DE2460649A1

DE2460649A1 - Verfahren zur enzymatischen synthese von halbsynthetischen penicillinen und cephalosporinen durch eine unloesliche acylase

Info

Publication number: DE2460649A1
Application number: DE19742460649
Authority: DE
Inventors: Francesco Dr Bartoli; Francesco Dr Cecere; Giuliano Dr Galli
Original assignee: SnamProgetti SpA
Current assignee: SnamProgetti SpA
Priority date: 1973-12-20
Filing date: 1974-12-20
Publication date: 1975-06-26
Also published as: DD115683A5; FI362174A; ZA747896B; NO744591L; HU172712B; CH606432A5; JPS5095487A; CS190459B2; GB1482481A; LU71482A1; IL46151A0; AU7593874A; YU335574A; SE7416078L; BE823393A; NL7416548A; DK661074A; IT1045797B; FR2255379A1; FR2255379B1

Description

Dr. F. Zumstein sen. - Dr. E. Assmann Dr. R. Koenlgsberger - Dlpl.-Phys. R. Holzbauer - Dr. F. Zumstein Jun.

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Case 692
12/By.

SNAMPROGETTI S.ρ.Α., Mailand, Italien

Verfahren zur enzymatisehen Synthese von halbsynthetischen Penicillinen und Cephalosporinen durch eine unlösliche Acy-

läse

(Zusatz zum deutschen Patent 1 932 426)

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Synthese von halbsynthetischen Penicillinen und Cephalosporinen durch eine unlösliche Acylase. ·

Die Bedeutung der semisynthetischen Derivate von Penicillinen und Cephalosporinen hat in den letzten Jahren stark zugenommen« Letztere werden weit verbreitet in der Pharmakologie anstelle von Antibiotica verwendet, die nicht widerstandsfähig gegen Penicillinase sind und daher wenig wirksam sind. Solche Produkte sind durch chemische oder enzymatische Synthese erhältlich.

Die chemische Synthese, ausgenommen die des Ampicillins, ergibt keine guten Ausbeuten und erfordert die Anwendung teurer Reagentien und eine beträchtliche Anzahl von Reaktionsschritten.

Die enzymatische Synthese kann mittels Zellen oder eines mehr oder minder gereinigten Penicillin-Acylase-Enzymextrakts durchgeführt werden. Gewöhnlich wird sie mittels Zellen durchgeführt,

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da das gereinigte Enzym hohe Kosten verursacht, die die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens stark in Frage stellen. Ein grosser Nachteil der mikrobiellen Synthese liegt darin, dass das Produkt in der Reaktionsendmischung zusammen mit grossen Mengen an verunreinigendem Proteinmaterial vorliegt, was die Notwendigkeit sehr verfeinerter und teurer Methoden zur Reinigung erforderlich macht. Andererseits ist diese Reinigung zur Entfernung von mindestens Spuren von Proteinverunreinigungen notwendig, die, falls sie im Endprodukt vorliegen, starke allergische Phänomene bewirken können.

Die vorliegende Erfindung betrifft die enzymatische Synthese unter Anwendung von Penicillinacylase, eingeschlossen in poröse Fasern gemäss der in der italienischen Patentschrift 836 462 (deutsche Patentschrift 1 932 426) beschriebenen Arbeitsweise.

Wichtige Besonderheiten des erfindungsgemässen Verfahrens sind:

a) Die Verwendung von Fasern, die mit einer grossen Menge an Enzym beladen sind, um eine rasche Synthese der Produkte durchzuführen;

b) die Möglichkeit einer leichten Abtrennung des Enzyms aus der Reaktionsmischung, da sonst unerwünschte Zersetzungsreaktionen eintreten;

c) das Produkt ist nicht verunreinigt, da das Protein nicht aus den Höhlungen der Faser, in denen es enthalten ist, austreten kann;

d) die kontinuierliche Wiederverwendung des eingeschlossenen Enzyms bringt grosse Vorteile für die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens mit sich. ~ '

Die Reaktion verläuft zwischen einem Ausgangsmaterial, das. durch Hydrolyse der natürlichen Antibiotica oder deren Derivate (6-Ami-

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no-peniciilansäure, 7-Amino-cephalosporansäure) und einer Carbonsäure, deren Carboxylgruppe aktiviert sein kann, beispielsweise durch Ester oder Amid, so dass die Reaktion beschleunigt wird.

Die Temperatur kann im Bereich von O bis 5O⁰C, vorzugsweise etwa 25°C liegen, der pH-Wert im Bereich von 4,0 bis 9,0, vorzugsweise bei etwa 7.

