämme sind ebenfalls aufgeführt

S-Racen

bei

ü

Probe

Jahr

5

Lys-Asp

45° 5°

41 ±1 - +

über die für

nach

—

Lys-Asp

41 ± 1 - +

Beispiel

V

co ti

+ i> ν Ui

—

München

1973

290

•ic ||

1Jg tlis ft, >° Ji *- c D

Lys-Asp

41 + 1 - +

Schleswig

1973

92

1

u, Io Jj ω α> J)

—

Lys-Asp

41 ±1 - +

1

Holstein

250

356

1

+ 1,6

—

Lys-Asp

41 ±1 — -t-

1

München

1977

212

+ 1,6

—

Göttingen

1977

120

2

Lys-Asp

41 ±1 - +

2

Landau/

1977

210

1

+ 1,6

—

3

Pfalz

71

3

+ 1,6

4

Heidel

1977

230

+ 1,6

berg

1

5

50

+ 1,6

·) Gram-positive, stäbachenförmige Keime, die keinen Schleim auf saccharosehaltigem Nährboden bilden.

Tabelle III

Übersicht über die Kohlenhydratvergärung der nach den Beispielen 1 bis 5 isolierten Stämme von L bavaricus

Beispiel Herkunft

Stammbezeichnung

Vergärung von verschiedenen Kohlehydraten

« _υ _ ä ö .2

° ι I c ι =

£ s S 2 £ s

■S S

⁸ 1

crt .*£

1I|

P 3 δ

München 73
Schleswig
Holstein 73
München 77

Göttingen
Landau/Pflaz

Heidelberg

DSM 20 269
18/73

3/77

4/77

7/77

14/77

17/77

21/77

30/77

ι

L. bavaricus wird zur milchsauren Vergärung von pflanzlichem Material, insbesondere von Gemüse, Früchten und daraus gewonnen Maischen und Säften verwendet Wie bereits vorstehend erwähnt, werden bestimmte Gemüsesorten, insbesondere Kraut, rote Beete usw., in der kalten Jahreszeit geerntet, und es ist bei der Vergärung im großtechnischen Maßstab unwirtschaftlich, das zu vergärende Material soweit zu erwärmen, daß ein ausreichendes Wachstum der bekannten, L(+)-Milchsäure bildenden Reinkulturen von Mikroorganismen gewährleistet ist Ferner wäre ohne eine vorherige Hitzesterilisierung ein Überwachsen der L(-f )-Milchsäurebildner durch die Spontanflora nicht auszuschließea Durch die Verwendung von L. bavaricus kann die Vergärung nun bei tiefen Tempera-

bo türen, vorzugsweise bei etwa 2 bis 12° C durchgeführt werden, wobei die Spontanflora, die D(—)- bzw. DL-Milchsäure erzeugt zurückgedrängt wird. Dadurch wird auch das Wachstum von schleimbildenden Lactobacillen sowie von Fäulnisbakterien unterdrückt

wodurch die Qualität der Produkte verbessert wird.

Die Anwendung ist durch die nachstehenden Beispiele erläutert:

AnwenduDgsbeispiel 1 Herstellung von Sauerkraut

a) Stammhaltung:

Für die Versuche wurde der nach Beispiel 1 gewonnene L bavaricus-Stamm verwendet
Der Stamm kann als Agarstichkultur 1 Monat bei 4°C aufbewahrt werden, dann muß er wieder in ic neues Medium überimpft werden. Als Medium kann halbsynthetischer M RS-Agar oder besser steriler Weißkohlsaft, der mit 1,5% Agar verfestigt ist, verwendet werden. Vor dem Beimpfen des Kohls wird die Kultur zur Aktivierung an drei aufeinanderfolgenden Tagen jeweils in 10 ml sterilen Weißkohlsaft geimpft Die Bebrütung erfolgt bei 30° C Anschließend werden 3 Liter steriler Weißkohlsaft mit IO ml der letzten (= aktivsten) Kultur beimpft Nach 15 Stunden Bebrütung (30° C) wird damit die Vorkultur beimpft

b) Vorkultur:

