DE60305156T2

DE60305156T2 - Starter für die fermentation von pflanzenmaterial

Info

Publication number: DE60305156T2
Application number: DE60305156T
Authority: DE
Inventors: Tiina Joutsjoki; Marja Tamminen; Maarit MÄKI; Britta Viander; Eeva-Liisa RYHÄNEN
Original assignee: ARKTINEN BIO LACTO Oy; ARKTINEN BIO-LACTO Oy; MAA JA ELINTARVIKETALOUDEN TUT; MAA- JA ELINTARVIKETALOUDEN TUTKIMUSKESKUS; SAVIMAEKI Oy; Savimaki Oy; Bioferme Oy
Current assignee: Maa- Ja Elintarviketalouden Tutkimuskeskus Jo Fi; Bioferme Oy
Priority date: 2002-01-30
Filing date: 2003-01-30
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2023-01-31
Also published as: PL371522A1; WO2003063612A1; FI116191B; EP1478245A1; PL206766B1; ATE325548T1; EP1478245B1; DE60305156D1; FI20020174A; FI20020174A0

Description

Die vorliegende Erfindung stellt einen Starter (Starterstammgemisch) für die Fermentation von Gemüse, Futter oder von anderem von Pflanzen stammendem Material bereit, wobei der Starter Milchsäurebakterienstämme umfasst, die auf ähnliche Weise wie die natürliche spontane Milchsäuregärung wirken. Mittels des Startergemisches ist es möglich, fermentiertes Gemüse mit gutem Geschmack und guter und einheitlicher Qualität in einer kontrollierten Weise herzustellen. Die Erfindung stellt auch einen Milchsäurebakterienstamm bereit, der aus Pflanzenmaterial isoliert wurde und vermutlich probiotische Merkmale besitzt.
Die kommerziellen Gemüsefermentationen werden im Allgemeinen immer noch mittels der natürlichen mikrobiellen Flora der zu fermentierenden Pflanzen durchgeführt. Dies erhöht die Produktionskosten wesentlich, da der Erfolg der Fermentation zufällig sein kann und die Verarbeitungszeit gewöhnlich lange ist und von der Ausgangsflora und dem Fortschreiten der mikrobiellen Abfolge abhängt. Milchsäurebakterien wurden aus natürlich fermentiertem Gemüse isoliert und charakterisiert (Valdez et al., 1991), und daher war seit langem bekannt, welche Bakterien in fermentierten Pflanzenmaterialien vorliegen. Diese Bakterien wurden untersucht und es wurden Anstrengungen unternommen, geeignete Starterstammgemische herauszufinden (Purtsi et al., 1999; Gardner et al., 2001) und die gemeinsamen Mengen der Stämme zu optimieren, die in derartigen Gemischen enthalten sind (Savard et al., 2000). Jedoch stehen sehr wenig kommerzielle Starter-Bakterienstämme für die Fermentation von Gemüse zur Verfügung und überhaupt keine finnischen Stämme. Außerdem ist die Verwendung kommerzieller Starter aufgrund des Mangels an grundlegenden Informationen über die Mikrobiologie derartiger Fermentationen in einheimischem Gemüsematerial eingeschränkt.
Die Konservierung von Gemüse durch Fermentation, wobei Milchsäurebakterien ausgenutzt werden, ist ein altes Verfahren. Die Verbraucher können diese Produkte als natürlich und gesund ansehen. Der Vitamin- und Mineralgehalt der fermentierten Gemüse hängt von dem entsprechenden Gehalt des Ausgangsmaterials ab. Während der Fermentation werden die Kohlenhydrate abgebaut und die Proteine werden durch die Wirkung von organischen Säuren verdaut, wobei die Verdaubarkeit der Produkte verbessert wird. Organische Säuren können auch die Absorption von Mineralien, insbesondere Eisen, fördern (Eriksson, 1991). Die Menge der verschiedenen Vitamine mit Ausnahme von Thiamin, Riboflavin, Niacin, Folsäure und Vitamin B₁₂ sowie Vitamin K (McFeeters, 1993) wird während der Fermentation verringert. Salz fördert den Fermentationsprozess und hält die Textur des Sauerkrauts stabil (Sillanpää, 1984). Jedoch ist eine Salzmenge im Überfluss für die Gesundheit schädlich. Man fand in Studien heraus, die unter Verwendung von Krebszellen (in vitro) und Labortieren durchgeführt wurden, dass Glucosinolate und ihre Abbauprodukte, die in Kohlpflanzen vorhanden sind, antikanzerogene Effekte haben. Die Abbauprodukte der Glucosinolate haben das Wachstum einiger Bakterien und Hefen verhindert (Ryhänen et al., 2001).
Die gesundheitsfördernde Aktivität fermentierter Produkte ist offensichtlich primär mit der Darmfunktion verknüpft. Die ausgleichende Wirkung probiotischer Milchsäurebakterien auf z.B. die gestörte mikrobielle Darmflora ist gut bekannt (Gorbach, 1990), und man nimmt an, dass die Probiotika das Serumcholesterin senken, die Immunantwort verbessern und Allergien lindern. Außerdem reduzieren die Milchsäurebakterien die Aktivität derartiger Enzyme, die krebsproduzierende Verbindungen aktivieren (Sanders 1998, Ziemer and Gibson 1998).
Nach den neuen Ernährungsempfehlungen sollte die Verwendung von Gemüse in der täglichen Ernährung erhöht werden. Man glaubt, dass verschiedene Verbindungen (einschließlich Ballaststoffe, Antioxidantien und Flavonoide), die in Pflanzen enthalten sind, wichtig für die Gesundheit sind. Obwohl Probiotika in Milchprodukten reichlich verwendet werden und der klinische Beweis ihrer Auswirkungen auf die Gesundheit existiert, wurden mit Gemüse, das mittels probiotischer Bakterien hergestellt wurde, keine klinischen Tests durchgeführt, die denjenigen mit probiotischen Milchprodukten entsprechen. Falls fermentiertes Gemüse mittels Probiotika hergestellt werden könnte, würde es die derzeitige Auswahl an Gemüse abwechslungsreicher gestalten und den Anstieg der Verwendung von Gemüse fördern.
Der für die Fermentation von Pflanzenmaterial entwickelte Starter besitzt Merkmale, die die Fermentation ermöglichen, die der spontanen Milchsäuregärung bei Gemüse ähnelt. Bei der spontanen Milchsäuregärung wird die Fermentation durch Leuconostoc mesenteroides gestartet, dessen Wachstum verhindert wird, wenn die Azidität ansteigt. Die säuretoleranten Lactobacillus plantarum- und Lactobacillus brevis-Stämme überleben. Die Fermentation tritt in flüssiger Phase auf, in die die von dem Bakterium zum Wachstum benötigten Nährstoffe gelöst werden. Flüssigkeit und Nährstoffe können von den Pflanzenzellen mittels osmotischen Drucks, d.h. durch Zugabe von Salz, freigesetzt werden. Das Salz fungiert ebenfalls als Konservierungsmittel, indem Milchsäurebakterien begünstigt werden und indem das Wachstum von kontaminierenden Mikroben verhindert wird. Die Fermentation findet unter anaeroben Bedingungen statt, wodurch die Produktion von Milchsäure am effizientesten ist.
Ein Starter für Gemüse sollte unter Anderem folgende Anforderungen erfüllen:

– Produziert schnell Säure von zur Verfügung stehenden Zuckern
– Wächst bei niedrigen Temperaturen
– Hat einen positiven Effekt auf die Textur, das Aroma und den Geschmack des Produkts
– Produziert keinen Schleim
– Wirkt gut mit den anderen Bakterien im Starter zusammen
– Ist biotechnologisch tolerant: toleriert die Verarbeitung z.B. Gefriertrocknen
– Verhindert das Wachstum von nahrungsmittelvergiftenden und kontaminierenden Mikroben

Die heutzutage verwendeten Starter bestehen aus zwei verschiedenen Typen:

– Technische Starter, die eine gute Fermentationsaktivität besitzen, die aber nicht im Darm überleben.
– Probiotische oder therapeutische Bakterien, die eine gute Fermentationsaktivität besitzen und die auch im Darm überleben, wobei sie eine Auswirkung auf die Gesundheit und das Wohlbefinden haben.

