DE2318902A1 - 2,2'-anhydro-1-beta-d-arabinofuranosyl5-fluorocytosin und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Description

• 2,2'-Anhydro-1-ß-D-arabinofuranosyl-5-fluorocytosin und Verfahren zu seiner Herstellung Die Erfindung betrifft 2,2'-Anhydro-1-ß-D-arabinofuranosyl-5-fluorocytosin und Verfahren zu seiner Herstellung, und sie bezieht sich insbesondere auf eine Zusammensetzung, die als wirksames Mittel gegen Leukämie brauchbar ist Es ist berichtet worden, daß verschiedene Cytosin- und Uracil-Derivate von 1-p-D-arabinofuranose eine Aktivität gegen 5-fluorouracilresistente Mäuseleukämien zeigen. (Zum Zwecke der Abktirzung wird der Wortteil 1-p-D-arabinofuranosyl als "ara" abgekUrzt.) Es wurde zuerst gefunden, daß ara-cytosin gegen akute Myeloblasten-Leukämie anwendbar ist (Carey und Illison, Clin.
• Res., 13, 337 (1965), Evans, et al., Proc. Soc. Exptl.
• Biol. Med., 106, 350, (1961)) und daß auch ara-5-fluorocytosin (Fox, et al., J. Med. Chem., 9, 101, (1966)) und ara-5-fluorouracil (Yung, et al., J. Am. Chem. Soc. 83, 4060, (1961)) gegen transplantierte Mäuseleukämien wirksam sind.
• Es ist kUrzlich berichtet worden (Hoshi, et al., Gann, 62, 145 (1971)), daß 2,2'-Anhydro-ara-cytosin bei hohen Dosen gegen die Mäuseleukämie L1210 wirksam ist.
• 2,2'-AnhydroZ D-arabinofuranosyl-5-fluorocytosin (2,2'-Anhydro-ara-5-fluorocytosin) wird durch die Dehydrierung von 5-Fluorocytidin mit Phosphorylchlorid in Dimethylformamid hergestellt. Das entstehende, in der Form des Formatsalzes vorliegende Produkt besitzt eine wesentlich höhere Wirksamkeit gegen Mäuseleukämie L1210 und ihre mercaptopurinresistente Abart L1210/6-MP als die betreffenden bekannten Verbindungen bei einer vorgegebenen Dosis.
• Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird als Ausgangsmaterial 5-Fluorocytidin verwendet, das durch Reaktion von 5-Fluorocytosin und Tri-O-benzoyl-D-ribofuranosylchlorid unter Verwendung von Mercuricyanid/Nitromethan als Kondensatiönsmittel hergestellt wird. Dies entspricht dem Verfahren von Yamaoka et al., (J. Org; Chem. 30, 149, 1965), modifiziert durchWatanabe und Fox (J. Heterocyclic Chem., 6, 109, 1969).
• Die Verbindung der vorliegenden Erfindung zeigt in der Form des Formates in vivo Wirksamkeit gegen Leukämie 1.1210 und die 6-MP-resistente Unterst L1210/6-MP-bei Mäusen. (6-MP-resistant subline L1210/6 MP) Anhydro-ara-5-fluorocytosin wird aus 5-Fluorocytidin durch eine Anpassung des Verfahrens von Kigugawa und Ichino (J. Org. Chem., 37, 284, 1972) synthetisiert. Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Dehydrierungsmittel in einem geeigneten polaren, keine Hydroxylgruppen enthaltenden Lösungsmittel hergestellt. Unter den bevorzugten Lösungsmitteln sind Alkyl-Alkanoylamide, geeignet niedrige-Alkyl-niedrige-Alkanoylamide, geeignet Di-niedrige-alkylniedrige-alkanoylamide (dilower alkyl lower alkanoylamides) und am meisten vorzugsweise Dimethylformamid. Es wird bevorzugt, als Dehydrierungsmittel ein Phosphorylhalogenid,geeigneterweise Phosphorylchlorid, zu verwenden.
• Bei dem Verfahren wird trockenes 5-Fluorocytidin in dem gewählten Lösungsmittel, geeigneterweise in Dimethylformamid, aufgenommen, und dann wird das vorher hergestellte Dehydrierungsmittel dazugegeben. Es ist als geeignet gefunden worden, einen wesentlichen Uberschuß an Dehydrierungsmittel zu verwenden. Ein molares Verhältnis von etwa 10 Mol Dehydrierungsmittel pro Mol Fluorocytidin ist als geelgnet gefunden worden.
