DE2433647B2 - Neue menschliche proinsulin-c- peptid-derivate und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue menschliche C-Peptidderivate und insbesondere tyrosylierte menschliche C-Peptidderivate und radioaktive jodierte Derivate davon. Diese C-Peptidderivate sind brauchbar für die radioimmunologische Untersuchung von menschlichem C-Peptid oder Proinsulin im Serum.

Es ist bekannt, daß menschliches Proinsulin, eine Vorstufe des Insulins, die Struktur NH₂-(B-KeUe von Insulin) - Arg - Arg - (C - peptid) - Lys - Arg - (A - Kette) (Proc. Nat. Acad. Sei., Vol. 67, S. 148 bis 155 [1970]) besitzt. Da der Blutspiegel von menschlichem C-Peptid mit denen von Proinsulin und Insulin in Beziehung steht, ist eine quantitative Analyse von C-Peptid, insbesondere eine radioimmunologische Untersuchungsmethode im klinischen Bereich, von großer Bedeutung.

Steiner et al. berichteten, daß menschliches C-Peptid aus menschlicher Pankreas extrahiert wurde und schlug als ihre Aminosäuresequenz Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-AIa - Leu - GIu - GIy - Ser - Leu - GIn vor (J. Biol. Chem., Vol. 246, S. 1375 bis 1386, [1971]).

Darüber hinaus berichteten Steiner et al. von der immunologischen Untersuchungsmethode unter Verwendung von ¹³¹J-tyrosyliertem C-Peptid, das aus dem extrahierten C-Peptid (Diabetes, Vol. 19, S. 546 bis 551, und Proc. Nat. Acad. Sei., Vol. 67, S. 148) hergestellt wurde.

Bei der immunologischen Untersuchung ist ein Antiserum erforderlich, das einen Antikörper zum menschlichen C-Peptid enthält, und das Antiserum wird im allgemeinen in Tieren, wie Meerschweinchen oder Kaninchen, mit Antigen, nämlich C-Peptid. gebildet. Üblicherweise ist es erforderlich, daß das Antiserum so viele Antikörpereinheiten aufweist, daß sie selbst nach hoher Verdünnung, wünschenswert 3000- bis 5000maliger Verdünnung, gemessen werden können, um unerwünschte Wirkungen verschiedenster Arten unvermeidlicher Kontaminanlien im Serum za vermeiden.

Das im Bericht von Steiner von C-Peptid erhaltene Antiserum erlaubt die Messung bei lOOOfacher Verdünnung, jedoch ist dies noch nicht befriedigend Darüber hinaus kann die Extraktion von C-Peptid aus menschlicher Pankreas nicht in großem Maßstab durchgeführt werden, und durch ein synthetisches Verfahren wird C-Peptid nicht in hoher Ausbeute erhalten, da es in wäßriger Pufferlösung etwas löslich ist.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung neuer C-Peptidderivate, die bei der immunologischen Untersuchung von menschlichem C-Peptid in Serum brauchbar sind. Das oben beschriebene C-Peptid weist 31 Aminosäuren in der Sequenz auf und wird in der vorliegenden Beschreibung als Steinersches C-Peptid, menschliches Proinsul^..^, oder C-Peptid (31) bezeichnet. Somit betrifft die vorliegende Erfindung neue Derivate des durch die Bezeichnung Arg-Arg-Steinersches C-Peptid-Lys-Arg dargestellten Peptids, das als menschliches Proinsulin₃₁ _₆₅ oder C-Peptid (35) bezeichnet wird. Die vorliegende Erfindung schließt auch die zwei Derivate, nämlich tyrosyliertes C-Peptid (35) und deren radiojodierte Verbindungen, die für die immunologische Untersuchung brauchbar sind. Die Erfindung betrifft auch deren geringfügig modifizierte Derivate, wie das an der Lysineinheit und dergleichen formylierte Derivat.

Gegenstand der Erfindung sind somit die in den vorstehenden Patentansprüchen aufgezeigten Peptide und die ebenfalls dort aufgezeigten Verfahren zu deren Herstellung.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausrührungsformen erläutert.

C-Peptid (35) wird mit Tyrosin zur Reaktion gebracht, oder ein Tcilpcptid von C-Peptid (35) wird _mit einem tyrosylierten Peptid das ein Gegenstück ajni Teilpeptid ist, zur Reaktion gebracht. Es ist wünschenswert, die Aminogruppe von Tyrosin oder vom Tyrosinteil des Peptids durch eine in dei Peptinsynthesf bekannte geeignete Schutzgruppe, wie Benzyloxycarbonyl (Z), tert.-Butyloxycarbonyl (Boc) u. dgl. zu schützen. Das Tyrosin oder das lyrosylierte Gegenstück des C-Peptids(35) kann als aktivierter Ester Tür die Reaktion eingesetzt werden, und jeder in der Peptidsynthese bekannte aktivierte Ester kann verwendet werden. Solche Ester sind beispielsweise Trichlorphenylester, p-Nitrophenylester, Pentachlorphenylester u. dgl.