Der Starter (Starterstammgemisch) nach der vorliegenden Erfindung, der in der vorliegenden Erfindung als „Ferme-Starterstammgemisch" bezeichnet wird, ist ein Gemisch aus drei Milchsäurebakterienstämmen mit einem synergistischen Effekt auf die Merkmale des herzustellenden Produkts. Die im Starterstammgemisch enthaltenen Stämme sind:

– Pediococcus sp. P45 (DSM 14488)(wahrscheinlich Pediococcus pentosaceus) oder stattdessen Pediococcus sp. 9/PX3 (DSM 14487)(wahrscheinlich Pediococcus dextrinicus): bildet Säure zu Beginn der Fermentation
– Leuconostoc sp. 78 (DSM 14486)(wahrscheinlich Leuconostoc mesenteroides): bildet Aroma und Säure
– Lactobacillus sp. 2* (DSM 14485)(Lactobacillus paraplantarum): bildet Säure und ist offensichtlich ein probiotischer Stamm.

Bei der Charakterisierung der Stämme fand man heraus, dass sie wahrscheinlich zu den vorstehend erwähnten Spezies gehören. Im Folgenden werden hauptsächlich die vorstehend erwähnten wahrscheinlichen Speziesnamen davon verwendet.
Im Prinzip wirkt der Starter auf ähnliche Weise unabhängig von dem zu fermentierenden Pflanzenmaterial und der Züchtungszeit. Die Züchtungstemperatur sollte im Bereich von 18–35°C gehalten werden, da die erfindungsgemäßen Stämme mesophil sind. Für die Fermentation benötigte Nährstoffe sollten ebenfalls zur Verfügung stehen. Dies wird bei der Herstellung von Sauerkraut und fermentierter Gurke durch Zugabe von Salz sichergestellt. Bei der Fermentation von Karottensaft oder anderer Säfte befinden sich die Nährstoffe bereits in der Flüssigkeit.
Der Starter wird dem zu fermentierenden Material entweder als gefriergetrocknetes Pulver oder vorkultiviert in Gemüsesaft zugesetzt. Die Fermentation wird durch den homofermentativen Pediococcus penatosaceus P45 und den heterofermentativen Leuconostoc mesenteroides 78 gestartet. Der Bereich des pH-Optimums von P. pentosaceus ist höher als derjenige von Lc. mesenteroides und Lactobacillus paraplantarum. Daher produziert er Milchsäure effektiver zu Beginn der Fermentation, wenn der pH-Wert fast neutral ist. Das Wachstum von P. pentosaceus wird verhindert, wenn der pH-Wert unter 4 fällt, wobei die Fermentation durch Lc. mesenteroides und L. paraplantarum fortgesetzt wird. Lc. mesenteroides ist ein Aromabildner, der Milchsäure und Essigsäure sowie Kohlendioxid aus den fermentierbaren Substraten bildet. Außerdem produziert er aromatische Verbindungen. Essigsäure ist eine schwächere Säure als Milchsäure, wobei Lc. mesenteroides alleine die effektive Milchsäureproduktion zu Beginn der Fermentation nicht genügend sicherstellen kann. Dies wird mittels P. pentosaceus sichergestellt, der andererseits keine aromatischen Substanzen bildet. Ein homofermentativer säureertragender Stamm L. paraplantarum 2* bleibt am Ende der Fermentation als dominanter Stamm übrig, der ebenfalls effektiv Milchsäure produziert. Dieser Stamm ist zur Fermentation von Pflanzenmaterial geeignet. Andererseits wurde in in vitro-Bedingungen gezeigt, dass er im menschlichen Darm überlebt und an die Darmoberfläche anheften kann, wobei er offensichtlich probiotische Merkmale besitzt.
Es sollte angemerkt werden, dass der Stamm Pediococcus dextrinicus 9/PX3 erfindungsgemäß im Starter anstelle von Pediococcus pentosaceus P45 verwendet werden kann, aber seine Verwendung im Starter ist durch seine schwache kompetitive Kapazität mit anderen Stämmen eingeschränkt.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung eine Kultur, wie in Anspruch 1 beansprucht, und deren Verwendung für die Fermentation von Pflanzenmaterial, d.h. Gemüse, Futter oder anderem von Pflanzen stammendem Material, insbesondere Gurken. Zu den Reinkulturen von Lactobacillus sp. 2* (DSM 14485) können der Bakterienstamm Pediococcus pentosaceus P45 (DSM 14488) und der Stamm Leuconostoc mesenteroides 78 (DSM 14486) hinzugefügt werden, so dass ein Starter gebildet wird, der zur Verwendung für die Fermentation von Pflanzenmaterial angepasst ist.
Genauer gesagt betrifft die Erfindung eine Reinkultur des Stammes Lactobacillus paraplantarum 2* und die Verwendung dieses Stammes in einem Starter, der zur Verwendung für die Fermentation von Pflanzenmaterial angepasst ist. Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren für die Fermentation von Pflanzenmaterial, wobei bei dem Verfahren das zu fermentierende Pflanzenmaterial mit der erfindungsgemäßen Starterstammmischung in Kontakt gebracht wird und das Pflanzenmaterial bei Raumtemperatur etwa 1 bis 14 Tage unter anaeroben oder mikroaerophilen Bedingungen fermentiert wird, bis die gewünschte Säurekonzentration erreicht ist, die von dem Produkt abhängt und von einem pH-Wert von 3,5 bis 4,5 variiert.
Man fand heraus, dass die Verwendung der erfindungsgemäßen Starterstammmischung als Starter die Fermentation beschleunigte, indem die Entwicklung von Milchsäure zu Beginn der Fermentation gefördert wurde. Mittels des Starters wurden Produkte mit guter Qualität erhalten, deren Textur und Geschmack makellos waren. Dies führte zu einer gesicherten Milchsäuregärung und Produkten mit einheitlicher Qualität. Die Produkte besitzen vermutlich auch probiotische Aktivität: die Stresstoleranz und die Anheftung an die Schleimhaut des Stammes Lactobacillus paraplantarum 2* erwiesen sich als gut.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1a und 1b. Ergebnisse des Stresstoleranztests der Bakterienstämme Lactobacillus paraplantarum 2* und Leuconostoc mesenteroides 78: (1a) Toleranz von Gallen- und Bauchspeicheldrüsensaft und (1b) Säuretoleranz.
2a und 2b. Auswirkung des Starterspiegels auf die Erniedrigung des pH-Wertes (2a) und auf die titrierbare Azidität (2b) in Gurkenlake.
3a und 3b. Chemische Analysen der fermentierten Gurken. Der pH-Wert (3a) und die titrierbare Azidität (3b) der Gurkenlake.
4a und 4b. Geschmacksbewertungsprofil von fermentierten Gurken.
Isolierung der erfindungsgemäßen Milchsäurebakterienstämme
1. Lactobacillus paraplantarum 2*:
26 Milchsäurebakterienstämme wurden aus der spontanen Fermentation von fermentierten Gurken in verschiedenen Phasen der Fermentation isoliert. Die Stämme wurden auf der Basis eines DNA-Tests, eines API-Tests (Verwertung von Zuckern) und auf der Basis der Mikroskopie identifiziert. Die meisten der isolierten Stämme waren Lactobacillus plantarum, zusätzlich wurden einige Lactobacillus pentosus- und Lc. mesenteroides-Stämme gefunden. Neben diesen Tests wurde der Stamm bei VTT mittels Ribotypisierung identifiziert, wobei man herausfand, dass es sich wahrscheinlich um Lactobacillus plantarum handelt.
Lactobacillus sp. 2* wurde später als die Spezies Lactobacillus paraplantarum mittels eines speziesspezifischen PCR-Verfahrens identifiziert (Torriani et al., 2001). Die PCR-Reaktion ergibt ein 107 bp-Produkt, wobei Lactobacillus paraplantarum und Lactobacillus pentosus 318 bzw. 218 bp-Produkte ergeben. Der Stamm wurde nach dem Budapester Vertrag bei der Hinterlegungsstelle DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, GmbH) am 31. August 2001 mit der Hinterlegungsnummer DSM 14485 hinterlegt.
2. Leuconostoc mesenteroides 78:
Milchsäurebakterienstämme wurden aus verschiedenen Phasen der spontanen Fermentation von Sauerkraut isoliert. Dieser Stamm wurde mittels eines DNA-Tests, eines API-Tests und Ribotypisierung identifiziert, und man fand heraus, dass es sich wahrscheinlich um Leuconostoc mesenteroides handelt. Der Stamm wurde nach dem Budapester Vertrag bei der Hinterlegungsstelle DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, GmbH) am 31. August 2001 mit der Hinterlegungsnummer DSM 14486 hinterlegt.
3. Pediococcus pentosaceus P45:
Neue Starterstämme wurden aus Gras isoliert, das in Einmachgläsern aufbewahrt und bei 21, 30 und 45°C inkubiert wurde. Nach 1 und 2 Tagen wurden Proben genommen. Genauer gesagt suchten wir unseren eigenen Pediococcus pentosaceus-Stamm, der den Stamm P. pentosaceus DSMZ 20333, der in der klinischen Studie verwendet wurde, ersetzen würde. Neben physiologischen und biochemischen Tests wurde ein API-Test bei der Identifizierung der Stämme durchgeführt. Wir waren bei der Isolierung eines gut für die Gemüsefermentation geeigneten Pediococcus pentosaceus P45-Stammes aus Gras erfolgreich, der bei 45°C inkubiert worden war. Der Stamm wurde nach dem Budapester Vertrag bei der Hinterlegungsstelle DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, GmbH) am 31. August 2001 mit der Hinterlegungsnummer DSM 14488 hinterlegt.
4. Pediococcus dextrinicus 9/PX3
Milchsäurebakterienstämme wurden aus verschiedenen Phasen der spontanen. Fermentation von Sauerkraut isoliert. Der Stamm wurde mittels eines API-Tests, physiologischer und biochemischer Tests und Ribotypisierung identifiziert, und man fand heraus, dass es sich wahrscheinlich um Pediococcus dextrinicus handelt. Der Stamm wurde nach dem Budapester Vertrag bei der Hinterlegungsstelle DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, GmbH) am 31. August 2001 mit der Hinterlegungsnummer DSM 14487 hinterlegt.
Die Ergebnisse des API-Tests für die vorstehend erwähnten Stämme sind in Tabelle 1 dargestellt. RiboPrint-Fingerprints bestätigten die Identifizierung der Stämme. Tabelle 1. Fermentation von Zuckern und Zuckeralkoholen mit den erfindungsgemäßen Stämmen
Charakterisierung der Stämme
Die Eignung der Bakterienstämme als Probiotika wurde in in vitro-Bedingungen an den Universitäten von Helsinki (HY) und Turku (TY) getestet. L. paraplantarum 2* erwies sich als der resistenteste der vier Stämme, die in den Stresstoleranz-Tests getestet wurden. Lc. mesenteroides 78 zeigte ebenfalls sehr gute Resistenz. Die Anheftung der Stämme an den menschlichen Darm wurde an der Universität von Turku getestet. L. paraplantarum 2* zeigte eine deutliche Anheftung, während Leuconostoc sp. 78 nur eine leichte Anheftung zeigte.
Stresstoleranz
Die Toleranz von Milchsäurebakterien gegenüber Bauspeicheldrüsensaft und Gallensalzen wurde im Department of Food Technology der Universität von Helsinki getestet. Die Stämme wurden in MRS-Bouillon gezüchtet, und die Bestimmung erfolgte in doppeltem Ansatz.