• Die Reaktionsmischung wird etwa 1 bis etwa 5 Stunden, geeignetarweise etwa 3 Stunden, bei Raumtemperatur gerührt und dann abgekühlt. Es wurde als wünschenswert gefunden, die Reaktionsmischung dadurcn abzukühlen, daß sie über eine beträchtliche Menge Bis gegossen wird. Ein Verhältnis von etwa 100 g Eis/g anfänglich eingegebenes 5-Fluorocytidin ist als geeignet gefunden worden. Die Mischung darf dann etwa 2 bis etwa 5 Stunden, geeigneterweise 3 Stunden, stehen, und das so erzeugte 2,2'-Anhydro-ara-5-fluorocytosin in Form von Hydrochlorid kann dann von der Reaktionsmischung abgetrennt werden.
• Es wurde als wüne. enswert gefunden, die Reaksionsmischung durch Ionenaustauschchromatographie zu reinigen. Geeigneterweise wird das Harz in der Säureform verwendet, z.B. kann eine Säule aus Dowex-50-Harz (Pyridiniumform) verwendet werden.
• In der bevorzugten Art der Isolierung wird die Reaktionsmischung in eine cTIrlnatographische Säule gegeben, die das bevorzugte Ionenaustauscherharz enthält, und die Säule wird mit Wasser und sehr verdünntem, geeigneterweise 0,1M Pyridiniumformat gespült. Es werden etwa 5 Säulenvolumen Wasser und 5 Säulenvolumen Pyridiniumformat verwendet. Die Chromatographie wird dann unter Verwendung einer etwas stärkeren Lösung aus Pyridiniumformat (0,5M ist bevorzugt) forgesetzt.
• Die Eluate, geeigneterweise etwa 10 Säulenvolumen, werden gesammelt, mit Ameisensäure auf einen geeigneten pH-Wert eingestellt, vorzugsweise zwischen etwa 3,5 und 4,0, am besten geeignet 3,8, und die Lösungsmittel werden entfernt, geeigneterweise durch Verdampfen unter verringertem Druck.
• Die Restbestandteile werden dann gereinigt, vorzugsweise durch Pulverisierung in Gegenwart geeigneter Lösungsmittel.
• Es ist gefunden worden, daß Pulverisierung mit einem Halogenkohlenwasserstofflösungsmittel wie z.B. Chloroform geeignet ist. Es wird ein Niederschlag erzeugt, der ispliert wird und weiter pulverisiert wird, zuerst mit dem gleichen Halogenkohlenwasserstofflösungsmittel und dann mit Äther. Das entstehende Produkt ist das kristalline Formatsalz von 2,2'-Anhydro-ara-5-fluorocytosin, das weiter durch Rekristallisation von Methanol gereinigt werden kann.
• Alternativ dazu kann das Produkt durch Absorption des rohen Formates auf einer sauren Ionenaustauscherharzsäule wie z.B.
• IRC 50 (H+), mit nachfolgender Elution mit Ameisensäure, geeigneterweise 0,3M Ameisensäure, gereinigt werden.
• Die von dem Erfinder beabsichtigten Arten zumlAusführen der Erfindung schließen pharmazeutische Zusammensetzungen und die zur Verabreichung derselben notwendigen Verfahren ein.
• Lösungen des prinzipiell wirksamen Bestandteiles können in Wasser oder geeignet verdünntem Wasser hergestellt werden, wobei das Wasser z.B. mit Äthanol, Glycerin, eßbaren Polyolen (z.B. Glycerin, Polyäthylenglykolen, Propylenglykol) und dgl.
• verdünnt ist. Dispersionen können in Glycerol, flüssigen Polyäthylenglykolen und Mischungen derselben und in Ölen hergestellt werden.
