DE2433647A1 - Neue menschliche proinsulin-c-peptidderivate und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

Description

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DR.-!NG. WOLFRAM BUNTE DR. WERNER KINZEBACH

Ο-βΟΟΟ MÜNCHEN 4O. BAUKItSTRAME: 22 · FCRNRUP (Οββ) 37 ββ S3 · TEL «Χ B21S2OS ISAR O POSTANSCHRIFT: 0··Ο00 MÜNCHEN 43. POSTFACH 7SO

München, den 12. JuJ .. i ' M/15366

DAIICHI RADIOISOTOPES LABORATORIES LIMITED 14-10, Nihonbashi 3-Chome, Chuo-Ku, Tokyo, Japan

Neue menschliche Proinsulin-C-peptidderivate und Verfahren zu deren Herstellung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue menschliche C-Peptidderivate und insbesondere tyrosylierte menschliche C-Peptiddorivate und radioaktive jodierte Derivate davon. Diese C-Poptidderivate sind brauchbar für die radioimmunologxscho Untersuchung von menschlichem C-Peptid oder Proinsulin im Serum.

Es ist bekannt, daß menschliches Proinsulin, eine Vorstufe des Insulins, die^Struktur NH₂-(B-Kette von Insulin)-Arg-Arg-(C-peptid)-Lys-Arg-(A-Kette) (Proc. Nat. Acad; Sei. Vol. 67 S χ cen 148-155 (1970)) besitzt. Da der Blutspiegel von menschlichem C-Peptid mit denen von Proinsulin und Insulin in.Beziehung sti-M , ist eine quantitative Analyse von C-Peptid, insbesondere eine radioimmunologische Untersuchungsmethode im klinischen Bereich von großer Bedeutung.

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Steiner et al berichteten, daß menschliches C-Peptid aus menschlicher Pankreas extrahiert wurde und schlug als ihre Aminosäuresequenz Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-GJ-n-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Giy-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln vor. (J. Biöl. Chem. Vol. 246, Seiten 1375-1386, (1971)).

Darüber hinaus berichteten Steiner et al. von der immunologischen Untersuchungsmethode unter Verwendung von J-tyrosylierteni C-feptid, das aus dem extrahierten C-Peptid (Diabetes, Vol. 19, Seiten 546 - 551 undProc. Nat. Acad. Sei. Vol. 67, Seite 148) hergestellt wurde.

Bei der immunologischen Untersuchung ist ein Antiserum er·? forderlich, das einen Antikörper zum menschlichen C-Peptid enthält und das Antiserum wird im allgemeinen in Tieren, wie Meerschweinchen oder Kaninchen mit Antigen, nämlich C-Peptid, gebildet. Uberlicherweise ist es erforderlich, daß das Antiserum so viele Antikörpereinheiten aufweist, daß sie selbst nach hoher Verdünnung, wünschenswert 3000 bis 5000 maliger Verdünnung, gemessen werden können, um unerwünschte Wirkungen verschiedenster Arten unvermeidlicher Kontaminantien im Serum zu vermeiden.

Das im Bericht von Steiner von C-Peptid erhaltene Antiserum erlaubt die Messung bei 1000-facher Verdünnung, jedoch ist dies noch nicht befriedigend. Darüber hinaus kann die Extraktion von C-Peptid aus menschlicher Pankreas nicht in großem Maßstab durchgeführt werden und durch ein synthetisches Verfahren wird C-Peptid nicht in hoher Ausbeute erhalten, da es in wässriger Pufferlösung etwas löslich ist.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung neuer C-Peptidderivato, die bei der immunologischen Untersuchung von menschlichem C-Poptid in Serum brauchbar sind. Das oben beschriebene C-Peptid weiHt 31 Aminosäuren in der Sequenz auf und wird in der vorliegenden Beschreibung als Steiner^rsches C-Peptid, menschliches Proinsulin_33-6__f oder C-Peptid (31) bezeichnet. Somit betrifft die vorlie-

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gende Erfindung neue Derivate des durch die Bezeichnung Arg-Arg-Steiner'sches C-Peptid-Lys-Arg dargestellten Peptids, das als menschliches Proinsulin,,,, oder C-Peptid (35) bezeichnet 'wird. Die vorliegende Erfindung schließt auch die zwei Derivate, nämlich tyrosyliertes C-Peptid (35) und deren radiojodierte Verbindungen, die für die immunologische Untersuchung brauchbar sind. Die Erfindung betrifft auch deren geringfügig modifizierte Derivate, wie das an der Lysineinheit und dgl. formylierte Derivat.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsformen erläutert.