– Toleranz gegenüber Gallensalzen: 0,3% Gallensalze (Merck Oxgall) wurden der MRS-Bouillon zugegeben.
– Toleranz gegenüber Bauspeicheldrüsensaft: 1,9% mg/ml Pancreatine, aus Schweine-Bauspeicheldrüse isoliert, wurden der MRS-Bouillon zugegeben.
– Säuretoleranz: Der pH-Wert des MRS-Mediums wurde mit 37 N HCl auf pH 4 und auf pH 2 eingestellt.

Die Ergebnisse der Stresstoleranztests sind in den 1a und 1b angegeben. Sowohl Lc. mesenteroides 78 als auch L. paraplantarum 2* zeigten eine gute Toleranz gegenüber Gallensalzen und Bauchspeicheldrüsensaft. Sie überlebten bei einem pH-Wert von 4, aber bei einem pH-Wert von 2 nahm ihre Anzahl wesentlich ab, obwohl ihr Wachstum nicht vollkommen verhindert wurde.
Adhäsion
Die Adhäsion der Stämme L. paraplantarum 2* und Lc. mesenteroides 78 an menschliche Darmschleimhaut wurde im Department of Biochemistry and Food Chemistry der Universität von Turku getestet.
In vitro-Adhäsion der Stämme Lc. mesenteroides 78, L. paraplantarum 2* und L. rhamnosus GG (Vergleichsstamm) an die Darmschleimhaut.
Züchtungsbedingungen:
Die Bakterien wurden über Nacht in MRS-Bouillon (Merck, Darmstadt, Deutschland) bei 37°C ohne Sauerstoff gezüchtet. Um die Bakterien metabolisch zu markieren, wurden 10 μl Methyl-1,2[³H]Thymidin (6,7 Ci.mMol^–1, Nen-Produkte) pro ml Wachstumsmedium zugegeben. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation (1000 × g) geerntet, mit HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulphonsäure)-Hank-Puffer (HH; 10 mM HEPES; pH 7,4) gewaschen und in HH-Puffer resuspendiert. Die Absorption bei 600 nm wurde auf 0,25 ± 0,01 eingestellt und dann 10-fach in HH-Puffer (etwa 10⁷ KBE/ml) resuspendiert, um die Substratsättigung zu vermeiden (Tuomola und Salminen, 1998).
Die Schleimhaut wurde aus dem gesunden Teil des menschlichen Colons hergestellt, wie früher beschrieben (Ouwehand und Conway, 1996). Kurz gesagt wurde das Colon unmittelbar nach der Resektion auf Eis gesetzt, und es wurde innerhalb von 20 Minuten verwendet. Das Colonstück wurde aufgeschnitten und behutsam in HH-Puffer gewaschen. Der Schleim wurde mit einem Gummispartel herausgekratzt und zweimal zentrifugiert, um Partikelmaterial zu entfernen. Der Schleim wurde bis zur Verwendung bei –70°C aufbewahrt.
Für die Adhäsionsstudie (Ouwehand et al., 1999) wurde der Schleim in Proteinkonzentrationen von 0,5 mgml^–1 verdünnt und passiv auf Mikrotiterplattenvertiefungen durch eine Inkubation über Nacht bei 4°C immobilisiert. Überschüssiger Schleim wurde mit HH-Puffer ausgewaschen und die radioaktiv markierten Bakterien wurden in vier parallelen Vertiefungen zugegeben. Die Bakterien wurden bei 37°C inkubiert, und nach 60 Minuten wurden die Vertiefungen gewaschen, um die nicht angehefteten Bakterien zu entfernen. Die angehefteten Bakterien wurden freigesetzt und durch 60-minütige Inkubation mit 1% SDS in 1M NaOH bei 60°C lysiert. Die Adhäsion wird als Prozentsatz ausgedrückt: Radioaktivität, erhalten aus den Vertiefungen, im Vergleich zur Radioaktivität, die den Vertiefungen zugegeben wurde. Zur Bestimmung wurde Schleim von drei Individuen verwendet, und die Bestimmungen wurden mindestens in dreifacher Ausführung durchgeführt. Tabelle 2. Ergebnisse des Adhäsionstests
Studien zu den Produktmerkmalen, die mit dem erfindungsgemäßen Startergemisch hergestellt wurden, und zur Eignung der Stämme für die Fermentation.
KLINISCHE STUDIE
Die Auswirkungen der Produkte, die mit einem Starterstammgemisch hergestellt wurden, das den erfindungsgemäßen Bakterienstamm Lactobacillus paraplantarum 2* enthält, auf die Gesundheit wurden am Department of Clinical Nutrition der Universität von Kuopio untersucht. Die Nährmerkmale und Auswirkungen des fermentierten Gemüses auf die Gesundheit wurden in der Studie untersucht. Die Studie sollte offenbaren, ob das mit den probiotischen Bakterienstämmen fermentierte Gemüse mehr gesundheitsfördernde Effekte hervorruft als Produkte, die durch herkömmliche Fermentation hergestellt wurden. Es wurden keine entsprechenden klinischen Studien durchgeführt, die die Zugabe von probiotischen Bakterienstämmen zu Gemüse betreffen. Die Ergebnisse werden derzeit verarbeitet.
Die Forschung liefert neue Informationen über die Auswirkungen von fermentiertem Gemüse auf die Gesundheit. Außerdem können die Auswirkungen von mit herkömmlichen Verfahren fermentierten Produkten und denjenigen, die mit probiotischen Bakterienstämmen fermentiert wurden, auf die Gesundheit mit der Kost verglichen werden, die keine derartigen Produkte enthält.
In den klinischen Studien wurden vier Produkte verwendet: Sauerkraut, Sauerkrautsaft, geriebene schwedische Rübe und Karottensaft, die in zwei Phasen hergestellt wurden. Für alle zu testenden Produkte wurde ein entsprechendes Kontrollprodukt hergestellt. Die zu testenden Produkte werden nachstehend als „probiotische" Produkte bezeichnet.
Herstellung der Produkte für die klinische Studie
Züchtung der Starterstämme in Karottensaft
Karottensaft wurde gepresst und in einen Kühllagerraum mit –20°C überführt. Der Saft wurde über Nacht bei Kühlschranktemperatur aufgetaut und 20 min bei 121°C autoklaviert. Der pH-Wert des Saftes betrug 5,42. Das Wachstum der folgenden Stämme in Karottensaft wurde im Test überwacht:
Lc. mesenteroides 78
L. paraplantarum 2*
Leuconostoc 1*
P. pentosaceus DSMZ 20333
Die Stämme wurden über Nacht in MRS-Bouillon bei 30°C einer Passage unterworfen und mit 1% Inokulum in Karottensaft angeimpft. Die Säfte wurden 21 h bei 30°C fermentiert. Der pH-Wert der Säfte wurde gemessen, und die Zellzahl der Milchsäurebakterien wurde aus den Stämmen, die in MRS-Bouillon gezüchtet wurden, und denjenigen, die in Karottensaft gezüchtet wurden, auf MRS-Medium-Bouillon bestimmt (Tabelle 3). Die Säfte wurden in Flaschen abgefüllt. Die Säfte wurden zur Herstellung der geriebenen schwedischen Rübe für die klinische Studie verwendet. Die geriebene schwedische Rübe wurde mit einem Startergemisch, enthaltend L. paraplantarum 2*, Lc. mesenteroides 78 und P. pentosaceus DSMZ 20333, fermentiert. Tabelle 3. Anzahl der Milchsäurebakterien in Karottensaft und in MRS-Bouillon
Anschließend wurde die Aktivität der in Karottensaft-Inokulum gezüchteten Stämme getestet, indem entsprechend 1% eines Inokulums in autoklavierten Karottensaft angeimpft wurde. Die in dieser klinischen Studie verwendeten Stämme wurden für das Experiment ausgewählt (Tabelle 4). Die Stämme wurden 18,5 h bei 30°C gezüchtet. Tabelle 4. Anzahl der Milchsäurebakterien in Karottensaft
Sauerkraut
Das Sauerkraut wurde hergestellt und in 100 g-Portionspackungen in 20% Kohlendioxid-Schutzgas für die erste und zweite Versuchsphase zu verschiedenen Zeiten verpackt. Als Zusatz wurde 1% PVD-Vakuumsalz + E535, Saltunion, Algol, verwendet. Zudem wurde dem probiotischen Sauerkraut 1% in Karottensaft gezüchteter Starter zugegeben. Der Starter war ein Gemisch aus drei Stämmen: L. paraplantarum 2*, Pediococcus pentosaceus DSMZ 20333, Lc. mesenteroides 78.
Sauerkrautsaft
Wurde durch Pressen der vorstehenden Sauerkrautcharge hergestellt. Der Saft wurde in 2 dl-Kartons für die erste Versuchsphase verpackt. Vor dem Verpacken wurde dem Kontrollsauerkraut 27% Karottensaft zugegeben. Dem probiotischen Sauerkrautsaft wurde der L. paraplantarum 2*-Stamm zugegeben, wobei 1,2 Liter als Konzentrat und etwa 6 l als fermentierter Karottensaft zugegeben wurden. Das Konzentrat war durch Zentrifugation des Karottensafts hergestellt worden, der durch ein Inokulum von L. paraplantarum 2* fermentiert wurde. Zusätzlich wurden 2,5 Liter unfermentierter Karottensaft zugegeben. Insgesamt wurden 20% Karottensaft zugegeben. Der probiotische Saft wurde sehr sauer, während der Kontrollsaft milder war.
Der Kontroll-Sauerkrautsaft wurde in 10 l-Plastikkanistern in einem Kühlraum bei +5°C für die zweite Versuchsphase aufbewahrt. Am Boden der Flasche hatte sich ein Präzipitat angesammelt, und es wurde darauf geachtet, dass sich das Präzipitat nicht mit dem Saft vermischte. Einen Tag vor der Verpackung wurde dem Saft 25% frischer Karottensaft zugegeben. Der probiotische Sauerkrautsaft wurde bei –25°C gelagert und 2 Tage in einem Kühlraum aufgetaut. Das Präzipitat, das sich am Boden der Flasche ansammelte, war nicht gänzlich mit dem Saft vermischt. Einen Tag vor dem Verpacken wurde dem Saft 25% frischere Karottensaft zugegeben. Zusätzlich wurde unmittelbar vor dem Verpacken etwa 1 Liter des Stammes L. paraplantarum 2*, der in Karottensaft gezüchtet wurde, als Konzentrat zugegeben. Die Säfte wurden verpackt.
Geriebene schwedische Rübe
