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Verfahren zur Bestimmung der Gesamt-Eisenbindungskapazität von Blusserum"
Priorität: 16. Juni 1972, Japan, Nr. GO 238/72 Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Bestimmung der Gesamt-Eisenbindungskapazität (im folgenden GE3K) des Blutserumproteins.
Der Organismus und insbesondele das Blutserum enthalten ein spezielles Serumprotein,
sogenanntes "Transferrin", das eine spezifische Fähigkeit zur Bindung von Eisen
besitzt. Die Bestimmung der Gesamtbindungskapazität ist vor allem in der klinischen
Diagnostik von besonderer Bedeutung Normales Transferrin ist teilweise mit Eisenionen
gesättigt; die gebundene Eisenmenge wird als Serumeisen bezeichnet. Man kann jedoch
Transferrin mit weiteren Eisenionen sättigen, wobei die zusätzlich gebundene Eisenmenge
als ungesättigte Eisenbindungskapazität (im folgenden UEBK) bezeichnet wird. Die
GEBK ist somit die Summe aus Serumeisen und UEBK.
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Zur Bestimmung der GEBK sind verschiedene Methoden bekannt, z.B. die
in der US-PS 3 7Q9 985 beschricbene Methode von Burke und die in Nippon Ketsueki
Gakukai Zasshi,- Bd. 33 (1970), S. 555 bis 559 und in Journal of Nuclear Medicine,
Bd. 12,(1971) S. 489 bis 492 beschriebene Methode von Sato.
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Bei der Methode von Burke versetzt man das Blutserum mit Salzsäure
und absorbiert die freigesetzten Ionen des Serumeisens mit Calciumcarbonat. Das
erhaltene Serum wird d dann mit radioaktivem Eisen gesättigt und hierauf mit einem
Ionenaustauscherharz versetzt. Das Gemisch wird inkubiert wid seine Anfangsradioaktivität
gemessen. Anschließend trennt man das Austauscherharz vom Gemisch ab, wäscht es,
und misst seine Radioaktivität.
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Bei Anwendung der Burke-Nethode zeigt sie jedoch überraschenderweise,
daß höhere GEBK-T:.erte erha]ten werden; vgl. Beispiel 2.
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Auch bei Verwendung eines Ionenaustauscherharzes anstelle von Calciumcarbonat
lassen sich höhere als die exakten GEBK-Werte nicht vermeiden, so daß das Verfahren
nicht zufriedenstellen kann; vgl. Beispiele 2 und 3.
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Bei der Methode von Saito werden die Eisenionen durch Behandeln des
Serums mit einer Ascorbinsäurelösung freigesetzt und anschließend mit Hilfe eines
Ionenaustauscherharzes vom Serum abgetrennt. Hierauf versetzt man das Serum mit
radioaktiven Eisenionen und mißt die Anfangsradioaktivität des Gemisches. Nicht
gebundene Eisenionen werden mit Hilfe eines Ionenaustauscherharzes vom Gemisch abgetrennt,
und die Restradioaktivität des Serums wird bestimmt. Obwohl die Methode £rn.it brauchbar
ist,
liegen die GEBK-Werte bei Verwendung einer bereits vor längerer
Zeit hergestellten Ascorbinsäurelösung beträchtlich höher, als die nach anderen
klassischen Methoden ermittelten Werte, so daß die exakten GEBK-Werte nicht bestimmt
werden können; vgl.
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Beispiel 1. Als klassisches Verfahren zur Messung des GEBK-Werts ist
z.B. das kolorimetrische Verfahren mit Vathophenanthrolin zu nennen; vgl. W.N.M.
Ramsey, Clin. Chim. Acta, Bd. 2 (1957), 5. 221 bis 226. Bei der klinischen Messung
des GEBK-Werts ist es jedoch besonders im Hinblick auf den Umgang mit radioaktiven
Substanzen bzw. die schnelle und rechtzeitige Durchführung der Messung wünschenswert,
bereits vorfabrizierte Reagentien einzusetzen.
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Bei genaueren Untersuchungen der Saito-Methode wurde gefunden, daß
der Anstieg der gemessenen GEBK-':'erte vermutlich auf die Instabilität der vorher
hergestellten, wäßrigen Ascorbinsäurelösung zurückzuführen ist.