C-Peptid (3 5) wird mit Tyrosin zur Reaktion gebracht oder ein Teilpeptid von C-Peptid (35) wird mit einem tyrosylierten Peptid, das ein Gegenstück zum Teilpeptid ist, zur Reaktion gebracht. Es ist wünschenswert, die Aminogruppe von Tyrosin oder vom Tyrosinteil des Peptids durch eine in der Peptinsynthese bekannte geeignete Schutzgruppe, wie Benzyloxycarbonyl (Z), tert.-Butyloxycarbonyl (Boc) und dgl. zu schützen. Das Tyrosin oder das tyrosylierte Gegenstück des C-Peptids (35) kann als aktivierter Ester für die Reaktion eingesetzt werden und jeder in der Peptidsynthese bekannte aktivierte Ester kann verwendet werden. Solche Ester sind beispielsweise Trichlorphenylester, p-Nitrophenylester, Pentachlorphenylester und dgl.

Die Reaktion wird beispielsweise zwischen einem Mol des zuerst genannten Reaktionsteilnehmers und ungefähr 2 bis 10 Mol des letzteren Reaktionsteilnehmers (aktivierter Tyrosinester oder ein aktivierter Ester mit einem Tyrosinrest am endständigen Stickstoff) in einem Lösungsmittel mit einem pH von ungefähr 7 bis 9, das gegenüber den Reaktionsteilnehmern inert ist, bei -15°C bis +20⁰C während 0,5 bis 48 Stunden durchgeführt.

Das mit Schutzgruppen versehene erhaltene tyrosylierte C-Peptid (35) kann in Gegenwart eines Katalysators, wie Palladiumschwarz, in einem Wasserstoffstrom reduziert werden oder es kann mit einer Säure, wie Trifluoressigsäure oder Chlorwasserstoffsäure behan-

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delt werden, wobei, man tyrosyliertes C-Peptid (35) erhält.
Jedoch muß die Schutzgruppe, wie die Formylgruppe an der
£-Aminogruppe der vorletzten Lysingruppierung (Position 64)
nicht entfernt werden, wenn die Gruppe die Immunoreaktivität nicht stört. Das tyrosylierte C-Peptid (35) kann durch eine
gebräuchliche Methode, wie Gelfiltration mit Sephadex G 50,
Bio-Gel P-6 und dgl. gereinigt werden.

Um das tyrosylierte C-Peptid (35) mit radioaktivem Jod zu
jodieren, ist es sehr günstig, die Methode von Hunter und
Greenwood (Nature, Vol. 194, Seiten 494 - 497 (1962)) auszuführen. Bei dieser Methode wird das tyrosylierte C-Peptid (35)

125 in Wasser gelöst und mit radioaktivem Natriumjodid, wie Natrium J

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oder Natrium J und Chloramin T als Oxidationsmittel angenähert 30 Sekunden zur Reaktion gebracht; anschließend wird die Reaktion durch Zugabe von Natriummetabisulfit gestoppt. Hinsichtlich dos radioaktiven Jods ist J oder J bevorzugt. Führt man die Reinigung durch Gelfiltration und dgl. durch, erhält man die gewünschte Substanz, die radioaktives Jod in der Phenylgruppe des Tyrosinrests aufweist.

Mit der Ausnahme von Glycin ist bei allen in der vorliegenden Erfindung verwendeten Aminosäuren deren optisch aktive L-Form gemeint und sie werden im allgemeinen durch die drei- Anfangsbuchstaben der zugrundeliegenden Aminosäuren dargestellt; lediglich die Gruppe Glutaminyl ist durch GIn ausgedrückt.

Das C-Peptid (35) und sein radiojodiertes tyrosyliertes Derivat sind bei der immunologischen Untersuchung sehr brauchbar und der durch das C-Peptid (3 5) hervorgerufene Antikörper kann bei 10000-facher Verdünnung verwendet werden, so daß die vorliegende Erfindung sehr wertvolle Materialien schafft.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung genauer.

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Die in den Beispielen 1 und 2 als Ausgangsmaterialien verwendeten Peptide werden durch_t die in dem folgenden Schema und den folgenden Beispielen gezeigte Segmentierungsmethode

hergestellt. In der vorliegenden Beschreibung werden die Peptide aus Gründen der Einfachheit bisweilen in abgekürzter Form dargestellt, bei der die zwei endständigen Aminosäuren (N-endständig und C-endständig) zusammen mit der Nummer gezeigt werden, die beim menschlichen Proinsulin verwendet wird.