Die Reaktion wird beispielsweise zwischen 1 Mol des zuerst genannten Reaktionsteilnehmers und ungefähr 2 bis 10 Mol des letzteren Reaktionsteilnehmers (aktivierter Tyrosinester oder ein aktivierter Ester mit einem Tyresinrest am endständigen Stickstoff) in einem Lösungsmittel mit einem pH von ungefähr 7 bis 9. das gegenüber den Reaktionsteilnehmern ineu ist, bei -15 bis +20"C während 0,5 bis 48 Stunden durchgeführt.

Das mit Schutzgruppen versehene erhaltene tyrosylierte C-Peptid (35) kann in Gegenwart eines Katalysators, wie Palladiumschwarz, in einem Wasserstoffstrom reduziert werden, oder es kann mit einer Säure, wie Trifluoressigsäure oder Chlorwasserstoffsäure, behandelt werden, wobei man tyrosylicrtes C-Peptid {35i erhält. Jedoch muß die Schutzgruppe, wie die Formylgruppe an der f-Aminogruppe der vorletzten Lysingruppierung (Position 64), nicht entfernt werden, wenn die Gruppe die Immunoreaktivität nicht stört. Das tyrosylierte C-Peptid (35) kann durch eine gebräuchliche Methode, wie Gelfiltration mit Sephadcx¹* G 50, Bio-Gel* P-6 u. dgl., gereinigt werden.

Um das tyrosylierte C-Peptid (35) mit radioaktivem Jod zu jodieren, ist es sehr günstig, die Methode von H unter und Greenwood (Nature, Vol.194, S. 494 bis 497 [1962]) auszuführen. Bei dieser Methode wird das tyrosylierte C-Peptid (35) in Wasser gelöst und mit radioaktivem Natriumjodid, wie Natrium¹²^ oder Natrium^13lJ und Chloramin T als Oxidationsmittel angenähert 30 Sekunden zur Reaktion gebracht; anschließend wird die Reaktion durch Zugabe von Natriummetabisulfit gestoppt. Hinsichtlich des radioaktiven Jods ist ¹²⁵J oder ™) bevorzugt. Führt man die Reinigung durch Gelfiltration u. dgl. durch, erhält man die gewünschte Substanz, die radioaktives Jod in der Phcnylgruppe des Tyrosinrests aufweist.

Mit der Ausnahme von Glycin ist bei allen in der vorliegenden Erfindung verwendeten Aminosäuren deren optisch aktive L-Form gemeint, und sie werden im allgemeinen durch die drei Anfangsbuchstaben der zugrunde liegenden Aminosäuren dargestellt; lediglich die Gruppe Glutaminyl ist durch GIn ausgedrückt.

Das C-Peptid (35) und sein radiojodiertes tyrosyliertes Derivat sind bei der immunologischen Untersuchung sehr brauchbar, und der durch das C-Peptid (35> hervorgerufene Antikörper kann bei lOOOOfaeher Verdünnen;; verwendet werden, so daß die vorüesende Erfindunc sehr wertvolle Materialien Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung genauer.

Die in den Beispielen 1 und 2 als Ausgangsmaterialien verwendeten Peptide werden durch die in dem folgenden Schema und den folgenden Beispielen gezeigte Segmentierungsmethode hergestellt. In der vorliegenden Beschreibung werden die Peptide aus Gründen der Einfachheit bisweilen in abgekürzter Form dargestellt, bei der die zwei endständigen Aminosäuren (N-endständig und C-endständig) zusammen mit der Nummer gezeigt werden, die beim menschlichen Proinsulin verwendet wird.

Beispiel A

Synthese von Z-Tyr-Arg(H ⁺ )-Arg(H ⁺ )-Glu-.Ma-Glu(oBu)-Asp(oBu)-Leu-Gln-NHNH-Boc

Z - ArglNO-,) - Arg(H") - GIu - AIa - Glu(oBu)-Asp(oBu)-Leu-Gin-NHNHBoc [Schmelzpunkt ί 75 bis 176° C (Zersetzung) Rf¹0,62, Rf" 0,75, Aminosäureverhältnisse im sauren Hydrolysat: Arg + Orn 2,0S Asp 0,99 GIu 2,97 Ala 1,01 Leu 0,97; Analyse berechnet für C₆₁H₁₀₀N₁₈O₂I · Acetat-dihydrat] (519 mg) wird in 20 ml Me-OH und 5 ml 10%iger Essigsäure 20 Stunden über Pd hydriert. Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt, das Lösungsmittel wird eingedampft, und der Rückstand wird lyophilisiert.