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Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein verbessertes Verfahren zur
Bestimmung der Gesamt-Eisenbindungskapazität von Blutserum zu schaffen, bei dem
die verwendeten Reagentien auch nach längerer Lagerung exakte GEBK-Verte liefern.
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Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Bestimmung der
Gesamt-Eisenbindungskapazität von Blutserum, bei dem man durch Behandeln der Serumprobe
mit einer wäßrigen Lösung einer organischen Säure, z.B. Citronensäure, Malonsäure,
Weinsäure, Äpfelsäure, Maleinsäure oder Oxalsäure, das Serumeisen abdissoziiert,
die freigesetzten Eisensionen mit Hilfe eines
Ionenaustauscherharzes
vom Serum abtrennt, das so erhaltene Serum mit überschüssigen radioaktiven Eisenionen
versetzt, die Anfangsradioaktivität des Gemisches mißt, die nicht an das Transferrin
gebundenen Eisenionen mit Hilfe eines Ionenaustauscherharzes aus dem Gemisch entfernt,
die Radioaktivität des überstandes mit Hilfe eines Scintillationszählers mißt und
dann den GEBK-Wert aus der Anfangsradioaktivität und der Restaktivität des überstands
errechnet.
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Das Verfahren der Erfindung ergibt exakte und gleichbleibende GEBK-Werte,
auch wenn vorher hergestellte und über längere Zeit gelagerte Lösungen der organischen
Säuren verwendet werden.
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Damit die an das Serumprotein gebundenen Eisenionen reversibel abdissoziieren,
ist es erforderlich, durch Zusatz einer geeigneten Menge der genannten Siuren den
pH-Telert des Serums auf einen Wert von etwa 4,5 einzustellen, bei dem das Serum
die Fähigkeit zur reversiblen Eisenbindung besitzt. Z.B. kann man 1 ml der Serumprobe
mit etwa 1 ml einer 0,6prozentigen wäßrigen Weinsäurelösung, einer 0,6prozentigen
wäßrigen Äpfelsäurelösung, einer 0,7prozentigen wäßrigen Maleinsäurelösung oder
einer 0,4prozentigen wäßrigen Oxalsäurelösung versetzen. Die Prozentangaben beziehen
sich hierbei auf Gramm Säure/100 ml Wasser.
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In der praktischen Anwendung werden die Lösungen der organischen Säuren
vorgefertigt und auf Vorrat gehalten; man kann die Losungen auch zusammen mit den
nachstehend genannten lonenaustauscherharzen vorfertigen,welche die vom Transferrin
abdissoziierten Eisenionen aufnehmen. Spezielle Beispiele für geeignete
Ionenaustauscherharze
sind Kationenaustauscher, wie Amberlit CG-120 Typ 3, und Anionenaustauscher, wie
Amberlit CG-400 Typ 1 und Amberlit 1RP67, bzw. deren Gemische. Die Austauscher liegen
als Pulver, Granulat oder in Streifenform vor.
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Als Quelle für radioaktive Eisenionen können beliebige radioaktive
Eisensalze verwendet werden, die einen geringen Eisen ionenüberschuß gegenüber dem
GEBK-Wert des Serums (üblicher Maximalwert: etwa 5 pgZml) liefern. Vorzugsweise
verwendet man Eisen (59Fe)(III)-ammoniumcitrat in einer Konzentration von 1 Fig
Fe/ml. Zur einfacheren Anwendung kann die radioaktive Eisenlösung vorher mit Natriumcarbonat
kombiniert und auf Vorrat gehalten werden, das die Bindung der radioaktiven Eisen
ionen an das Serumprotein fördert, indem es das entstehende saure Serum neutralisiert.
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In den folgenden Beispielen ist die Überlegenheit des erfindungsgemäßen
Verfahrens gegenüber den Methoden von Saito und Burke erläutert. Der Prozentgehalt
der Lösungen ist ausgedrückt in g des gelösten Stoffes/100 ml Lösungsmittel.