Die Umsetzung wird durch Kontaktieren der das Enzym enthaltenden Faser mit der Reaktionsmischung durchgeführt; da es sich um ein heterogenes System handelt, muss stark gerührt werden, um Diffusionsphänomene an der Grenzfläche stärker zu vermeiden.

Es können verschiedene Reaktortypen verwendet werden; ein sehr einfacher besteht in einer mit den Enzymfasern gefüllten Säule, durch die die Lösung mittels einer Pumpe während der- zur Erzielung der höchsten Umwandlung erforderlichen Zeit cyclisiert wird.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken;

Beispiel 1

Aus dem Escherichia Coli-Stamm ATCC 9637 wurde Penicillinacylase extrahiert und gereinigt und in Cellulosetriacetat gemäss der in der italienischen Patentschrift 836 462 (deutsche Patentschrift 1 932 426) beschriebenen Methode so eingehüllt, dass man Fasern erhielt, die etwa 25 000 Enzymeinheiten pro g Polymeres enthielten (t Einheit = 1 mMol hydrolisiertes Penicillin G pro Stunde bei 37°C).

500 mg (2,33 mMol) 7-Amino-3-methyl-ceph-3-em-4-carbonsäure (7 ADCA) und 1 g (4,97 mMol) D(-)-Phenyl-glycin-methylesterchlorhydrat (PGM) wurden in 50 ml 0,1 m-Kalium-phosphatpuffer

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vom pH-Wert 7,00 bei 25⁰C gelöst. Diese Lösung wurde unter Rühren in Kontakt mit 2 g Fasern entsprechend 1 g Cellulosetriacetat (CTA), enthalten in einem ummantelten Glasrohr, kontaktiert. In regelmässigen Zeitabständen wurde 7ß-(2^l-Amino-2^l-phenylacetamido)-3-methyl-ceph-3-em-4-carbonsäure (Cephalexin) nach einer spektrophotometrischen Methode (ANALYST, 92, 247, 1967) bestimmt. Nach einer Stunde wurde die Reaktion durch Entfernen der Reaktionsmischung von der Faser unterbrochen. In der Lösung waren 8,4 mg/ml Cephalexin entsprechend einer 7 ADCA-Umwandlung von 51% enthalten.

Beispiel 2

Es wurde eine Lösung von 7 ADCA und PGM wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, deren pH-Wert jedoch 6,50 betrug. Nach etwa zwei Stunden wurde die Reaktion wie vorstehend unterbrochen.

In der Lösung waren 8,1 mg/ml Cephalexin, entsprechend einer 49%igen Umwandlung, enthalten.

Beispiel 3

Es wurde eine Lösung von 7 ADCA und PGM gemäss Beispiel 1 hergestellt, deren pH-Wert jedoch 8,50 betrug.

Nach etwa 30 Minuten wurde die Reaktion unterbrochen. In der Lösung waren 7,8 mg/ml Cephalexin, entsprechend einer 47%igen Umwandlung, enthalten.

Beispiel 4

500 mg (2,33 mMol) 7 ADCA und 2 g (9,94 mMol) PGM wurden in einem 0,2 m-K-POi-Puffer beim pH-Wert 7 gelöst. Diese Lösung

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wurde thermostatisch auf 25°C gehalten und unter Rühren mit 2 g Fasern während einer Stunde in Kontakt gehalten. Nach dieser Zeit waren in der Lösung 12 mg/ml Cephalexin enthalten, was einer Umwandlung von 73% 7 ADCA entsprach.

Beispiel 5

Es wurde gemäss Beispiel 4 eine Lösung hergestellt und unter Rühren mit 2 g Fasern in Kontakt gehalten, wobei thermostatisch auf 37⁰C gehalten wurde. Die Reaktion wurde nach 30 Minuten unterbrochen. In der Lösung waren 11,4 mg/ml Cephalexin, entsprechend einer 70%igen Umwandlung, enthalten.

Beispiel 6

500 mg (2,31 mMol) 6-Aminopenicillinsäure (6-APA) und 2 g (10,2 mMol) des Äthylesters von d(-)-p-Hydroxiphenyl-glycin (p-OH PGE) wurden in 150 ml 0,1 m-K-PO^-Puffer vom pH-Wert 7,00 bei 25°C gelöst. Die Lösung wurde unter Rühren mit 2 g Fasern während drei Stunden in Kontakt gehalten und anschliessend entfernt.

In der Lösung lagen 1,7 mg/ml oL-Amino-p-hydroxi-benzyl-penicillin (Amoxicillin), entsprechend einer 6-APA-Umwandlung von 30% vor.