Man gibt Z-Tyr-OCP zu einer Lösung des obigen hydrierten Materials in 10 ml Dimethylformamid und hält die Mischung 20 Stunden bei Raumtemperatur. Das Lösungsmittel wird konzentriert, und man gibt Äthylacetat zu. Der erhaltene Feststoff wird gesammelt, getrocknet und mit Äthylacetat und Wasser gewaschen. Ausbeute 240 mg; Schmelzpunkt 188 bis 189" C (Zersetzung). Rf 0,51.

Analyse für C₇₀H₁₁₀N₁₈O₂I · Diacetat-dihydrat:
Berechnet ... C 52,4, H 7,3, N 14,9;
gefunden .... C 52,4, H 6,9. N 14,7.

Beispiel B

Synthese des tyrosylierten [64-Formyllysin]-menschlichen Proinsulins₃₁ _₆₅

195 mg Z - Tyr - Arg - Arg - GIu - AIa - Glu(oBu)-Asp(oBu)-Leu-GIn-NHNHBoc in 1,0ml Trifluoressigsäure werden 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen,und man gibt wasserfreien Äther zu. Das erhaltene Hydrazid wird durch Filtrieren gesammelt, mit Äther gewaschen und über KOH im Vakuum getrocknet. Man löst das Hydrazid in 5 ml Dimethylformamid und 0,09 ml 6n-HCl in Dioxan. Die Lösung wird auf - 15° C gekühlt, und 0,14 ml 10%igcs Isoamylnitrit in Dimethylformamid werden zugegeben, Nach 3 Minuten wird die erhaltene Acidlösung durch Zugabe von Triäthylamin auf pH 7,5 eingestellt und zur Lösung von 48 mg des obigen [64-Formyllysin]-proinsulin,9_₆₅ in 5 ml Dimethylformamid und 1 m Hexamethylphosphortriamid bei -10⁰C zugegeben

Die Mischung wird 24 Stunden bei 4 C gerührt und das Lösungsmittel wird eingedampft. Der Rück stand wird in der für die Herstellung von [64-Formyl lysin]-proinsulin,9_₆₅ beschriebenen Weise behandelt

Die Mischung der Produkte wird in 30 ml 50%ige Essigsäure 20 Stunden über Pd hydriert.

Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernl und das Lösungsmittel wird im Vakuum eingedampfi

Man löst den Rückstand in 5 ml 1-m Essigsaure und gibt die Lösung auf eine Säule von Bio-Gel⁶' P-6 (2,5 χ 120 cm). Jeweils einzelne Fraktionen von 8 ml werden gesammelt. Die Fraktionen Nr. 27 bis 50 werden vereinigt, und das Lösungsmittel wird konzentriert. Den Rückstand lyophilisiert man. Dieses Material wird durch CM Sephadex ^w Säulenchromatographie weitergereinigt. Das in 300 ml Wasser gelöste iyophilisierte Material wird auf eine CM Sephadex" C-25 Säule (2,5 χ 4 cm) aufgegeben, die mit 200 ml Wasser gewaschen und mit 400 ml 0,02 m Ammoniumacetat eluiert wird.

Man sammelt einzelne Fraktionen von jeweils 10 g und bestimmt den Aufenthaltsort des Peptids durch Sakaguchi- und Chloruntersuchungen. Die das gewünschte Material enthaltenden Eluate werden vereinigt, das Lösungsmittel wird im Vakuum eingedampft, und der Rückstand wird aus kleinen Volumina Wasser lyophilisiert und durch Bio-Gel'"* P6 entsalzt. Ausbeute 41 mg;

[«]? -97.9° (C 0,21, 10%ige Essigsäure); Rf 0,12, Rf" 0,37, Aminosäureverhältnisse im sauren Hydrolysat: Asp 0,97 Ser 1,60 GIu 8,13 Pro 1.94 GIy 7,15 AIa 3,08 VaI 2,05 Leu 5,96 Tyr 0,92 Lys 0,95 Arg 2,85 NH₃ 4,41 (Wiedergewinnung 90%). " ₂$

Beispiel C

Z-Tyr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly NHNH₂

101 mg Z-VaI-GIy-GIn-VaI-GIu(OBu)-LeU-GIy-NHNHBoc werden in 5 ml Methanol, 5 ml 1-Butanol und 3 ml 10%iger Essigsäure 20 Stunden über Pd hydriert.