Die geriebene schwedische Rübe wurde für beide Versuchsphasen getrennt hergestellt. Das Geriebene wurde in Salzlake fermentiert, indem zu 60 kg Geriebenem 60 Liter gewürzte Salzlake gegeben wurden. Beim Verpacken wurde die Salzlake abgesondert und etwa 5 g davon wurden dem Boden des Beutels zugesetzt. Das Geriebene wurde unter 20% Kohlendioxid-Schutzgas verpackt. Die Rohmaterialien schlossen schwedische Rübe, Karotte und Zwiebel in einem Verhältnis von 4:1:0,1 und die Gewürze Fructose, Anis, Fenchel, Kümmel, Koriander, Schnittlauch, Meersalz ein (die Bouillon enthielt 1% Salz). Das Kontroll-Geriebene wurde hergestellt, indem ein „Wildstamm-Inokulum" oder ein gemischter, aus Sauerkrautsaft hergestellter Starter zugegeben wurden. Das probiotische Geriebene war durch Zugabe von 1% des Gemisches der drei Stämme auf ähnliche Weise zu derjenigen hergestellt worden, die bei der Herstellung von Sauerkraut verwendet wurde. Die Rohmaterialien waren schwedische Rübe, Karotte und Zwiebel + Lauch in einem Verhältnis von 1:1:0,2 und die Gewürze Fructose, Anis, Kräuter der Provence und Meersalz (die Bouillon enthielt 1% Salz).
Karottensaft
Der Karottensaft wurde für beide Versuchsphasen getrennt hergestellt. Die Starter waren dieselben wie bei der Herstellung der geriebenen schwedischen Rübe. Der Stamm L. paraplantarum 2* wurde dem probiotischen Saft als Konzentrat zugegeben. Die Azidität des Karottensaftes wurde durch Zugabe von herkömmlichem Karottensaft eingestellt. Der Saft wurde in 2 dl-Kartons verpackt. Die chemische Analyse der Produkte erfolgte im chemischen Labor von MTT. Die Analysen wurden für beide Testphasen getrennt durchgeführt, da die Produkte unter Verwendung verschiedener Rohmaterialchargen hergestellt worden waren. Die mikrobiologischen Analysen für die Produkte wurden im Laboratory of Food Chemistry und Technology des MTT am Anfang und am Ende der Testphasen hergestellt (Tabellen 5 und 6). Tabelle 5. D- und L-Milchsäurekonzentrationen und Anzahlen der Milchsäurebakterien in Testprodukten.
40 Personen der Testpersonen, die für die klinische Studie angemeldet waren, wurden zu einem Interview eingeladen, wobei 25 für die Studie ausgewählt wurden. 22 Testpersonen blieben vom Anfang bis zum Ende in der Studie. Die Studie dauerte vier Monate. Nach einem 2-wöchigen Grundzeitraum gab es eine 4-wöchige Versuchsphase, eine 4-wöchige Pause und eine 4-wöchige Versuchsphase. Die Proben wurden dreifach entnommen. Die Testpersonen führten 3 Tage lang ein Nahrungsmitteltagebuch und sie beantworteten auch eine Umfrage zu den sportlichen Gewohnheiten.
Die Testprodukte waren geriebene schwedische Rübe und Sauerkraut sowie Karottensaft und Sauerkrautsaft. Die Testpersonen erhielten ihre wöchentlichen Portionen gefroren, und sie nahmen täglich 2 dl Saft und 100 g Geriebenes zu sich. Die Testpersonen durften selbst entscheiden, in welcher Reihenfolge sie die Produkte zu sich nahmen. Tabelle 6. Chemische Zusammensetzung der Produkte
Die Testpersonen bewerteten die Geschmacksmerkmale des Karottensaftes und der geriebenen schwedischen Rübe am Anfang und am Ende der Studie. Eine erste Bewertung erfolgte von einem frischen Produkt und die Letztere von demselben gefrorenen Produkt. Die geriebene schwedische Rübe, die unter Verwendung des Starters hergestellt worden war, deren probiotische Merkmale untersucht wurden, war etwas ansprechender als das Kontroll-Geriebene, obwohl es keinen statistischen Unterschied zwischen ihnen gab. Im letzteren Bewertungszeitraum gab es keine Unterschiede zwischen den Merkmalen. Die allgemeine Akzeptanz des frischen Karottensafts, der mit dem probiotischen Starter hergestellt wurde, war signifikant besser als diejenige des Kontrollsaftes. Im letzteren Bewertungszeitraum gab es keine Unterschiede. Bei beiden Zeiträumen waren die Bewertungen gleich.
Die Testpersonen gaben meistens ein positives Feedback für die Produkte ab. Jedoch war der Sauerkrautsaft, insbesondere in der ersten Phase, sehr sauer und die Testpersonen nahmen ihn verdünnt ein. Beim Verpacken war dem Sauerkrautsaft Karottensaft zugesetzt worden, aber er setzte die Azidität nicht genügend herab. Der Karottensaft der letzten Phase besaß etwas Bitterkeit, aber die Testpersonen beschwerten sich nicht darüber. Der geriebenen schwedischen Rübe zugesetzter Kümmel war für die Testpersonen aus Ostfinnland ein seltsames Gewürz und es wurde als etwas eigenartig befunden.
Die chemische Analyse der Produkte wurde im chemischen Labor von MTT durchgeführt. Die Analysen erfolgten für beide Testphasen getrennt, da die Produkte unter Verwendung verschiedener Rohmaterialchargen hergestellt wurden. Die mikrobiologischen Analysen für die Produkte wurden im Laboratory of Food Chemistry and Technology des MTT am Anfang und am Ende der Testphasen durchgeführt.
Es konnten keine statistischen Unterschiede bei den Cholesterinwerten der Testpersonen gefunden werden, obwohl der Mittelwert ein wenig sank. Die Cholesterinwerte von allen Testpersonen waren gut und es war schwierig, irgendwelche Veränderungen zu finden. Nach den Ergebnissen änderte sich der HDL-Spiegel nicht, während der LDL-Spiegel ein wenig sank. Im kleinen Blutbild konnten keine statistisch signifikanten Veränderungen zwischen den Gruppen gefunden werden, und alle Testpersonen waren gesund. Der β-Carotin-Spiegel erhöhte sich statistisch signifikant in beiden Gruppen und etwas mehr in der probiotischen Gruppe. Bei der bakteriellen Gesamtzellzahl oder Milchsäurebakterien-Gesamtzellzahl gab es keinen Unterscheid zwischen der Kontroll- und der probiotischen Gruppe. Bei jeder Testperson fand man heraus, dass im Mai die bakterielle Gesamtzellzahl abgenommen hatte und die Milchsäurebakterien-Zellzahl zugenommen hatte. Das kann sowohl auf Umweltfaktoren als auch Unterschiede bei den Rohmaterialen der Produkte zurückzuführen sein.
Nach den Ergebnissen nahm die Menge an Kresolen, die Hautkrebs und wahrscheinlich auch Darmkrebs verursachen, sowohl in der Kontroll- als auch in der probiotischen Gruppe ab. Es gab keine Unterscheide zwischen den Gruppen. Am Ende der zweiten Testphase hatte die Menge an Kresolen stark abgenommen. Die Reihenfolge, in der der Test begonnen wurde, hatte keine Auswirkung auf die Kresol-Mengen. Die Menge der Phenole zeigte keine statistischen Unterschiede zwischen den Gruppen, obwohl der Spiegel der probiotischen Gruppe etwas niedriger war. Die Menge der Phenole nahm am Ende der zweiten Testphase auf dieselbe Weise ab wie die Menge der Kresole. Es gab keine Unterschiede bei den β-Glucuronidase-Spiegeln zwischen den Gruppen. In Zukunft wird untersucht, ob die Änderungen der Kresol- und Phenolmengen durch die Spiegel der bakteriellen Zellzahlen erklärt werden könnten. Die Analyse der Ergebnisse geht noch weiter. Die Aufnahme der Produkte während der Testphasen zeigte keine schädlichen Auswirkungen auf die Gesundheit.
Isolierung und Identifizierung der Milchsäurebakterien bei der MTT Food Research in Verbindung mit der klinischen Studie.
Die MRS-Platten, die von den Fäzes-Proben in Kuopio gezüchtet wurden, waren zur MTT Food Research per Post geschickt worden, und die Kolonien wurden von den Schalen isoliert und gereinigt. Insgesamt wurden 110 Proben eingesandt, und von jeder der Proben wurden 3–7 unterschiedliche Kolonien gesammelt. Die gereinigten Stämme beliefen sich auf 334, von denen sich 93 als L. plantarum-Stämme erwiesen. Vor der Testphase konnte nur von einer Probe ein L. plantarum-Stamm isoliert werden. Während der ersten Testphase erhöhte sich die Menge der aus den Fäzes isolierten L. plantarum-Stämme auf 30. Auch während der zweiten Phase blieben die Mengen im Vergleich zum Anfangsspiegel höher. In Zukunft wird untersucht, ob es Unterschiede zwischen den probiotischen und den Kontrollgruppen gibt. Zudem wird untersucht, ob die Stämme als der als Probiotikum zugegebene Stamm L. paraplantarum 2* identifiziert werden können.
TESTS ZUR KONSERVIERUNG VON GURKEN
In der Bioproduction Unit der Universität von Turku waren gefriergetrocknete Starter aus den in der klinischen Studie verwendeten Stämmen L. paraplantarum 2* und Lc. mesenteroides 78 und aus dem im Juni isolierten Stamm P. pentosaceus P45 hergestellt worden. Die Eignung des Gemisches, das diese drei Stämme (Ferme-Starterstammgemisch) enthielt, bei der Herstellung der fermentierten Gurke wurde im Ausgangstest, der im Juni durchgeführt wurde, und in den eigentlichen Tests, die im Juli-August durchgeführt wurden, getestet. Die Tests wurden sowohl im Labor als auch im praktischen Maßstab durchgeführt. Die Gurken für die Tests wurden von MTT/Horticultural Research in Piikkiö erhalten, wo die Varität Crispina für diesen Test gezüchtet worden war.
Die Gurken wurden in Aluminiumbeuteln, Einmachgläsern und Ilves-Gläsern konserviert. Das Ziel war, die Luftzufuhr zu den Behältern während der Konservierung zu vermeiden. Die Fermentation wurde mittels pH-Wert-Messungen und der titrierbaren Azidität überwacht. Mikrobiologische Bestimmungen erfolgten am Anfang und am Ende der Fermentation.
Verfahren
Mikrobiologische Verfahren