Beispiel A
Synthese ve
Leu-Gln-NHNH-Boc

Synthese von Z-Tyr-Arg(H⁺)-Arg (H⁺)-Glu-Ala-Glu(oBu)-Asp(oBu)-

Z-Arg(NO₂)-Arg (H⁺)-Glu-Ala-Glu(oBu)-Asp(oBu)-Leu-Gin-NHNHBoc {"Schmelzpunkt 175 - 176 ⁰C (Zersetzung) Rf¹ 0,62, Rf¹¹ 0,75, Aminosäureverhältnisse im sauren Hydrolysat: Arg + Orn 2,08 Asp 0,99 GIu 2,97 Ala 1,01 Leu 0,97; Analyse berechnet für Cc₁H_1n-N₁₀O₀₁«Acetat-dihydratl (519 mg) wird in 20 ml Me-OH

O I I UU Io & I· J

und 5 ml 10 %iger Essigsäure 20 Stunden über Pd hydriert. Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt, das Lösungsmittel wird eingedampft und der Rückstand wird lyophilisiert.

Man gibt Z-Tyr-OCP zu einer Lösung des obigen hydrierten Materials in TO ml Dimethylformamid und hält die Mischung 20 Stunden bei Raumtemperatur. Das Lösungsmittel wird konzentriert und man gibt Äthylacetat zu. Der erhaltene Feststoff wird gesammelt, getrocknet und mit Äthylacetat und Wasser gewaschen. Ausbeute 240 mg; Schmelzpunkt 188 bis 189 ° (Zersetzung). Rf 0,51 Analyse C₇₀H₁₁n^Ni8^21*^Di^acetat~dihydrat:

CHN ber. 52,4 7,3 14,9

gef. 52,4 6,9 14,7

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Beispiel B

Synthese des C-Peptids (35)

195 mg Z-Tyr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu(oBu)-Asp(oBu)-Leu-Gln-NHNHBoc in 1,0 ml Trifluoressigsäure werden 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen und man gibt wasserfreien Äther zu. Das erhaltene Hydrazid wird durch Filtrieren gesammelt, mit Äther gewaschen und über KOH im Vakuum getrocknet. Man löst das Hydrazid in 5 ml Dimethylformamid und 0,09 ml 6 nHCl in Dioxan. Die Lösung wird auf"-15°C gekühlt und 0,14 ml 10 %iges Isoamylnitrit in Dimethylformamid werden zugegeben. Nach 3 Minuten wird die erhaltene Acidlösung durch Zugabe von Triäthylamin auf pH 7,5 eingestellt und zur Lösung von 48 mg des obigen [64-Pormyllysin]-proinsulin₃₉_₆₅ in 5 ml Dimethylformamid und 1 ml Hexamethylphosphortriamid bei -10⁰C zugegeben.

Die Mischung wird 24 Stunden bei 4° gerührt und das Lösungsmittel wird eingedampft. Der Rückstand wird in der für die Herstellung von £64-FormyllysinJ-proinsulin₃₉_₆₅ beschriebenen Weise behandelt.

Die Mischung der Produkte wird in 3Ö ml 50 %iger Essigsäure 20 Stunden über Pd hydriert.

Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt und das Lösungsmittel wird im Vakuum eingedampft.

Man löst den Rückstand in 5 ml 1 m Essigsäure und gibt die Lösung auf eine Säule von Bio-Gel P-6 (2,5 χ 120 cm). Jeweils einzelne Fraktionen von 8 ml werden gesammelt. Die Fraktionen Nr. 27-50 werden vereinigt und das Lösungsmittel wird konzentriert. Den Rückstand lyophilisiert man. Dieses Material wird durch CM Sephadex Säulenchromatographie weiter gereinigt. Das in 300 ml Wasser gelöste lyophilisierte Material wird auf eine CM Sephadex C-25 Säule (2,5 χ 4 cm) aufgegeben, die mit 200 ml Wasser gewaschen und mit 400 ml 0,02 m Ammoniumacetat eluiert wird.