Der Katalysator wird entfernt, das Lösungsmittel wird eingedampft, und der Rückstand wird getrocknet Rf 0,48.

182 mg Z - Tyr - Arg - Arg - GIu - AIa - Glu(oBu)-Asp - (oBu) - Leu - GIn - NHNHBoc werden mit 0,5 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 50 Minuten behandelt, und man gibt wasserfreien Äther zu.

Der erhaltene Niederschlag (Rf 0,18) wird durch Filtrieren gesammelt und getrocknet.

Dieses Hydrazid wird in 6 ml Dimethylformamid und 0,15 ml 6 n-HCl in Dioxan gelöst. Die Lösung wird auf -10°C gekühlt, und 0,16ml 10%iges Isoamylnitrit in Dimethylformamid werden zugegeben.

Die Lösung wird durch Zugabe von Triäthylamin auf pH 7,5 eingestellt.

Diese Azidlösung wird mit einer Lösung des obigen hydrierten Materials in 5 ml Dimethylformamid bei —10° C vereinigt. Die Mischung wird 44 Stunden bei 4° C gerührt und auf ein kleines Volumen eingeengt.

Man gibt Aco-Et zu, um einen Feststoff zu erhalten, der gesammelt und getrocknet wird. Der Feststoff wird in 1 ml Trifluoressigsäure gelöst, und die Lösung wird 40 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Man gibt wasserfreien Äther zu, wobei man einen Feststoff erhält, der gesammelt und getrocknet wird.

Das sich ergebende Hydrazid wird in 16 ml 50%iger Essigsäure gelöst, und die Lösung wird durch Gelfiltration auf Bio-Gel®-P6 (2,5 χ 120cm) gereinigt. Ausbeute 130 mg; Rf 0,26 Rl" 0,64; Aminosäureverhältnisse im sauren Hydrolysat: Asp 1,31 GIu 5,22 GIy 1,87 Ala 1,05 VaI 1,97 Leu 1,99 Tyr 0,97 Arg 2,03 [Wiedergewinnung 89%).

Beispiel D

Tyrosyliertes [64-Formyllysin]-menschlichcs-Proinsulin„_₆₅

60 mg des obigen Z-Tyr-Arg(H^H>Arg(H ⁺ I-GIu Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu GIy-NHNH₂ werden in 15 ml Dimethylformamic und 0,30 ml 6 n-HCl in Dioxan neiöst, die Lösung wire auf -1:0° C gekühlt, und 0,04"ml 10%iges Isoamyl nitrit werden zugesetzt. Die Lösung wird durch Zugabc von Triiäthylamin aut pH 7,5 eingestellt.

Die erhaltene Azidlösung wird zur Lösung vor 30mg H-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-AIa-Leu-GIu-GIy-Ser-Leu-Gin-Lys( F)-Arg(H⁴)OH [Rf 0,14 Rf 0,46 [«]£ -92,7" (r 0,74 10%ige Essigsäure), Aminosäureverhältnisse im sauren Hydrolysat: Ser 1,76 GIu 3,09 Pro 1,90 GIy 4,9C AIa 2,14 Leu 3,92 Lys 1,02 Arg 1,01. Analyse Im CwH_M2N₂₆O₂₈ - Diacetat - tetrahydrat: berechnet: C 49,3; H 7,4; N 17,4; gefunden: C 49,5; H 7.5; N 16.9] in 10ml Dimethylformamid bei -10⁰C zugegeben.

Man rührt die Lösung 48 Stunden bei 4 C und verdampft das Lösungsmittel. Der Rückstand wird durch Zugabe von Äther ausgefällt und getrocknet.

Man hydriert 24 Stunden über Pd in 30 ml 50%iger Essigsäure. Der Katalysator wird entfernt, und das Lösungsmittel wird eingedampft.

Das hydrierte Material wird auf die bei der Herstellung von [64-Formyllysin]-menschliches-Proinsulin₃₁_₆₅ beschriebene Weise gereinigt. Ausbeute 39 mg; Rf 0,12, Rf" 0,37 [_n]y-97,7° (c 0,1 in 10%iger Essigsäure). Aminosäureverhältnisse im sauren Hydrolysat: Asp 1,04 Ser 1,78 GIu 7.88 Pro 2,05 GIy 6,84 AIa 3,07 VaI 2,06 Leu 6,04 Tyr 1,00 Lys 0.98 Arg 3.03 NH., 4,89 (Wiedergewinnung 85%).