300 Liter Weißkohlsaft (am einfachsten Ablaufsaft) ₂s werden in einem heiz- und kühlbaren Gefäß mit Rührer 20 Minuten auf 95° C erhitzt, dann wird auf 32° C abgekühlt Anschließend wird mit 3 Liter der unter (a) angegebenen Kultur beimpft und zur Verteilung der Bakterien kurz das Rührwerk eingeschaltet Nach 12 bis 14 Stunden ist die Vorkultur zum Beimpfen der Kohlschnitzel geeignet Der pH-Wert ist dann von 6 auf 4 abgefallen, unü das mikroskopische Bild der Vorkultur zeigt Massen (ungefähr 1-5 χ 10⁹ZmI) von Kurzstäbchen, einzeln und in kurzen Ketten.

c) Herstellung des Sauerkrauts:

30 000 kg Weißkohl werden gründlich geputzt und die Strünke werden ausgebohrt Es wird mit 300 Liter Vorkultur (l%ig) beimpft. Die Beimpfung der Kohlschnitzel erfolgt am günstigsten an der Schneidemaschine, wobei die Vorkulturlösung über

eine Dosierpumpe auf das Messer tropft (ca. 50 Liter/Std, je nach Einschneidegeschwindigkeit). Somit ergibt sich zwangsweise eine sehr gleichmäßige Beimpfung des Kohls. Die beimpften Kohlschnitzel werden in üblicher Weise gesalzen, beispielsweise mit 0,7% Kochsalz, und im vorher gründlich gereinigten Gärbassin eingestampft Am Ende der Füllung wird das Gärbassin in üblicher Weise mit einer mit Wasser gefüllten Kunststoffblase als Beschwerung abgedeckt Bei einer Kohltemperatur von 2 bis 3° C beim Einschneiden ergibt sich eine Gärdauer von etwa 28 Tagen, bei 5 bis 6° C eine solche von etwa 20 Tagen. Der pH-Wert sinkt in dieser Zeit von 6,2 auf 3,9 ab. Die gebildete Milchsäure hat eine Konzentration von ungefähr 1,1% (Gewicht/Volumen) und liegt zu mehr als 90% in der L(+)-Fonn vor.

Anwendungsbeispiel 2
Herstellung von Salzgurken

Die Stammhaltung und die Herstellung der Vorkultur erfolgen grundsätzlich wie bei der Sauerkrautherstellung, jedoch kann der Weißkohlsaft durch Gurkensaft (Abpressen von billigen großen Gurken Handelsqualität »E«) ersetzt werden.

350 kg Gurken (Handelsqualität »B«) werden gründlich gewaschen. Danach werden die Gurken in üblicher Weise gestichelt und in ein vorher 30 Minuten mit strömenden Dampf entkeimtes Faß (650 Liter) eingefüllt, wobei auch die entsprechenden Gewürze, wie Dill, Estragon, Senfkörner, Basilikum, Knoblauch usw. in der üblichen Menge zugegeben werden. Anschließend wird das Faß mit ungefähr 300 Liter Salzlake aufgefüllt der vorher 30 Liter Vorkulturlösung zugegeben worden waren. Das Faß wird dann verschlossen und wie üblich, beispielsweise unter freiem Himmel, vergoren. Die Gärzeit beträgt bei einer mittleren Temperatur der Lake von 10 bis 12° C etwa 20 Tage. Nach dieser Zeit liegt der pH-Wert bei 3,8, der Milchsäuregehalt beträgt etwa 0,7%. Die Milchsäure liegt zu über 90% als L( + )-lsomer vor. Anschließend werden die Salzgurken in Gläser abgefüllt und pasteurisiert

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Mikroorganismen der Art Lactobacillus bavaricus erhältlich dadurch, daß man als Selektionsschritte einmal.die Bebrütung bei tiefen Temperaturen auf einem Agar-Nährboden, der eine Kohlenhydratquel-Ie enthält, durchführt und die Kolonien mit einem schleimigen Aussehen eliminiert, die hinterbleibenden Kolonien dann auf einem kochsaizhaltigen Nährboden weiterzüchtet, um diejenigen Kolonien zu eliminieren, die auf diesem Nährboden nicht wachsen, wobei diese beiden Selektionsschritte auch zusammen auf dem kohlenhydrathaltigen Nährboden, dem Kochsalz in einer Menge von 5% zugesetzt worden ist, durchgeführt werden können, dann diejenigen Kolonien eliminiert, die ein schleimiges Ausseilen haben und die keine stäbchenförmigen unbeweglichen und grampositiven Bakterien enthalten, hierauf die Koionien mit den gasbildenden Keimen und die D(—)- oder DL-Milchsäure bildenden Kolonien eliminiert und dann die verbleibenden L(+)-Milchsäure bildenden Kolonien in der üblichen Weise weiterzüchtet