Beispiel 7

4 g (18,7 mMol) 6-APA und 2 g (10,2 mMol) pOH-PGE wurden in 150 ml 0,1 m-K-PO^-Puffer vom pH-Wert 7,00 bei 25°C gelöst ι mit 4 g Fasern unter Rühren in Kontakt gehalten.

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Nach sieben Stunden wurde die Reaktion unterbrochen und die Konzentration an Amoxicillin betrug 7,2 mg/ml, entsprechend einer 15,7%igen Umwandlung.

Beispiel 8

500 mg (2,33 mMol) 7 ADCA und 1 g (5,1 mMol) pOH PGE wurden in 150 ml 0,1 m-K-PO^-Puffer vom pH-Wert 7,00 bei 25°C gelöst. Nach vier Stunden wurde die Reaktion wie vorstehend unterbrochen.

Die Reaktionsmischung enthielt 2 mg(ml 7ßZ2'-Amino-2'(4-hydroxyphenyl)-acetamidq7-3-methyl-ceph-3-em-4~carbonsäure, entsprechend einer 35,4%igen Umwandlung.

Beispiel 9

535 mg (2,5 mMol) 7 ADCA und 873 mg (2,5 mMol) oC-Amino-benzylpenicillin (Ampicillin) wurden in 50 ml 0,1 m-K-PO^-Puffer vom pH-Wert 7,00 bei 25⁰C gelöst. Die Lösung wurde unter Rühren mit 1 g Fasern in Kontakt gehalten.

Nach einer Stunde erhielt man eine maximale Konzentration an Cephalexin von 3,5 mg/ml, entsprechend einer 20%igen Umwandlung von 7 ADCA.

Beispiel 10

500 mg (2,33 mMol) 7 ADCA und 1,35 g (9 mMol) Phenylglycinamid wurden in 50 ml 0,1 m-K-PO^-Puffer vom pH-Wert 7 gelöst.

Diese Lösung wurde unter Rühren bei 25⁰C während etwa einer Stunde mit 2 g Fasern in Kontakt gehalten. Nach dieser Zeit lagen in der Lösung 11 mg/ml Cephalexin, entsprechend einer 68%igen

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Umwandlung von 7 ADCA vor.

Beispiel 11

640 mg (2,35 mMol) 7-Amino-cephalosporansäure (7 ADCA) und 1jO S (5,1 mMol) p-Hydroxyphenyl-glycin-äthylester wurden in 150 ml 0,1 m-Phosphatpuffer vom pH-Wert 7 bei 25⁰C gelöst«

Die Lösung wurde während vier Stunden unter Rühren mit 2 g Enzymfasern in Kontakt gehalten. Nach dieser Zeit enthielt die Reaktionsmischung 1,9 mg/ml 7ß/2'-Amino-2'-(4-hydroxyphenyl)-acetamid/3-hydroxymethyl-(acetat)-ceph-3-em-4-carbonsäure, was einer 29%igen Umwandlung von 7 ADCA entsprach.

Der verwendete Stamm Escherichia coli ATCC 9637 ist ein bekannter, der Öffentlichkeit zugänglicher Stamm, der bei der American Type Culture Collection, Washington D.O., USA, hinterlegt ist

und der beispielsweise wie in der deutschen Patentschrift

(Patentanmeldung P der gleichen Anmelderin vom gleichen Anmeldetag mit dem Titel "Enzymatisehe Hydrolyse von Cephalosporinen. und enzymatische Synthese von halbsynthetischen Oephalosporinen", basierend auf der italienischen Prioritätsanmeldung 54484 A/73 vom 20. Dezember 1973), kultiviert werden kann.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur enzymatischen Synthese von halbsynthetischen Penicillinen und Cephalosporinen, dadurch gekennzeichnet , dass man ein Hydrolyseprodukt der natürlichen Antibiotica oder deren Derivaten mit einer Carbonsäure umsetzt, worin die Carboxylgruppe in Anwesenheit einer in Fasern eingeschlossenen Penicillinacylase aktiviert wird.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die U
wird.

die Umsetzung bei Temperaturen von O bis 5O°C durchgeführt

3. Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung bei einem pH-Wert von 4 bis 9 durchgeführt wird.

4. Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Penicillinacylase in aus Cellulosetriacetat erhaltenen Fasern eingehüllt ist.

5. Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Penicillinacylase aus Escherichia Coli-Stamm ATCC 9637 extrahiert und gereinigt wurde.

6. Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibioticaderivat 7-Amino-3-methylceph-3-em-4-carbonsäure ist und als Produkt Cephalexin erhalten wird.

7. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat von natürlichen Antibiotica 6-Aminopenicillansäure und das erhaltene Produkt Amoxicillin ist.

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