Beispiel E

[64-Fürmylly.siii]-riiuiachliches-Piüinsulin_il__f,5-Acetat-Hydrat

488 mg Z - Arg(NO,) - Arg - GIu - AIa - Glu(oBu)-Asp - (oBu) - Leu - GIn - NHNHBoc vom Schmelzpunkt 175 bis 176° C (Zersetzung) in 5 ml Trifluoressigsäure läßt man 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen und gibt wasserfreien Äther zu. Das erhaltene Hydrazid wird durch Filtrieren gesammelt, mit Äther gewaschen und über KOH im Vakuum getrocknet. Man löst das Hydrazid in 10 ml Dimethylformamid und 0,17 ml 6 n-HCl in Dioxan. Die Lösung wird auf -15° C gekühlt, und 0,35 ml 10%iges Isoamylnitrit m Dimethylformamid werden zugesetzt. Nach 3 Minuten wird die erhaltene Azidlösung durch Zugabe von Triäthylamin auf pH 7,5 eingestellt, und sie wird zur Lösung von 120 mg [64-Formyllysin]-promsu-Im₃₉ _₆₅ in 10 ml Dimethylformamid und 2 ml Hexamethylphosphortriamid bei -10° C zugegeben.

Man rührt die Mischung 24 Stunden bei 4° C und dampft das Lösungsmittel ein. Der Rückstand wird auf dieselbe Weise wie bei der Herstellung von 164-Formyllysin]-Proinsulin₃₉_₆₅ beschrieben behandelt. Die Mischung der Produkte wird 48 Stunden in 50 ml 50%iger Essigsäure über Pd hydriert. Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt, und das Losungsmittel wird im Vakuum eingedampft. Man lost den Rückstand in 5 ml 50%iger Essigsäure und gibt die Lösung auf eine Säule von Bio-Gel ®-P-6 (3,0 χ 180 cm). Man sammelt einzelne Fraktionen von jeweils 10 g. Die Fraktionen Nr. 32 bis 50 werden

vereinigt, und das Lösungsmittel wird konzentriert. Der Rückstand wird lyophilisiert. Dieses Material wird durch CM-Sephadex® Säulenchromatographie weitergereinigt. Das in 300 ml Wasser gelöste lyophilisierte Material wird auf eine CM-Sephadex * C-25 Säule (2,5 χ 5 cm) aufgegeben, die mit 200 ml Wasser gewaschen und mit 500 ml 0,02-m Ammoniumacetat eluiert wird. Man sammelt einzelne Fraktionen von jeweils 10 g und ermittelt den Aufenthaltsort des Peptids durch Sakaguchi-Chlortesls. Die das gewünschte Material enthaltenden Eluate werden vereinigt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum eingedampft, und der Rückstand wird mit einem kleinen Volumen Wasser lyophilisiert und mit Bio-Gel *-P-6 entsalzt. Ausbeute 150mg; [«]S^S -96,8° (c 0,58, 10%ige Essigsäure) Rf 0,11, Rf 0,35, Aminosäureverhältnisse des sauren Hydrolysats Asp 1,04, Ser 1,78, GIu 7,88, Pro 2,05, GIy 6,84, AIa 3,07, VaI 2,06, Leu 6,04, Lys 0,98, Arg 3,03, NH₃ 4,28 (Wiedergewinnung 91%).

Beispiel F

H-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys(F)-Arg-OH-Acetat-Hydrat ([64-Formyllysin]-menschliches-Proinsulin₃₉_₆₅)

603 mg Z-VaI-GIy-Gin-VaI-Glu(oBu)-Leu-GIy-NHNH-Boc [Schmelzpunkt 253 bis 254° C (Zersetzung), Rf 0,77,Rf 0,85, [α]? -32,Γ (c 1,0 in DMF), Amino-Säureverhältnisse im sauren Hydrolysat GIu_2-02 GIy₂₀J VaI, qg LeU₀₅₆; Analyse berechnet für C₄₇H₇₆ Ni₀O₁₄: C 56,2; H 7,6; N 13,9; gefunden C 55,9; H 7,5; N 14.0] in 10 ml Trifluoressigsäure läßt man 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen und gibt wasserfreien Äther zu. Das erhaltene Hydrazid wird durch Filtrieren gesammelt, mit Äther gewaschen und über KOH im Vakuum getrocknet. Man löst das Hydrazid in 10 ml Dimethylformamid und 0,30 ml 6n-HCl in Dioxan, kühlt die Lösung auf -15° C und gibt 0,82 ml 10%iges Isoamylnitrit in Dimethylformamid zu. Nach 3 Minuten wird die Reaktionsmischung durch Zugabe von Triäthylamin auf pH 7,5 eingestellt und anschließend zu einer Lösung von 248 mg H-Gly-Gly-Pro-Gly-AIa - GIy - Ser - Leu - GIn - Pro - Leu -AIa - Leu - GIu - GIy-Ser - Leu - GIn - Lys(F) - Arg(H⁺) - OH [Rf 0,14, Rf 0,46, [α]? -92,7° (c 0,74 in 10%iger AcOH), AHaIySCfUrC₈₄H₁₄₂N₂₆O₂₈ · 2CH₃COOH ·4H₂O:berechnef. C 49,3; H 7,4; N 17,4; gefunden: C 49.5; H 7,5; N 16,9. Aminosäureverhältnisse im sauren Hydrolysat Ser₁₇₆ GIu₃ & PrO_1-90 GIy_4-90 AIa₂ _₁₄ LeU₃₅₂ ^Lvsij02 Arg_lj01] in 10 ml Dimethylformamid, 6 ml Hexamethylphosphortriamid und 0,06 ml Triäthylamin bei —10° C zugegeben. Man rührt die Mischung 24 Stunden bei 4° C und dampft das Lösungsmittel ein. Der in 1-BuOH gelöste Rückstand wird sechsmal mit 2%iger Essigsäure (mit 1-BuOH äquilibriert) gewaschen. Die 1-BuOH-Schichten werden vereinigt und eingedampft. Der Rückstand wird durch Zugabe von Äther verfestigt,und der Feststoff wird durch FiI-trieren gesammelt und getrocknet.