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Man sammelt einzelne Fraktionen von jeweils 10g und bestimmt den Aufenthaltsort'des Peptids durch Sakaguchi- und Chloruntersuchungen. Die das gewünschte Material enthaltenden Eluate werden vereinigt, das Lösungsmittel wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand wird aus kleinen Volumina Wasser lyophilisiert und durch Bio-Gel P6 entsalzt. Ausbeute 41 mg;

/V]24 _97_r9 ο _(c o,21, 10 %ige Essigsäure); Rf¹ 0,12 Rf¹¹ 0,37, Aminosäureverhältnisse im sauren Hydrolysat: Asp 0,97 Ser 1,60 GIu 8,13 Pro 1,94 GIy 7,15 AIa 3,08 VaI 2,05 Leu 5,96 Tyr 0,92 Lys 0,95 Arg 2,85 NH₃ 4,41 (Wiedergewinnung 90 %).

Beispiel C

Z-Tyr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-LeU-GIyNHNH₂

101 mg Z-VaI-GIy-GIn-VaI-GIu(OBu)-LeU-GIn-NHNHBOc werden in 5 ml Methanol, 5 ml 1-Butanol und 3 ml 10 %iger Essigsäure 20 Stunden über Pd hydriert.

Der Katalysator wird entfernt, das Lösungsmittel wird eingedampft und der Rückstand wird getrocknet. Rf 0,48.

182 mg Z-Tyr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu(oBu)-Asp-(oBu)-Leu-Gln-NHNHBoc werden mit 0,5 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 50 Minuten behandelt und man gibt- wasserfreien Ä'ther zu.

Der erhaltene Niederschlag Bf 0,18) wird durch Filtrieren gesammelt und getrocknet.

Dieses Hydrazid wird in 6 ml Dimethylformamid und 0,15 ml 6 nHCl in Dioxan gelöst. Die Lösung wird auf -10⁰C gekühlt und 0,16 ml 10 %iges Isoamylnitrit in Dimethylformamid werden zugegeben.

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Die Lösung wird durch Zugabe von Triäthylamin auf pH 7,5 eingestellt.

Diese Aziaiösung wird mit einer Lösung des obigen hydrierten Materials in 5 ml Dimethylformamid bei -1O⁰C vereinigt. Die Mischung wird 44 Stunden bei 4⁰C gerührt und auf ein kleines Volumen eingeengt.

Man gibt ACo-Et zu, um einen Feststoff zu erhalten, der gesammelt und getrocknet wird. Der Feststoff wird in 1 ml Trifluoressigsäure gelöst und die. Lösung wird 40 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Man gibt wasserfreien Äther zu, wobei man einen Feststoff erhält, der gesammelt und getrocknet wird.

Das sich ergebende Hydrazid wird in 16 ml 50%iger Essigsäure gelöst und die Lösung wird durch GeIfiltration auf Bio-Gel-P6 (2,5 χ 120 cm) gereinigt. Ausbeute 130 mg; Rf¹ 0,26Rf¹¹ 0,64; Aminosäureverhältnisse im sauren Hydrolysat: Asp 1,31 GIu 5,22 GIy 1,87 Ala 1,05 VaI 1,97 Leu 1,99 Tyr 0,97 Arg 2,03 (Wiedergewinnung 89 %) .

Beispiel D

Tyrosyliertes J"64-FormyllysinJ-menschliches-Proinsulin_.. _₆₅

60 mg des obigen Z-Tyr-Arg(H )-Arg (H )-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-NHNH« werden in 15 ml Dimethylformamid und 0,30 ml 6 nHCl in Dioxan gelöst, die Lösung wird auf -10° gekühlt und 0,04 ml 10%iges Isoamylnitrit werden zugesetzt. Die Lösung wird durch Zugabe von Triäthylamin auf pH 7,5 eingestellt.

Die erhaltene Azidlösung wird zur Lösung von 30 mg H-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys(F)-Arg(H⁺)OH fRf¹ 0,14 Rf¹¹ 0,46 Z*^⁹ -92,7° (C 0,74, 10 %ige Essigsäure), Aminosäureverhältnisse im sauren Hydrolysat: Ser 1,76 GIu 3,09 Pro 1,90 GIy 4,90 AIa 2,14 Leu 3,92 Lys 1,02 Arg 1,01, Analyse berechnet für C₈₄H₁₄₂N₃₆O₂₈-

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Diacetat-tetrahydrat: C 49,3; H 7,4; N 17,4. Gefunden: C 49,5; H 7,5; N 16,9j in 10 ml Dimethylformamid bei -10⁰C zugegeben. ^ . .'.'-'.

Man rührt die Lösung 48 Stunden bei 4° und verdampft das Lösungsmittel. Der Rückstand wird durch Zugabe von Äther ausgefällt und getrocknet. .