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Beispiel 1 Es werden folgende Reagentien hergestellt: Lösung A Jeweils
1 ml einer 0,6prozentigen wäßrigen Citronensäurelösung, einer 0,6 prozentigen wäßrigen
Weinsäurelösung, einer 0,6 prozentigen wäßrigen Äpfelsäurelösung, einen O,7prozentigen
wäßrigen Maleinsaurelösung und einer 0,4prozentigen waßrigen Oxalsäurelösung werden
mit 0,15 g cines Ioc.naustauscherharzes
"Amberlit CG-400-Typ 1 versetzt
und in einer Vorratsflasche gehalten.
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Lösung B 3 ml einer radioaktiven Eisen (59 Fe) (III)-ammoniumcitrat-Lösung
mit einer Eisenkonzentration von 1 yig Fe/ml, deren pH-Wcrt mit Natriumbicarbonat
auf 8,5 eingestellt ist.
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Lösuna C 1,8 prozentige wäßrige Ascorbinsäurelösung.
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Austauscherharzstreifen D Ein Streifenblatt enthält 57,5 mg Amberlit
IRA-400.
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Austauscherharz E 0,2 g Amberlit CG-120-Typ 3''.
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Es wird 1 ml einer Serumprobe verwendet, deren GEBK-Wert nach der
Vathophenanthrolin-Methode zu 346 µg/100 ml bestimmt; worden ist.
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Bei der Bestimmung wird folgendermaßen Verfahren: 1 ml des Serums
wird zu 1 ml der Lösung A gegeben und 15 itinuten bei Raumtemperatur unter Rühren
inkubiert. Hierauf zentrifugiert man die Lösung 10 Minuten bei 3030 U/min, gibt
1 nil des Überstands unter Rühren zur Lösung B und läßt das Gemisch 20 Minuten bei
Raumtemperatur stehen. Während dieser Behandlung wird die Radioaktivität der Lösung
mit Hilfe eines äbli
chen Scintillationszählers (N1, Hz) gemessen.
Anschließend wird ein Blattstreifen D mit der Lösung getränkt, auf einen Drehtisch
gelegt und 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation entfernt
man den Streifen D und mißt die Radioaktivität der Testlösung mit einem Scintilationszahler
(N2 Hz).
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N2 GEBK - Wert = # x 3* x 200 (µg Fe/100 ml) N1 * Menge der Eisenionen
in Lösung B (µg/3 ml) Bei der Saito-Methode wird zum Vcrgleich das beschriebene
Verfahren wiederholt, wobei jedoch anstelle der Lösung A die Lösung C und das Austausclzerharz
E verwendet wird. Hierbei lassen sich beim Vergleich der beiden nach dem Verfahren
der Erfindung erzielten Testergebnisse (Lösung A) mit dem Kontrollwert (Lösung C
und Austauscherharz E) erhebliche Unterschiede in den GEBK-"erten im Verlaufe der
Zeit feststellen. Bei der Bestimmung mit 20 Tage alten Reagenslösungen A und C ergibt
z.B. der Versuch mit Lösung C um 35 bis 50 µg/100 ml höhere GEBK-Werte als der Versuch
mit Lösung A. Dieses Ergebnis zeigt, daß die Reagenslösung C nicht über längere
Zeit lagerfähig ist und keine exakten GEBK-Werte ergibt, so daß sie für die klinische
Anwendung nicht geeignet ist.
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Die Abhängigkeit der ermittelten GEBK-Werte vom Herstellungsalter
der Reagenslösungen A und C (Tage) ist in Tabelle 1 dargestellt.
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Tabelle I
| Zeitliche Abhängigkeit (Tage) des |
| Säure GEBK-Werts (µg/100 ml) |
| 0 5 10 15 20 |
| Ascorbinsäure * 348 356 364 371 383 |
| Malonsäure 350 349 346 339 340 |
| Weinsäure 345 334 344 335 334 |
| Apfel säure 346 342 335 345 336 |
| Maleinsäure 336 327 335 326 333 |
| Oxalsäure 357 356 353 347 348 |
| Citronensaure 337 341 349 340 339 |
* Saito-Methode I3eispiel 2 Die GEBK-'Verte von 10 verschiedenen Serumproben werden
auf folgende Weise ermittelt: 1,0 ml der Serumprobe werden mit 0,5 ml 0,06 n Salzsäure
oder 1 n Salzsäure bzw. 1,0 m Citronensäure versetzt. Das Gemisch wird 5 Minuten
bei 23 0C inkubiert und hierauf mit 0,5 g eines Absorptionsmittels (Calciumcarbonat
oder Ionenaustauscherharz) versetzt. Das erhaltene Gemisch wird dann 5 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend versetzt man im Falle der Verwendung von
Salzsäure mit 0,5 ml eines 0,2 n Trispuffers und zentrifugiert das erhaltene Gemisch
15 Minuten bei 3000 U/min. 1,0 ml des Überstands werden entnommen und mit 1,0 ml
Eisen(59Fe)(III)-ammoniumcitrat versetzt. Nach 10minütiger Inkubation vermengt man
das Gemisch mit einem Ionenaustauscherharz "Amberlit IRA-400". Nach weiterer 1 stündiger
Inkubation bei 450C wird die Gesamtradioaktivität des erhaltenen Gemisches gemessen
(Totalzählung: T). Man wäscht das Austuscher
harz mit voll entsalztem
Wasser und mißt dessen Radioaktivität (Austauscherzählung: S).