Die Mischung der Produkte wird 20 Stunden in 50 ml 50%iger Essigsäure über Pd hydriert. Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt, und das Lösungsmittel wird im Vakuum eingedampft. Man löst den Rückstand in 10 ml 50%iger Essigsäure und gibt die Lösung auf eine Säule von Bio-Gel ®-P-6 (0,148 bis 0,074 mm) (4,0 χ 120 cm). Man sammelt einzelne Fraktionen von jeweils 15 g. Der Aufenthaltsort des Peptids wird durch den Chlor-Tolidin-Test auf TLC bestimmt. Die Fraktionen Nr. 26 bis 39 werden vereinigt, und das Lösungsmittel wird eingedampft. Den Rückstand lyophilisiert man mit einem kleinen Volumen Wasser. Ausbeute 251 mg [«]£ - 87,6° (c 0,25 in 10%iger Essigsäure) Rf 0,20, Rf 0,55. Aminosäureverhältnisse im sauren Hydrolysat Ser, ₇₈ GIu_5-04 PrO_1-95 GIy₇₀₈ AIa_1-92 VaI_2-07 LeU₄₉₉ LyS₀₉₈ Argo.₉₇ NH₃ (Wiedergewinnung 82%).

Das in den Beispielen A bis F verwendete chromatographische System ist das gleiche wie das im Beispiel 1 verwendete System, d.h. Rf wurde mit Silicagel, Butanol-I: Essigsäure: Wasser = 4:1:5 und Rf" wurde mit Silicagel, Pyridin : Essigsäure: Wasser: Butanol-1 = 20:6: 24: 30 erhalten.

Beispiel 1

Man löst 34 mg Z-Tyr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp - Leu - GIn - VaI - GIy - GIn - VaI - GIu - Leu - GIy-NH · NH₂ in einer Mischung von 6 mg Dimethylformamid und 0,1 ml einer Lösung von 6 n-HCl in Dioxan und gibt nach dem Kühlen auf -15° C 0,03 ml Dimethylformamid, das 10% Gew./Vol. Isoamylnitrit enthält, zu. Nach einer Minute wird die erhaltene Lösung mit Triäthylamin neutralisiert und wird dann zu einer Lösung von 30 mg H-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gin-LyS(F)-Arg-OH Acetat, gelöst in 5,0ml Dimethylformamid bei — 10⁰C zugegeben.

Diese vereinigte Lösung wird 48 Stunden bei 4 C gerührt, und das Lösungsmittel wird entfernt. Den Rückstand wäscht man mit Äthyläther und trocknet, wobei man rohes tyrosyliertes C-Peptid (35) mit Schutzgruppen erhält. Dieses Peptid gibt man zu 40 ml 50%iger Essigsäurelösung und rührt die Mischung 48 Stunden bei Raumtemperatur im Wasserstoffstrom in Gegenwart von Palladiumschwarz. Dann wird die Reaktionsmischung filtriert, das Lösungsmittel wird entfernt, und der Rückstand wird getrocknet. Nach der Gelfiltration dieses Rückstands mit einer Sephadex® G-50 Säule (2,5 χ 80 cm) erhält man 23 me reines tyrosyliertes C-Peptid (35), H-Tyr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-GIn - Pro - Leu - AIa - Leu - GIu - GIy - Ser - Leu - GIn-Lys(F) - Arg - OH (tyrosyliertes [64-Formyllysin]-menschliches-Proinsulin₃₁_₆₅). [a]V -97,9° (c 0,21. 10%ige Essigsäure).
Dünnschichtchromatographie:

Rf 0,11 (Silicagel,

1-Butanol: Essigsäure: Wasser = 4:1:5).