Wasser zur Verdünnung: Ringer-Lösung, Stärke 1/4 (Merck), Sterilisierung im Autoklaven 20 min bei 120°C, verteilt auf sterile Teströhrchen à 9 ml.
Coliforme Enterobakterien: VRB-Agar (Biokar Diagnostics BK 086), 0,1% Glucose wurde zugegeben, gegossene Platten, eine Mediumschicht auf die Oberfläche gießen, 2-tägige Inkubation bei 30°C.
Milchsäurebakterien: MRS-Agar (Bacto Lactobacilli MRS-Bouillon, Difco 0881-15-5, 1,5% Agar), ausgestrichene Platten, 3-tägige anaerobe Inkubation bei 30°C.
Hefen und Pilze: YGC-Agar (Difco 1900-17, Bacto-Hefeextrakt-Glucose-Chloramphenicol-Agar), ausgestrichene Platten, 3-tägige Inkubation bei 30°C.

Chemische Verfahren

1. pH-Wert: pH-Meter Orion 720A, Kombinationselektrode Ross 8102SC. Proben mit etwa 5 ml wurden in einem Teströhrchen aufgenommen.
2. Titrierbare Azidität: 10 g Probe wurden in einen Erlenmeyer-Kolben eingewogen, mit 0,1 N NaOH (Titrisol) titriert, Indikator 1% Phenolphtalein in Ethanol (vgl. Valion menetelmäopas, S. 13).
Die Gurken-Salzlaken-Proben wurden gewogen, da die Salzlake immer ein Präzipitat enthielt, das die Pipette verstopfte. 10 ml Salzlake wogen 10 g.
3. Salzkonzentration: Nach dem Buch „Valion menetelmäopas" S. 32 (IDF 12A:1969) wurden 100 ml kochendes destilliertes Wasser zu 5 g Probe gegeben, bei 50–55°C mit 0,1 N Silbernitrat titriert, 5% Kaliumchromat wurden als Indikator zugegeben.

Statistische Verfahren
Die statistischen Unterschiede wurden mit der unidirektionalen Varianzanalyse für jeden Probenentnahmezeitraum getrennt berechnet. Die Mittelwerte für die Behandlungen wurden als Kleinste-Quadrat-Mittelwerte und Abweichungen als Standardabweichung der Mittelwerte (SEM) berechnet. Die Mittelwerte wurden in Paaren durch die Mittelwerte der Unterschiede verglichen. Die statistischen Analysen wurden unter Verwendung des SAS/STAT-Programms, Version 8.1. (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) berechnet. Die statistische Analyse der Geschmacksbewertung wird getrennt beschrieben.
Züchtung der Stämme in Gurken-Salzlake
Das Wachstum der Starter-Stämme in MRS-Bouillon und Gurken-Salzlake wurde verglichen. Die getesteten Stämme waren:

1. L. paraplantarum 2*
2. Lc. mesenteroides 78
3. P. dextrinicus 9/PX3 (Abkürzung P9/PX3)
4. P. pentosaceus DSMZ 20333 (Abkürzung DSMZ)
5. P. pentosaceus P45 (Abkürzung P45)