• Unter üblichen Lagerungs- und Verwendungsbedingungen enthalten diese Präparate ein Schutzmittel, um Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
• Wie oben angegeben worden ist, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen in Formen vorliegen, die für Injektionszwecke geeignet sind und die sterile wäßrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die unvorhergesehene Zubereitung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen enthalten. In jedem Fall muß die Form steril sein, und sie muß in dem Maße fluid sein, daß eine leichte Spritzfähigkeit besteht. Sie muß unter Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein und muß gegen die Verunreinigungswirkung von Mikroorganismen wie z.B. Bakterien und Pilze geschützt sein Das Grundlösungs- oder Dispersionsmedium kann Wasser, Äthanol, Polyole (z.B. Glycerol, Propylenglykol und flüssiges Polyäthylenglykol und dgl-. ), geeignete Mischungen derselben und pflanzliche Öle enthalten. Die gute Fluidität kann erhalten werden z.B. durch die Verwendung einer Beschichtung wie z.B. Lecithin, durch das Einhalten der erforderlichen Teilchengröße im Falle von Dispersionen und durch die Verwendung von Surfactants (z.B. ein Kondensationsprodukt von Äthylenoxid mit Fettsäuren oder fettigen Alkoholen, partiellen Estern von Fettsäuren und einem HexibBnhydrid und Polyoxäthylenkondensationsprodukte von den Estern). Der Schutz gegen die Wirkung von Milcroorganismen kann- durch verschiedene antibakterielle und fungizide Mittel erreicht werden, z.B. durch Parabens, Chlorobutanol, Benzylalkohol, Phenol, Sorbinsäure, Themerosal und dgl. In vielen Fällen ist es vorzuziehen, isotonische Mittel, z.B. Zucker oder Natriumchlorid, einzuschließen. Verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung von Mitteln, die die Absorption verzögern, z.B. Aluminiummonostearat und Gelatin, in den Zusammensetzungen erreicht werden.
• Sterile injizierbare Lösungen werden dadurch hergestellt, daß der wirksame Grundbestandteil in der erforderlichen Menge in das geeignete Lösungsmittel mit verschiedenen anderen, oben aufgeführten Ingredienzien, wie sie erforderlich sind, einverleibt wird, worauf Filtersterilisation folgt. Im allgemeinen werden Dispersionen hergestellt, indem der vorher sterilisierte wirksame Bestandteil in einen sterilen Träger (vehicle) einverleibt wird, der das Grunddispersionsmedium und die erforderlichen anderen Ingredienzien, die aus den oben angeführten ausgewählt sind, enthält.
• Für den Fall, daß sterile Pulver für die Herstellung steriler injizierbarer Lösungen hergestellt werden sollen, ist das bevorzugte Herstellungsverfanren das Gefriertrocknungsverfah-l ren, das ein Pulver aus dem aktiven Bestandteil plus beliebi -gen zusätzlichen gewünschten Ingredienzien aus einer vorher sterilen filtrierten Lösung derselben liefert. Die Pulver können ebenfalls durch die Verwendung eines Gases, B. Xthylenoxid, sterilisiert werden und anschließend mit den erforderlichen zusätzlichen ingredienzien und in der richtigen Teilchengröße in das Grundpulver inkorporiert werden, um es später mit der gewünschten, zeitweilig getrennten Flüssigkeit, die ihrerseits natürlich steril sein muß, wieder aufzulösen.
• Wirksame Zusatzingredienzien können ebenfalls in die erfindungsgemen Zusammensetzungen inkorporiert werden.
• Es ist insbesondere vorteilhaft, die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur Erleichterung der Verabreichung und zur Gleichmäßigkeit der Dosierung in Form von Dosierungseinheiten zu formulieren. Die in der Beschreibung und in den Ansprüchen angegebenen Dosierungseinheiten beziehen sich auf nach physischen Gesichtspunkten abgetrennte Einheiten, die als einheitliche Dosen für das zu behandelnde Tier oder das menschliche Wesen geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorherbestimmte Menge an wirksamem Material enthält, das so berechnet ist, daß es in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger den gewünschten therapeutischen Effekt bewirkt. Die Spezifikationen für die neuartigen Formen der Dosierungseinheiten gemäß der Erfindung werden bestimmt durch und hängen direkt ab von: (a) den einzigartigen Eigenschaften des wirksamen Materials und dem besonderen therapeutischen Effekt, der erreicht werden soll, und (b) den Einschränkungen, die in der Technik liegen, die zum Vermischen eines derartigen wirksamen Materials für die Behandlung von Krankheiten an lebenden Wesen verwendet wird, welche sich in einem kranken Zustand befinden, in dem die körperliche Gesundheit so geschwächt ist, wie es im einzelnen in dieser Beschreibung beschrieben ist, wobei dies Merkmale der vorliegenden Erfindung bildet.
• Die Dosierung des wirksamen Grundbestandteils zur Behandlung des angegebenen Zustands hängt von dem Alter, dem Gewicht und dem Allgemeinbefinden des zu behandelnden Einzelwesens, dem besonderen Zustand und dem Grad seiner Schwere, der besonderen Form des wirksamen Bestandteils und dem Weg der Verabreichung ab. Eine Dosis von etwa 1 bis 10 mg/kg kann einmalig oder in einzelnen kleineren Dosen pro Tag verabreicht werden.