Rf 0,35 (Silicagel,

Pyridin: Essigsäure: Wasser: 1-Butanol

= 20:6:24:30).

Aminosäureanalyse

(6n-HCl, HO⁰C 24 Stunden).
Es wird gefunden, daß das Molverhältnis jeder Aminosäure in den theoretischen Identitätsbereich fällt. Die gefundenen Werte sind wie folgt: Asp 1,05, Ser 1,60, GIu 7,90, Pro 2,07, GIy 6,98, AIa 2,92, VaI 1,96, Leu 6,10, Tyr 0,93, Lys 1,10, Arg 2,98.

Beispiel 2

Zur Lösung von 15 mg H-Arg-Arg-GIu-Ala-GIu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys(F)-Arg-OH, 7ml

609516/490

Dimethylformamid, 0,7 ml destilliertem Wasser und 0,1ml Triäthylamin gibt man 10 mg (Z)₂-Tyr · Trichlorphenylester und rührt die Mischung 40 Stunden bei 20⁰C. Nach Entfernung des Lösungsmittels wird der Rückstand mit Äthyläther gewaschen und getrocknet, der Rückstand wird in 20 ml 50%iger Essigsäure gelöst, und die Mischung wird 48 Stunden in Gegenwart von Palladiumschwarz gerührt, wobei man 13 mg rohes tyrosyliertes C-Peptid (35) mit einer Formylgruppe am Lysinrest erhält. Es wird in 1 ml 50%iger Essigsäure gelöst, und die Lösung wird mit der Sephadex®-G-50-Säule (2,5 χ 80 cm) gelfiltriert, wobei man gereinigtes tyrosyliertes [64-Formyllysin]-menschliches-Proinsulin₃₁ _₆₅ erhält. Die Charakteristika dieses Produkts sind beinahe identisch mit dem im Beispiel 1 erhaltenen Produkt.

Beispiel 3

Man löst 500Mikrogramm^g) tyrosyliertes menschliches C-Peptid in 1 ml Wasser und jodiert 3 μΐ der Lösung mit 2 mCi ¹²⁵J gemäß der Methode von Hunter und Greenwood. Das erhaltene ¹²⁵J-tyrosylierte [64-Formyllysin]-menschliche- Proinsulin₃₁ __6S wird mit der Bio-Gel® P 30 Säule (50 χ lern) unter Verwendung von 3 m Essigsäure als Eluiermittel gelfiltriert. Die Radioaktivität jeder Fraktion wird gezählt, und mehrere Fraktionen, die den Aktivitätspeak aufweisen, werden gesammelt. Die Fraktionen werden vereinigt und für die radioimmunologische Untersuchung verwendet. Man beobachtet ungefähr 100 mCi/mg Radioaktivität.

Immunologische Untersuchung

Zur Bestimmung von C-Peptid im Serum unter Verwendung von radioaktivem jodiertem tyrosyliertem C-Peptid(35) wird die folgende Methode durchgeführt. Zuerst löst man 1,0 mg menschliches C-Peptid (35) in 1,0 ml 0,9%iger NaCl-Lösung und suspendiert dann in 1,0 ml vollständigem Freundschem Adjuvans. Dieses Mittel wird 4 Kaninchen subkutan injiziert. 4 Wochen nach der Injektion wird die zweite Immunisierung auf dieselbe Weise wie oben beschrieben mit 0,5 mg C-Peptid (35) gegeben, und die Immunisierung wird drei- oder viermal durchgeführt. 10 Tage nach der letzten Injektion wird das Blut gesammelt, und anschließend wird das Antiserum erhalten. Man gibt in ein Reagenzglas, das 0,5 ml 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7,5, mit einem Gehalt von 0,5% Rinderserumalbumin und 0,15-m Natriumchlorid) und 0,1 ml einer wäßrigen Lösung von 0,1-m ÄDTA enthält,0,1 ml eines verdünnten Antiserums(l : 10000) eines synthetischen C-Peptids ([64-Formyllysin]-menschliches-Proinsulin,, __b5) zu.

Hierzu gibt man nacheinander 0,2 ml Serum von Patienten und 0,1 ml einer wäßrigen Lösung von

ίο ¹²⁵J - tyrosyliertem Ot-ForrnyllysinJ-mcnschlichem-Proinsurin₃₁_₆₅. Nach gutem Mischen wird die Mischung 48 Stunden bei 4 C inkubiert.