Man hydriert 24 Stunden über Pd in 30 ml 50 %iger Essigsäure. Der Katalysator' wird entfernt und das Lösungsmittel wird eingedampft. "

Das hydrierte Material wird auf die bei der Herstellung von £ 64-Formyllysinl-menschliches-Proinsulin-,- __fi5 beschriebene Weise gereinigt. Ausbeute 3 9 mg; Rf 0,12, Rf 0,37 I^Jq -97,7° (C 0,1 in 10 %iger Essigsäure). Aminosäureverhältnisse im sauren Hydrolysat: Asp 1,04 Ser,.1,78 GIu 7,88 Pro 2,05 GIy 6,84 AIa 3,07 VaI 2,06 Leu 6,04 Tyr 1,00 Lys 0,98 Arg 3,03 NH₃ 4,89 (Wiedergewinnung 85 %) .

Beispiel E

/64-Formyllysin7-menschlisches-Proinsulin₃₁_₆₅-Acetat-Hydrat

488 mg Z-Arg(NO₂)-Arg-Glu-AlaGlu-Asp-(oBu)-Leu-Gln-NHNHBoc vom Schmelzpunkt 175 - 176 ° (Zersetzung) in 5 ml Trifluoressigsäure läßt man 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen und gibt wasserfreien Äther zu. Das erhaltene Hydrazid wird durch Filtrieren gesammelt, mit Äther gewaschen und über KOH im Vakuum getrocknet. Man löst das Hydrazid in 10 ml Dimethylformamid und 0,17 ml 6 nHCl in Dioxan. Die Lösung wird auf -15⁰C gekühlt und 0,3 5 ml 10 %iges Isoamylnitrit in Dimethylformamid werden zugesetzt. Nach 3 Minuten wird die erhaltene Azidlösung durch Zugabe" von Triäthylamin auf pH 7,5 eingestellt und sie wird zur Lösung von 120 mg _j^64-FormyllysinJ-proinsulin_3g_₆₅ in 10. ml Dimethylformamid und 2 ml Hexamethylphosphortriamid bei -10 ° zugegeben.

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Man rührt die Mischung 24 Stunden bei 4⁰C und dampft das Lösungsmittel ein. Der Rückstand wird auf dieselbe Weise wie bei der Herstellung von /j64-FormyllysinJ-Proinsulin_3g_₆₅ beschrieben behandelt. Die Mischung der Produkte wird 48 Stunden in 50 ml 50 %iger Essigsäure über Pd hydriert. Dor Katalysator wird durch Filtrieren entfernt und das Lösungsmittel wird im Vakuum eingedampft. Man löst den Rückstand in 5 ml 50 %iyer Essigsäure und gibt die Lösung auf eine Säule von Bio-Gel-P-6 (3,0 χ 180 cm).■Man sammelt einzelne Fraktionen von jeweils 10g. Die Fraktionen Nr. 32-50 werden vereinigt und das Lösungsmittel wird konzentriert. Der Rückstand wird lyophilisiert, Dieses Material wird durch CM-Sephadex Säulenchromatocjraphio weiter gereinigt. Das in 3 00 ml Wasser gelöste lyophilisiorte Material wird auf eine CM-Sephadex C-25 Säule (2,5 χ 5 cm) aufgegeben, die mit 200 ml Wasser gewaschen und mit 500 ml 0,02 m Ainmoniumacetat eluiert wird. Man sammelt einzelne Fraktionen von jeweils 10 g und ermittelt den Aufenthaltsort des Peptids durch Sakaguchi- Chlortests. Die das gewünschte Material enthaltenden Eluate werden vereinigt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand wird mit einem kleinen Volumen Wasser lyophilisiert und mit Bio-Gel-P-6 entsalzt. Ausbeute 150 mg;//*^⁹ -96,8° (c 0,58, 10 %ige Essig-

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ßäure) Rf 0,11, Rf 0,35, Aminosäureverhältnisse des sauren Hydrolysats Asp 1,04, Ser 1,78, Glu 7,88, Pro 2,05, GIy 6,84, AIa 3,07, VaI 2,06, Leu 6,04, Lys 0,98, Arg 3,03, NH₃ 4,28 (Wiedergewinnung 91 %)·

Beispiel F

H-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Sor-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys(F)-Arg-OH-Acetat-Hydrat ((/64-Formyllysiny-menschlisches-Proinsulin_3g_gc)