• Der wirksame Grundbestandteil ist für eine passende Verabreichung in wirksamen Mengen mit einem geeigneten pharmazeutisch aufnehmbaren Träger in einer Dosierungseinheitsform, wie sie oben beschrieben worden ist, zusammengesetzt. Eine Dosierungseinheit kann den wirksamen Grundbestandteil in Mengen enthalten, die im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 mg/Einheit liegen. Ausgedrückt in Verhältnissen ist der wirksame Bestandteil etwa in 0,01 bis etwa 0,1 Gew.%/Vol.% (about 0.01 to about 0.1% w./v.) der flüssigen Zusammensetzungen vorhanden.
• Beispiel I Herstellung von 2,2'-Anhydro-ara-5-fluorocytosin Es wurde eine Mischung aus Phosphoroxychlorid (60 g) und Dimethylformamid (200 ml) hergestellt, die 30Minuten stehengelassen wurde. Zu dieser Mischung wurde eine Lö- / sung aus trockenem 5-Bluorocytidin (10 g) in Dimethylformamid (40 ml) hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und über Eis gegossen (1 kg). Die wäßrige Mischung wurde 3 Stunden lang stehengelassen, bis U.V. Absorption ein Band bei 268 nm unter gleichzeitigem Verschwinden des ursprünglichen Bandes bei 332 nm zeigte.
• Die wäßrige Lösung wurde durch eine Säule (20 x 9 cm) aus Dowex 50 (pyridinium form) geleitet. Die Säule wurde mit Wasser (3 1) und mit Pyridiniumformat aq. (3 1, 0,1 M, pH 4,8) gewaschen. Die Eluate wurden gesammelt und entnommen.
• Die Säule wurde dann mit Pyridiniumformat aq. (6 1, 0,5M) eluiert. Die Eluate wurden aufgesammelt und durch Zugabe von Ameisensäure auf einen pH-Wert von 3,8 eingestellt.
• Das Eluat wurde zu einem Sirup konzentriert, der in Gegenwart von Chloroform trituriert, d.h. pulverisiert, wurde. Der auf diese Weise gebildete Nieder-schlag wurde durch Filtrierung abgetrennt und weiter in Gegenwart von Chloroform und Äther trituriert und lieferte 2,2'-Anhydro-ara-5-fluorocytosin (5,7 g, 6o%) als das Format.
• Kristallisation von Methanol liefert reines Material.
• H,O U.V.-Spektrum:A max 229 und 268 nm (#8700 und 10900); H2O NHCl min 244 (495O):ax 229 und 268 nm (68400 und 10600); NHCl Amin 244 (4800)> kernmagnetische Resonanz (in D20): b 8,40 und 8,47 (2H, H-6 a, JF,6 = 4 Hz, überlappend HC02D s, entsprechend), 6,68 d (1H, H-1, J, 12, = 6 Hz), 5,63 d (1H, H-2'),~ 4,7 (HOD überlappend H-3'), 4,47 m (1H, H-4') und 3,61 (2H, H-5'a, H-5'b, Aufspaltung 3 Hz).
• Berechnet für C9H10FN304 f HCOOH: C, 41,50; H, 4,15; N, 14,52; gefunden C, 41-,35; H, 4,47; N, 14,54.
• Herstellung des~Ausgangsmat~rials Tri-O-benzoyl-5-fluorocytidin (21 g) wurde in einer Mischwung aus Benzol-Methanol (1:1, 600 ml) gerührt. Die Lösung wurde mit einer Natriummethoxidlösung (von 1 g Natrium in 100 ml Methanol) behandelt, und die Lösung wurde, nachdem sie 20 Minuten lang gerührt worden war, schnell durch eine vorher hergestellte mit Methanol gewaschene IRC-50 (20 bis 50 Maschen (mesh)große Säule (15 x 3,5 cm) geleitet. Die Säule wurde mit (300 ml) Methanol gewaschen, und die kombinierten neutralen Eluate wurden bis zur Trockenheit konzentriert. Es wurde eine nahezu quantitative Ausbeute an Roh-5-fluorocytidin erhalten, das physikalische Eigenschaften besaß, die ähnlich den vorher angegebenen waren.
• Tri-O-benzoyl-5-fluorocytidin wurde durch Kondensation gleicher Mengen von 5-Fluorocytosin mit Tri-O-benzoyl-D-ribofuranosylchlorid durch das Mercuricyanid/Nitromethanverfahren (Yamaoka, et al., J. Org. Chem. J2, 149, (1965); Watanabe und Fox, J. Heterocyclic Chem. 6, 109, (1969)) hergestellt.