Zur erhaltenen Mischung gibt man 0,1 ml verdünntes normales Kaninchenserum und 0,1 ml verdünnten Ziegen-Antikörper zu Kaninchen-y-Globulin. Nach gutem Mischen wird die Mischung 24 Stunden bei 4⁰C inkubiert. Anschließend wird sie 30 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert.

Nach Entfernung der überstehenden Flüssigkeit wird die Radioaktivität des Niederschlags unter Verwendung eines Gamma-Zählrohrs bestimmt. Die Konzentration an C-Peptid im Serum des Patienten wird direkt aus der zuvor aufgestellten Dosis-Ansprechkurve abgelesen.

Die Dosis-Ansprechkurve (Standardkurve) wird nach folgendem Verfahren aufgestellt. Standardlösungen eines synthetischen C-Peptids (beispielsweise [64-Formyllysin]-menschliches-Proinsulin₃₁ _₆₅) werden beim obigen Verfahren an Stelle von Patientenserum verwendet. Die Zählung (oder prozentuale Zählung) wird auf der Ordinate aufgetragen, und die Konzentration der Standardlösung wird auf der Abszisse (logarithmischer Maßstab) von halblogarithmischem Sektionspapier aufgetragen.

Kurze Erläuterung der Zeichnung

F i g. 1 zeigt die Dosis-Ansprechkurve von synthetischem - [64 - Formyllysin] - menschlichem - Proinsulin,! _₆₅ und Steinerschem C-Peptid unter Verwendung von ¹²⁵J-tyrosyliertem [64-Formyllysin]-menschlichem-Proinsurin₃₁_₆₅, das erfindungsgemäß erhalten wurde. Beide Ansprechkurven stimmen miteinander überein.

Die F i g. 2 und 3 zeigen die Herstellung der Ausgangsmaterialien und die Verbindungen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (8)

Patentansprüche:

1. Peptid mit der Aminosäuresequenz Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val- Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Giy-Ala-Gly-Ser-Leu - GIn - Pro - Leu -AIa- Leu - GIu - GIy - Ser - Leu-Gln-Lys-Arg und sein Formylderivat am Lysinrest.

2. Peptid mit der Aminosäuresequenz Tyr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-GIn - VaI - GIu - Leu - GIy - GIy - GIy - Pro - GIy -AIa-GIy - Ser - Leu - GIn - Pro - Leu -AIa - Leu - GIu - GIy-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg und sein Formylderivat am Lysinrest.

3. Radiojodiertes Peptid mit der Aminosäuresequenz Ty r - Arg - Arg - GIu - Ala- GIu - Asp - Leu-Gin- VaI-GIy-Gin-VaI -GIu - Leu-GJy-GIy-GIy-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg und sein Formylderivat am Lysinrest.

4. Radiojodiertes Peptid gemäß Anspruch 3, worin das radioaktive Jod ^l2SJ ist.

5. Verfahren zur Herstellung des radioaktiven iodierten Peptids gemäß Anspruch 3, dadurch ge-Kennzeichnet, daß man das Peptid mit der Aminosäuresequenz Tyr - Arg - Arg - GIu - AIa - GIu - Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-GIy - Pro - GIy -AIa - GIy - Ser - Leu - GIn - Pro - Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg, worin der Lysinrest eine Formylgruppe tragen kann, mit radioaktivem Jod jodiert.

6. Verfahren zur Herstellung des Peptids gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen aktivierten Tyrosinester umsetzt mit dem Peptid der Aminosäuresequenz Tyr-Arg-Arg-Glu-AIa - GIu - Asp - Leu - GIn - VaI - GIy - GIn - VaI - GIu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-GIn - Pro - Leu - AIa - Leu - GIu - GIy - Ser - Leu - GIn Lys-Arg oder seinen Formylderivaten am Lysinrest.

7. Verfahren zur Herstellung des Peptids gemäß Anspruch 2. dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Z-Tyr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln- VaI - GIu - Leu - GIy- umsetzt mit einem Peptid der Aminosäuresequenz GIy - GIy - Pro - GIy-AIa - GIy - Ser - Leu - GIn - Pro Leu - AIa - Leu - GIu-GIy - Ser - Leu - GIn - Lys - Arg - OH oder seinem Formylderivat an der Lysingruppe. so

8. Verfahren zur Herstellung des Peptids gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Tyr-Arg-Arg-GIu-Ala-GIu-Asp-Leu-GIn mit einem Peptid der Aminosäuresequenz VaI - GIy - GIn - VaI - GIu-Leu - GIy - GIy - GIy - Pro - GIy - AIa - GIy - Ser - Leu-Gin - Pro - Leu -AIa - Leu - GIu - GIy - Ser - Leu - GIn-Lys-Arg oder seinem Formylderivat an der Lysingruppe umsetzt.

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