Der pH-Wert und die titrierbare Azidität der Bouillons wurden untersucht. Tabelle 7. pH-Wert und titrierbare Azidität in MRS-Bouillon und Gurkensalzlake 1 Tag 30°C.
Eigentliche Tests
1. Vergleich mit der Kontrolle und mit einem im Handel erhältlichen Starter
Die Gurken (Varietät Crispina) wurden nacheinander in Aluminiumbeuteln und in 1 l-Einmachgläsern konserviert. Die Eignung der Aluminiumbeutel war in vorausgehenden Tests getestet worden. Auf der Basis der vorausgehenden Tests wurde Pediococcus sp. P45 für das Starterstammgemisch ausgewählt. Das Ferme-Starterstammgemisch wurde mit der Kontrolle und mit dem Starter Bioprofit (Valio Oy) verglichen. Bioprofit besteht aus Lactobacillus rhamnosus und Propionibacterium freudenreichii-Stämmen. Der Starter wird als Schutzkultur in Milchprodukten und als Starter für Gärfutter verwendet.
Salzlake wurde in der Menge des Gurkengewichts zugegeben. Die Salzlake wurde aus Meersalz durch Kochen und Abkühlen auf Raumtemperatur hergestellt. Die Salzkonzentration betrug 3%. Die Ergebnisse wurden statistisch mittels der Unterschiede (F-Tests) verglichen.
Das Ferme-Starterstammgemisch erniedrigte den pH-Wert im Vergleich zur Kontrolle statistisch signifikant effektiver und produzierte Milchsäurebakterien nach 3 Tagen Konservierung im Vergleich zur Kontrolle effektiver (Tabelle 8). Der pH-Wert der Kontrollgurken sank fast auf demselben Spiegel innerhalb von 5 Tagen, und die Milchsäuremengen waren fast dieselben wie in den mit dem Starterstammgemisch konservierten Gurken (Tabelle 9).
Tabelle 8. Absinken des pH-Werts der Gurkensalzlaken während der Konservierung (n = 5 oder n = 6).
Tabelle 9. Titrierbare Azidität der Gurkensalzlaken (Milchsäure mg/ml) während der Konservierung (n = 5 oder n = 6).
2. Vergleichen der Dosierungsspiegel des Starters
Im Test wurde der Effekt der Dosierungsspiegel eines gefriergetrockneten Starters, der aus Ferme-Starterstammgemisch hergestellt wurde, auf die Fermentationsrate verglichen. Der Starter wurde in den Verhältnissen 1:1:1 in drei verschiedenen Spiegeln 10⁵, 10⁶, 10⁷ KBE/ml zugegeben. Die Fermentationsrate wurde mit derjenigen der Kontrolle verglichen, die ohne den Starter hergestellt wurde. Die Salzlake wurde aus Meersalz (3%) durch Kochen in Leitungswasser hergestellt. Das Wasser wurde auf Raumtemperatur abgekühlt. Gurken, die zur Varietät Crispina gehörten, waren am Tag zuvor gepflückt und aus Piikkiö von einem für den Test kultivierten Feld gebracht worden. Die Gurken wurden über Nacht in einem Kühlraum gelagert und mit einer Scheuerbürste gewaschen, sorgfältig gespült und in Aluminiumbeutel eingewogen. Dieselbe Menge Salzlake, mit der der Starter gemischt worden war, wurde den Beuteln zugegeben. Es gab drei Probenentnahmezeiten und 5 parallele Proben wurden für jede Probenentnahmezeit reserviert. Das Gewicht der Gurken variierte von 31 g bis 66 g. Die Proben wurden im Fermentationsraum bei 21°C inkubiert, und die Proben wurden nach 2, 4 und 10 Tagen genommen. Der pH-Wert wurde von jedem der Gurkensäfte getrennt und die titrierbare Azidität von einer vereinigten Probe gemessen. Die statistischen Unterschiede der pH-Wert-Ergebnisse und des Gewichts der Gurken wurden durch Varianzanalyse analysiert und die Unterschiede wurden mittels der Gegensätze untersucht. Es gab keine statistisch signifikanten Unterschiede beim Gewicht der Gurken. Nach der Varianz-Analyse zeigte der pH-Wert der Gurken keine signifikanten Unterschiede nach zwei Tagen, aber mittels Analyse der Gegensätze war es möglich, beim Starterspiegel von 10⁷ KBE/ml den pH-Wert signifikant effektiver (P = 0,0134) im Vergleich zur Kontrolle zu senken. Bei einem Starterspiegel von 10⁵ KBE/ml sank der pH-Wert nach 4 Tagen nicht effizienter im Vergleich zur Kontrolle, während bei den Starterspiegeln von 10⁶ und 10⁷ KBE/ml der Unterschied signifikant war (P = 0,0144 bzw. P = 0,0002). Der Starterspiegel 10⁷ KBE/ml war signifikant effektiver als der von 10⁶ KBE/ml (P = 0,0112). Nach 10 Tagen zeigten der Starter und die Kontrolle keine statistisch signifikanten Unterschiede. Die Ergebnisse sind in den 2a und 2b angegeben.
Nach den Ergebnissen muss die Dosierung des gefriergetrockneten Starters in der Salzlake den Spiegel 10⁷ KBE/ml aufweisen, falls es wünschenswert ist, die Fermentation von Gurken zu Beginn der Konservierung zu beschleunigen.
3. Vergleich eines gefriergetrockneten und eines frischen Starters
In den Experimenten wurden die Fermentationsaktivitäten der gefriergetrockneten und frischen Starter verglichen. Im ersten Experiment, das später einer Geschmacksbewertung unterzogen wurde (siehe nachstehend), wurden die Kontrolle (Salzlake + 1% Gurkensaft), ein 1%-iges Starterstammgemisch 1:1:1 (g) über Nacht in sterilem (autoklavieren bei 120°C, 20 min) Gurkensaft (die Stämme waren getrennt gezüchtet worden) und 10⁷ KBE/ml gefriergetrocknetes 1:1:1 (KBE/g) Starterstammgemisch gezüchtet.
Der gefriergetrocknete Starter war in der Bioproduction Unit der Universität von Turku hergestellt worden. Die Menge des Starters wurde so berechnet, dass die Salzlake ein Inokulum von 10⁷ KBE/ml enthalten würde (Tabelle 10). Der gefriergetrocknete Starter wurde zuerst in 200 ml Wasser verdünnt, und 1800 ml Salzlake wurden dazugegeben. Die Endkonzentration in der Salzlake betrug zahlenmäßig (200 ml × 1,05 × 10⁸ KBE/ml)/2000 ml = 1,05 × 10⁷ KBE/ml. Tabelle 10. Anzahl der Kolonien der Starter und der zur Salzlake zugegebenen Konzentrationen.