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603 mg Z-VaI-GIy-GIn-VaI-GIu(OBu)-LeU-GIy-NHNH-BoC [schmelzpunkt 253-4 ⁰C (Zersetzung), Rf¹ 0,77,Rf¹¹ 0,85, f^j^⁶ -32,1° (c 1,0 in DMF), Aminosäureverhältnisse im sauren Hydrolysat ^Glu2,02 ^Ο1^2,03 ^Val1,98 ^^eu0,96; ^Analy^se berechnet für C₄₇H₇₆ N₁₀O₁₄: C 56,2; H 7,6; N 13,9; gefunden C 55,9; H 7,5; N 14,Oj in 10 ml Trifluoressigsäure läßt man 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen und gibt wasserfreien Äther zu. Das erhaltene Hydrazid wird durch Filtrieren gesammelt, mit Äther gewaschen und über KOH im Vakuum getrocknet. Man löst das Hydrazid in 10 ml Dimethylformamid und 0,30 ml 6 nHCl in Dioxan, kühlt die Lösung auf -15° und gibt 0,82 ml 10 %iges Isoamylnitrit in Dimethylformamid zu. Nach 3 Minuten wird die Reaktionsmischung durch Zugabe von Triathylamin auf pH7,5 eingestellt und anschließend zu einer Lösung von 248 mg H-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys(F)-Arg(H⁺)-OH [Rf^T 0,14, Rf¹¹ 0,46, Mp⁹ -92,7° (c 0,74 in 10 %iger AcOH) , Analyse berechnet für ^c ₈4^H-i42^N26⁰28 ' ^2cH3^COOH· ^4H2° ^{:C 49}'³? ^{H 7} ' ⁴ '· ^N 17,4. Gefunden: C 49,5; H 7,5; N 16,9. Aminosäureverhältnisse im sauren Hydrolysat Se^ ^ GIu₃ ^ ^Pro^^G^ ^ ₉₍₎Ala_{2f 1} ^eU₃ ^ ^Lys., _{# Q2} ATg_{1 ni}J in 10 ml Dimethylformamid, 6 ml Hexamethylphosphortriamid und 0,06 ml Triathylamin bei -10° zugegeben. Man rührt die Mischung 24 Stunden bei 4° und dampft das Lösungsmittel ein. Der in 1-BuOH gelöste Rückstand wird sechsmal mit 2 %iger Essigsäure (mit 1-BuOH äquilibriert) gewaschen. Die 1-BuOH-Schichten werden vereinigt und eingedampft. Der Rückstand wird durch Zugabe von Äther verfestigt und der Feststoff wird durch Filtrieren gesammelt und getrocknet.

Die Mischung der Produkte wird 20 Stunden in 50 ml 50 Essigsäure über Pd hydriert. Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt und das Lösungsmittel wird im Vakuum eingedampft. Man löst den Rückstand in 10 ml 50 %iger Essigsäure und gibt die Lösung auf eine Säule von Bio-Gel-P-6 (0,148 bis 0,074 mm (100 - 200 mesh)) (4,0 χ 120 cm). Man sammelt einzelne Fraktionen von jeweils 15g. Der Aufenthaltsort des Peptids wird durch den Chlor-Tolidin-Test auf TLC bestimmt. Die Frak-

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tionen Nr. 26 - 39 werden vereinigt und das Lösungsmittel wird eingedampft. Den Rückstand lyophilisiert man mit einem kleinen Volumen Wasser. Ausbeute 251·.mg [^] -87,6° (c 0,25 in 10 %icjer Essigsäure)^ Rf 0,20/ Rf 0,55· Aminosäureverhältnisse im sauren Hydrolysat Ser ₁ ^ ^GIu_5# „Pro, _f ^GIy₇ ^ ^AIa₁ ^ ₉₂Val₂ ^

Lys,. _OQArg_{n a}_NH, (Wiedergewinnung 82 %) . u,yts u,y/ p^ ^g

Beispiel 1

Man löst.34 mg ZrTyr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-VaI-GIy-GIn-VaI-GIu-LeU-GIy-NH-NH₂ in einer Mischung von 6 mg Di methylformamid und 0,1 ml einer Lösung von 6 nHCl in Dioxnn und gibt nach dem Kühlen auf -15°C 0,03 ml Dimethylformamid, das 10 % Gew./Vol. Isoamylnitrit enthält, zu. Nach einer Minute wird die erhaltene Lösung mit Triäthylamin neutralisiert und wird dann zu einer Lösung von 30 mg H-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys(F)-Arg-OH< Acetat, gelöst in 5,0 ml Dimethylformamid bei -1O⁰C zugegeben.