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Der GEBK-Wert errechnet sich nach folgender Gleichung: GEBK(µg/100ml)=(1
- S x t) x Fe(µg) x 200 x a T in der a im Falle der Verwendung von Calciumcarbonat/Salzsäure
den Wert 0,94 und t den Wert 1,15 annimmt.
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Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt: Tabelle
II
| GEBK-Wert (µg/100ml) |
| Serum- |
| 0,6% Citronen- in HCl 0,006 n HCl |
| probe |
| säure CaCO3 ** "Amberlit CG-120" |
| "Amberlit CG-400" |
| 1 358 913 |
| 2 343 941 |
| 3 273 915 |
| 4 273 984 |
| 5 384 956 |
| 6 389 956 |
| * 7 361 937 |
| 8 349 325 |
| 9 528 480 |
| 10 359 309 |
* : Probe Nr. 7 ist ein handelsübliches Serum ("Monitrol" der Dade Co., USA ) mit
einem angegebenen GEBK-Wert von 376; **: Burke-Methode.
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B e i s p i e 1 3 Die GEBK-Werte zweier verschiedener Serumproben
werden auf folgende Weise ermittelt: 1,0 ml der Serumprobe werden mit 0,5 ml 1 n
Salzsäure oder 1,0 ml einer 0,6prozentigen Citronensäure versetzt. Die Lösung wird
mit 0,) g eines Ionenaustauscherharz-Absorbens "Amberlit-CG-400" oder "Amberlit-CG-120"
vermengt. Im Falle der Verwendung von Salzsäure wird das Gemisch dann mit O>5
mi Wasser versetzt. Man rührt das erhaltene Gemisch 15 Minuten und zentrifugiert
es dann 10 Minuten b- 3000 U/min. 1,0 ml des Überstands werden entnommen und mit
@@ ml einer Eisen-(59Fe) (III)-ammoniumcitrat-Lösung mit einer Eisenkonzentration
von 2,47 µg/ml versetzt. Hierauf mißt man die Rtadioaktivität der Lösung (N1), versetzt
die Lösung - im Falle der Verwendung von Salzsäure in der ersten Stufe - mit 1,4
ml eines 0,2 n Trispuffers bzw. - im Falle der Verwendung von Citronensäure - mit
1,0 ml einer 2prozentigen Natriumbicarbonatlösung und füllt mit Wasser auf 4,0 ml
auf. Die erhaltene Lösung wird 20 Minuten stehengelassen, dann mit 0,5 g eines Ionenaustauscherharzes
("Amberlit-CG-400") versetzt, 15 Minuten gerührt und schließlich 10 Minuten bei
3000 U/min zentrifugiert. Man entnimmt 2 ml des Überstands und mißt deren Radioaktivität
mit einem üblichen Scintillationszäher (N2). Der GEBK-Wert errechnet sich nach folgender
Gleichung: 2(N2 - Nb) GEBK (µg/100ml) = # . 2,47 Fe(µg) x 200 N1 - Nb wobei Nb die
Untergrundzählung bedeutet.
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Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle III wiedergegeben.
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Tabelle III
| GEBK-Wert (µg/100ml) |
| 0,6% Citronensäure 1 n HCl 1 n HCl |
| "Amberlit CG-400" "Amberlit CG-400" "Amberlit CG-120" |
| 1 276 209 246 |
| 2 279 209 245 |