Die Gurken (Varietät Crispina) waren von Piikkiö gebracht worden, wurden über Nacht in einem Kühlraum gelagert und am nächsten Tag gewaschen und in Wasser in einem Kühlraum gelagert. Die Salzlake wurde durch Kochen von Meersalz (3%) in Leitungswasser hergestellt. Die Gurken, 5–6 Stück (etwa 400 g), wurden in Aluminiumbeutel eingewogen, wobei dieselbe Menge Salzlake zugegeben wurde. Der Starter war in Salzlake gelöst worden. Die Luft wurde so sorgfältig wie möglich entfernt, und der Beutel wurde mit einem Heißversieglungsgerät verschlossen. Für die Kolonienbestimmung wurde eine Probe der Salzlaken in 100 ml Plastikflaschen entnommen, und sie wurde am nächsten Tag analysiert. Die Gurken wurden im Fermentationsraum 16 Tage bei 21°C inkubiert und in einen Kühlraum bei 5°C gelegt. Der pH-Wert und die titrierbare Azidität wurden nach 6 Tagen gemessen (Tabelle 11). Die Kontrollgurken hatten Gas produziert und die Beutel waren sehr aufgebläht. Die mit dem gefriergetrockneten Starter konservierten Gurken waren ebenfalls aufgebläht, während diejenigen, die mit dem frischen Starter konserviert wurden, nur ein wenig aufgebläht waren. Tabelle 11. Vergleich des frischen und gefriergetrockneten Starters. Konservierungszeit 6 Tage
4. Vergleich des Starters und der Kontrolle in 4 l-Einmachgläsern
Im Experiment wurde die Wirkung des Starters auf eine Kontrolle verglichen, die ohne einen Starter in 4 l-Einmachgläsern (Ilves-Einmachgläser) konserviert wurde. Die Gurken wurden gepflückt und am nächsten Tag nach Jokioinen gebracht. Die Gurken wurden gewaschen und in Wasser in einem Kühlraum bei 5°C gelagert. Für das Experiment wurden Gurken mit einem Gewicht von 75–125 g ausgewählt. Das Experiment wurde in zwei parallelen Einmachgläsern durchgeführt. Die Salzlake (3%) wurde aus Meersalz (Meira) durch Kochen und Abkühlen bei Raumtemperatur (16,6°C) hergestellt. Der Starter wurde der Salzlake als gefriergetrocknetes Pulver zugegeben (Tabelle 12). Die Einmachgläser wurden mit Gurken gefüllt (Mittelwert 1,925 kg) und es wurde so viel Salzlake zugegeben, dass unmittelbar unter dem Zwischenverschluss keine Luft zurückgelassen wurde (Mittelwert 1,647 kg). Die Kolonienzahl der Salzlake wurde am selben Tag auf MRS-Medium bestimmt. Die Gurken wurden 18 Tage bei 21°C in einem Inkubationsraum inkubiert. Proben der Gurkensalzlake wurden mit einer skalierten Pipette, und zwar 50 ml von der Oberfläche und vom Boden, entnommen, und der pH-Wert, die titrierbare Azidität, Milchsäurebakterien, coliforme Enterobakterien sowie Hefen und Pilze von den Gurken wurden bestimmt (Tabelle 13). Tabelle 12. Anzahl der Starterbakterien
Tabelle 13. Azidität und Anzahl der Bakterien in Gurken nach 18-tägiger Inkubation (Mittelwert, n = 2).
Nach den Ergebnissen erhöhte die Zugabe des Starters die Milchsäureproduktion und verhinderte das Wachstum coliformer Enterobakterien sowie von Hefen und Pilzen. Sowohl die Kontroll- als auch die Gurken mit Starter waren hohl, jedoch waren die Gurken mit Starter nicht so abgeflacht und ihr Geschmack war besser. Die auf der MRS-Platte gezüchteten Milchsäurebakterien waren Stäbchen in jeder der Proben (10 Kolonien pro Probe).
Chemische und mikrobiologische Analyse und Geschmacksbewertung der fermentierten Gurken
Bei der Geschmacksbewertung wurden nach dieser Erfindung mit gefriergetrocknetem Starter hergestellte Testgurken (Ferme-Starterstammgemisch: Lc. mesenteroides 78, P. pentosaceus P45 und L. paraplantarum 2*) mit Kontrollgurken desselben Erzeugers und mit Gurken von zwei verschiedenen Erzeugern verglichen, die mit demselben gefriergetrockneten Starter hergestellt wurden. Die Konservierung der Gurken wird vorstehend in Punkt 3 beschrieben. Die Erzeuger wurden angewiesen, jeweils 10 g der Stämme zu 100 ml Salzlake zu geben, d.h. der Starter wurde insgesamt in einer Menge von 30 g zugegeben. Somit wurde der Starterspiegel von 10⁷ KBE/ml erhalten.
Für chemische und mikrobiologische Bestimmungen wurden Proben von der Salzlake entnommen. Die mikrobiologischen Bestimmungen wurden am Tag der Probennahme durchgeführt. Für die chemischen Bestimmungen wurden die Salzlaken bei –20°C eingefroren, entnommen, um in einem Kühlraum bei 5°C aufzutauen, und nach 2 Tagen analysiert.
Die Geschmacksbewertung wurde in dem Labor für Geschmacksbewertung von MTT durchgeführt, und als Geschmacksprüfer wurde die Belegschaft von EKT, insgesamt 23 Personen, rekrutiert. Die Bewertungen wurden während des Vormittags durchgeführt. Es gab 6 Gurken zum Probieren. Die fermentierten Gurken wurden mit Leitungswasser abgespült und mit einer Schneidevorrichtung in Scheiben mit einer Dicke von etwa 2 mm geschnitten. Die Gurken wurden in einer zufälligen Reihenfolge nach ihren Codenummern bewertet. Auf dem Bewertungsformular wurde nach dem Wohlgeschmack der Gurken gefragt, aber es gab keine Aufforderung, die Gurken miteinander zu vergleichen. Die Prüfer zogen eine Linie auf der Skala zu dem Punkt, der am besten ihrem Geschmack entsprach. Die Länge des Linienabschnitts wurde gemessen und als Bewertungsergebnis verwendet, dessen Toleranz bei 0–90 mm lag.
Ergebnisse
1. Mikrobiologische Ergebnisse
Die hygienische Qualität der Gurken war gut (Tabelle 14). Nur eine Probe enthielt Hefen und Pilze. Tabelle 14. Mikrobiologische Ergebnisse der Salzlaken der getesteten Gurken
Mikroskopie der MRS-Platten

Proben 1 und 2: Alle Kolonien sahen ähnlich aus. Von beiden Proben wurden zwei Kolonien mikroskopiert, von denen alle Stäbchen waren.
Probe 3: Alle Kolonien zeigten volle Vielfalt. 11 Kolonien wurden mikroskopiert, von denen 9 Stäbchen waren und 2 davon waren Pediococci.
Probe 4: Alle Kolonien (2 Kolonien/Probe) waren Stäbchen. Die Kolonien sahen ähnlich aus wie diejenigen der Kontroll-Gurken.
Kontrolle: 4 Kolonien der Kontroll-Gurken wurden mikroskopiert, von denen alle Stäbchen waren.