Diese vereinigte Lösung wird 48 Stunden bei 4⁰C gerührt und das Lösungsmittel wird entfernt. Den Rückstand wäscht man mit Äthyläther und trocknet, wobei man rohes tyrosyliertes C-Peptid (3 5) mit Schutzgruppen erhält. Dieses Peptid gibt man zu 40 ml 50 %iger Essigsäurelösung und rührt die Mischung 48 Stunden bei Raumtemperatur im Wasserstoffstrom in Gegenwart von Palladiumschwarz. Dann wird die Reaktionsmischung filtriert, das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand wird getrocknet. Nach der Gelfiltration dieses Rückstands mit einer Sephadex G-50 Säule (2,5 χ 80) erhält man 23 mg reines tyrosyliertes C-Peptid (35), H-Tyr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys(F)-Arg-OH (tyrosyliertes / 64-Formyllysin/-menschlisches-Proinsulin₃₁_₆₅) . foC]^ -97,9° (C 0,21, 10 %ige Essigsäure).

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Dünnschichtchromatographie:

Rf 0,11 (Silicagel, 1-Butanol:Essigsäure:Wasser = 4:1:5) Rf 0,35 (Silicagel, Pyridin:Essigsäure:Wasser:1-Butanol= 20:6:24:30).

Aminosäureanalyse (6 η HCl, 11O⁰C 24 Stunden)

Es wird· gefunden, daß das Molverhältnis jeder Aminosäure in den theoretischen Identitätsbereich fällt. Die gefundenen Werte sind wie folgt: Asp 1,05, Ser 1,60, GIu 7,90, Pro 2,07, GIy 6,98, AIa 2,92, VaI 1,96, Leu 6,10, Tyr 0,93, Lys 1,10, Arg 2,98.

Beispiel 2

Zur Lösung von 15 mg H-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys(F)-Arg-OH, 7 ml Dimethylformamid, 0,7 ml destilliertem Wasser und 0,1 ml Triäthylamin gibt man 10 mg (Z)₂~Tyr·Trichlorphenylester und rührt die Mischung 40 Stunden bei 2O⁰C. Nach Entfernung des Lösungsmittels wird der Rückstand mit Äthyläther gewaschen und getrocknet, der Rückstand wird in 20 ml 50 %iger Essigsäure gelöst und die Mischung wird 48 Stunden in Gegenwart von Palladiumschwarz gerührt, wobei man 13 mg rohes tyrosyliertes C-Poptid (3 5) mit einer Formylgruppe am Lysinrest erhält. Es wird in 1 ml 50 %iger Essigsäure gelöst und die Lösung wird mit dor Sephadex G-50 Säule (2,5 χ 80) gelfiltriert, wobei man gereinigtes tyrosyliertes j_64-FormyllysinJ -menschlisches-Proinsulin ₃, ₆₅ erhält. Die Charakteristika dieses Produkts sind beinahe identisch mit dem in Beispiel 1 erhaltenen Produkt.

Beispiel 3

Man löst 500 Mikrogranun ^g) tyrosyliertes menschlisches C-Pep-

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tid in 1 ml Wasser und jodiert 3 μΐ der Lösung mit 2 mCi

J gemäß der Methode von Hunter und Greenwood. Das erhaltene

J-tyrosylierte ^64-FormyllysinJ-menschliche-Proinsulin^₁__fi5 wird mit der Bio-Gel P 30 Säule (50 χ 1 cm) unter Verwendung von 3 m Essigsäure als Eluiermittel gelfiltriert. Die Radioaktivität jeder Fraktion wird gezählt und mehrere Fraktionen, die den Aktivitätspeak aufweisen, werden gesammelt. Die Fraktionen werden vereinigt und für die radioimmunologische Untersuchung verwendet. Man beobachtet ungefähr 100 mCi/mg Radioaktivität.