2. Chemische Ergebnisse
Der pH-Wert, die titrierbare Azidität und die Salzkonzentration der Gurken-Salzlake wurden gemessen. Die Salzkonzentration und die titrierbare Azidität waren bei den Gurken von Erzeuger 1 am höchsten und am niedrigsten bei den Gurken von Erzeuger 2. Von den Gurken von Erzeuger 3 besaßen die Gurken, die mit einem Starter hergestellt wurden, einen niedrigeren pH-Wert und eine höhere titrierbare Azidität als die Kontroll-Gurken (3a und 3b). Die Salzbestimmung zeigte, dass das Salz gleichmäßig auf die Gurken verteilt war, und die rechnerische Salzkonzentration war dieselbe wie das Ergebnis der Titration.
3. Geschmacksbewertung
Die Ergebnisse der Geschmacksbewertung sind in den 4a und 4b gesammelt, die die Mittelwerte der abgegebenen Bewertungen zeigen. Das Zielergebnis des Erscheinungsbildes, des Geruches, der Bitterkeit und der allgemeinen Akzeptanz lag bei 90, während hinsichtlich der Textur, der Salzhaltigkeit und des Säuregehalts das Zielergebnis bei der Hälfte des Vorstehenden bei 45 lag.
Die Unterschiede zwischen den Mittelwerten wurden mit dem SAS-Npair1Way-Programm unter Verwendung der unidirektionalen nicht parametrischen Varianzanalyse von Kruskall-Wallis berechnet. Die paarweisen Vergleiche erfolgten unter Verwendung der Varianzanalyse und des Wilcoxon-Zwei-Proben-Tests.
Zusammenfassung der Geschmacksbewertung
Man fand heraus, dass die mit dem Ferme-Starterstammgemisch hergestellten Gurken in den praktischen Produktionsexperimenten von guter Qualität waren. Die Art der Herstellung, des Würzens und der Salzkonzentration hatte eine Auswirkung auf die Bewertung der Gurken. Die Gurken des Erzeugers 2 waren ziemlich lange fermentiert worden und ihre Salzkonzentration war niedrig. Dies kann das übermäßige Erweichen der Textur verursacht haben. Die Gurken des Erzeugers 1 wurden als diejenigen mit den besten Merkmalen bewertet, obwohl die Gurken als ein wenig zu salzig erachtet wurden. Die Gurken des Erzeugers 3 waren nicht gewürzt, was dazu führte, dass die Gurken Bemerkungen im Hinblick auf Geschmack des Nahrungsmittels und Fadheit erhielten. Die fermentierten Gurken des Erzeugers 3 unterschieden sich statistisch nicht von der Kontrolle.
Hinterlegte Mikroorganismen
Die folgenden Mikroorganismen wurden nach dem Budapester Vertrag bei der Hinterlegungsstelle DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland) hinterlegt.
Literatur

Eriksson, C. (1991) Lactic acid bacteria and vegetable, cereal, meat and fish fermentations. J. Chem. Tech. Nat. Biotechn. 51: 553–556.
Gardner, N.J., Savard, T., Obermeier, P., Caldwell, G. und Champagne, C.P. (2001) Selection and characterization of mixed starter cultures for lactic acid fermentation of carrot, cabbage, beet and onion vegetable mixtures. International J. of Food Microbiology 64: 261–275.
Gorbach (1990) Lactic acid bacteria and human health. Ann. Med. 22: 37–41.
McFeeters, R.F. (1993) Nutritional changes in food prosessing: fermentation Tagungsbericht of the XII International Congress of Nutrition, Brighton, GB 1993
Ouwehand, A.C. und Conway, P.L. (1996) Purification and characterization of a component produced by Lactobacillus fermentum that inhibits the adhesion of K88 expressing Escherichia coli to porcine ileal mucus. J. Appl. Bacteriol. 80: 311–318.
Ouwehand, A.C., Kirjavainen, P.V., Grönlund, M.-M., Isolauri, E. und Salminen, S.J. (1999) Adhesion of probiotic micro-organisms to intestinal mucus. International Dairy Journal 9: 623–630.
Purtsi, T., Kilpi, M., Viander, B., Korhonen H. und Ryhänen E.-L. (1999) Fermentation of cucumber: optimizing process technology for design of healthier foods. Functional Foods, (Tagungsbericht) 14.–15.4.1999 Wye College, GB
Ryhänen, E-L., Tolonen, M. und Taipale, M. (2001) Glukosinolaatit ja niiden hajoamistuotteet elintarvikkeissa. In. Kasviperäiset biomolekyylit – glukosinolaatit (Ed. Hyvärinen, H.).Veröffentlichungen of MTT Agrifood Research Finland, Ser. A 90, S. 58–67.
Sanders, M.E. (1998) Overview of functional foods: Emphasis on probiotic bacteria. International Dairy Journal, 8: 341–347.
Savard, T., Champagne, C.P. und Beaulieu, C. (2000) Influence des proportions de Leuconostoc mesenteroides dans l'inoculum sur la fermentation d'un mélange de legumes à base de carottes. Sciences des Aliments, 20: 603–610.
Sillanpää, M-L. (1984) Hapankaalin valmistus ja säilytys kotona. Työtehoseuran kotita- loustiedotus 14/1984
Torriani, S., Felis, G. E. und Dellaglio, F. (2001) Differentiation of Lactobacillus plantarum, L. pentosus, and L. paraplantarum by rec A. Gene Sequence Analysis and Multiplex PCR Assay with rec A. Gene-Derived Primers. Applied and Environmental Microbiology, Aug., 2001, S. 3450–3454.
Tuomola, E.M. und Salminen, S.J. (1998) Adhesion of some probiotic and dairy Lactobacillus strains to Caco-2 cell cultures Int. J. Food Microbiol. 41: 45–51.
de Valdez, G.F., de Giori, G.S., Garro, M., Mozzi, F. und Oliver, G. (1990) Lactic acid bacteria from naturally fermented vegetables. Microbiologie-Aliments-Nutrition 8: 175–179.
Ziemer, C.J., und Gibson, G.R. (1998). An overview of probiotics prebiotics and synbiotics in the functional food concept: perspectives and future strategies. International Dairy Journal, 8: 473–479.

Claims

Reinkultur des Bakterienstamms Lactobacillus sp.2* (DSM 14485).
Verwendung einer Reinkultur des Bakterienstamms Lactobacillus sp.2* (DSM 14485) in einem Starter, der angepasst ist zur Verwendung bei der Fermentation von Pflanzenmaterial.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei der Starter die Bakterienstämme Pediococcus pentosaceus P45 (DSM 14488) und Leuconostoc mesenteroides 78 (DSM 14486) umfasst.
Verfahren zur Fermentation von Pflanzenmaterial, dadurch gekennzeichnet, dass das zu fermentierende Pflanzenmaterial in Kontakt gebracht wird mit einer Startermischung, die den Bakterienstamm Lactobacillus sp.2* (DSM 14485) beinhaltet, und anaerob oder microaerophil fermentiert wird, bis die gewünschte Säurekonzentration erreicht ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Startermischung die Bakterienstämme Pediococcus pentosaceus P45 (DSM 14488) und Leuconostoc mesenteroides 78 (DSM 14486) umfasst.