Immunologische Untersuchung

Zur Bestimmung von C-Peptid im Serum unter Verwendung von radioaktivem jodiertem tyrosyliertem C-Peptid (35) wird die folgende Methode durchgeführt. Zuerst löst man 1,0 mg menschliches C-Peptid(35) in 1,0 ml 0,9 %iger NaCl-Lösung und suspendiert dann in 1,0 ml vollständigem Freund¹schem Adjuvans. Dieses Mittel wird 4 Kaninchen subkutan injiziert. Vier Wochen nach der Injektion wird die zweite Immunisierung auf dieselbe Weise wie oben beschrieben mit 0,5 mg C-Peptid (3 5) gegeben und die Immunisierung wird drei- oder viermal durchgeführt. 10 Tage nach der letzten Injektion wird das Blut gesammelt und anschließend wird das Antiserum erhalten. Man gibt in ein Reagensglas, das 0,5 ml 0,05. m Phosphatpuffer (pH 7,5, mit einem Gehalt von 0,5 % Rinderserumalbumin und 0,15 m Natriumchlorid) und 0,1 ml einer wäßrigen Lösung von 0,1 m ÄDTA enthält, 0,1 ml eines verdünnten Antiserums (1:10000) eines synthetischen C-Peptids (/64-FormyllysinJ-menschliches-Proinsulin₃-_g₅) zu.

Hierzu gibt man nacheinander 0,2 ml Serum von Patienten und

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0,1 ml einer wäßrigen Lösung von j-tyrosyliertem ^64-Formyl- lysinJ-menschlichem-Proinsulin-., gc. Nach gutem Mischen wird die Mischung 48 Stunden bei 4⁰C inkubiert.

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- 15 - M15/366

Zur erhaltenen Mischung gibt man 0,1 ml verdünntes normales Kaninchenserum und.0,1 ml verdünnten Ziegen-Antikörper zu Kaninchen· ^-Globulin. Nach gutem Mischen wird die Mischung 24 Stunden bei 4⁰C inkubiert. Anschließend wird sie 30 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert.

Nach Entfernung der überstehenden Flüssigkeit wird die Radioaktivität des Niederschlags unter Verwendung eines Gamma-Zählrohrs bestimmt. Die Konzentration an C-Peptid im Serum des Patienten wird direkt·aus der zuvor aufgestellten Dosis-Ansprechkurve abgelesen.

Die Dosis-Ansprechkurve (Standardkurve) wird nach folgendem Vorfahren aufgestellt. Standardlösungen eines synthetischen C-Peptids (beispielsweise /64-FormyllysinJ-menschliches-Proinsulin₃₁.55) werden beim obigen Verfahren anstelle von Patientenserum verwendet. Die Zählung (oder prozentuale Zählung) wird auf der Ordinate aufgetragen und die Konzentration der Standardlösung wird auf der Abszisse (logarithmischer Maßstab) von halblogarithmischem Sektionspapier aufgetragen.

Kurze Erläuterung der Zeichnung:

Fig. 1 zeigt die Dosis-Ansprechkurve von synthetischem I 64-Formyllysin7-menschlichem-Proinsulin^₁ ,_R und Steiner'schem

ITC J I —UJ

C-Peptid unter Verwendung von J-tyrosyliertem /64-Formyllysin7-menschlichem-Proinsulin^j.gc/ das. erfindungsgemäß erhalten wurde. Beide Ansprechkurven stimmen miteinander überein.

Die Fig. 2 und 3 zeigen die Herstellung der-Ausgangsmaterialicn und die Verbindungen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind.

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Claims (7)

- 16 - M/15 366 PAT.E NTAN-SPRÜCHE

1. Peptid mit der Aminosäuresequenz

Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg

und sein Formylderiva't am Lysinrest.

2. Peptid mit der Aminosäuresequenz

Tyr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg

und sein Formylderivat am Lysinrest.

3. Radiojodiertes Peptid mit der Aminosäuresequenz Tyr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg

und sein Formylderivat am Lysinreet.

4. Radiojodieres Peptid gemäß Anspruch 3, worin das radioaktive Jod ¹²⁵J ist.

5. Verfahren zur Herstellung des radioaktiven jodierten Peptids gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Peptid mit der Aminosäuresequenz Tyr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg

worin der Lysinrest eine Formylgruppe tragen kann, mit radioaktivem Jod jodiert.

6. Verfahren zur Herstellung des Peptids gemäß Anspruch 2,

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dadurch gekennzeichnet, daß man einen aktivierten Tyrosinester umsetzt mit dem Peptid der Aminosäuresequenz Tyr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu- Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg oder seinen Formylderivaten am Lysinrest.

7. Verfahren zur Herstellung des Peptids gemäß Anspruch 2, dadurch, gekennzeichnet, daß man ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Z-Tyr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Glyumsetzt mit einem Peptid der Aminosäuresequenz Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-OH
oder seinem Formylderivat an der Lysingruppe,

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L e e r s e i t e