• Das Verfahren, das zum Abschätzen der chemotherapeutischen Wirksamkeit des Produktes gemäß der vorliegenden Erfindung, gemessen an seiner Fähigkeit, die Überlebenszeit von Mäusen mit transplantierter Leukämie zu verläneern, ist das Verfahren von Burchenal et al., (Cancer 2, 113 (1949)).
• Die hier beschriebenen Experimente wurden mit Leukämien L1210 (14) und der 6-MP-resistenten Unterart L1210/6-MP in F1 Hybriden von C57BL/6 X DAB/2 Kreuz (BDF1) (F1 hybrids of C57BL/6 X DAB/2 cross (BDF1))durchgeführt. Die 6-MP-resistente Unterart wurde gewählt wegen ihrer erhöhten Empfindlichkeit auf ara-C und dessen Derlva-te, da diese kurzzeitig verfügbar waren Danach wurden Experimente mit einfachen i.p und p.o. Dosen an Hydro-ara-5-fluorocytosin an der geraden Linie von L1210 wiederholt und zeigten ähnliche Ergebnisse. Bei der Leukämie L1210/6-Mercaptopurin zeigte sich keine Erhöhung der Uberlebenszeit bei beliebigen tolerierbaren Dosen von 6-Mercaptopurin.
• Eine Million Leukämiezellen, die in 0,9,6iger NaCl-Lö.sung suspendiert waren, wurden i.p. (d.h. intraperitoneal) in jedes Tier inokuliert, wodurch eine aszitische Leukämie erzeugt wurde, die später zu einer allgemeinen Krankheit fortschritt. In einigen Experimenten wurden 250000 Zellen intrazerebral inokuliert. Die Mäuse wurden in zwei Gruppen zu jeweils 10 Tieren geteilt, und die Behandlung wurde 1 bis 2 Tage nach der Inokulation mit Leukämiezellen begonnen und einmal täglich fortgesetzt bis zu einer Gesamtmenge von 5 Dosen, wenn es nicht anders bemerkt ist.
• Alle Verbindungen wurden in 0,996iger NaCl-Lösung oder destilliertem Wasser gelöst oder in Carboxymethylzellulose in O,9%iger NaCl-Lösung suspendiert und i.p. injiziert oder p.o. (per os) durch Inkubation in Mäuse verabreicht, die die vorhergehenaen 16 Stunden lang gefastet hatten.
• Alle Mäuse wurden im Falle des Todes seziert und überlebende Mäuse wurden geopfert und nach 50 Tagen der Autopsie unterworfen.
• Ergebnisse Bei täglichen Dosen von 200 bis 300 mg/kg bewirkte Anhydroara-5-fluorocytosin bemerkenswerte Verlängerung der Uberlebenszeit von Mäusen, denen sowohl Leukämie L1210 als auch deren mercaptopurinresistente Abart L1210/6-Mercaptopurin eingepflanzt worden-war, Bei angenähert vergleichbar toxischen täglichen Dosen zeigte sich Anhydro-ara-5-fluorocytosin wirksamer als- ara-cytosin, ara-5-fluorocytosin, Anhydro-ara-cytosin ("cyclocytidin") oder arafluorouracil.
• Im Gegensatz zu ara-Cytosin, weniger toxisch und wenigcr wirksam durch eine einzige Dosis als durch tägliche Verabreichung und relativ unwirksam ist, wenn es p.o.
• verabreicht wird, ist Anhydro-ara-5-fluorocytosin als eine einzige i.p. oder p.o.-Dosis von 15QO mg/kg 24 bis 48 Stunden nach der Inokulation der Leukamiezellen wirksam, sogar oleich vorhergehende Studien gezeigt hatten, daß es jn normalen BDF1 Mäusen in einer viel größeren totalen Dosis toleriert wird, wenn 750 mg/kg i.p. täglich 5 Tage lang verabreicht werden. Die ursprünglichen Experimente mit Anhydro-ara-5-fluorocytosin wurden an Mäusen vorgenommen, die vorher 16 Stunden lang gefastet hatten, aber Jüngere Experimente haben gezeigt, daß es fast gleich wirksam ist, wenn es per os an Mäuse verabreicht wird, die nicht gefastet haben. Es ist ebenfalls als eine einzelne i.p. oder p.o. Dosis bei Mäusen mit intracerebral inokulierter Leukämie L1210 wirksam und besteht einen Vergleich mit der bekannten CNS-wirksamen Droge 1,3-bis (2-chloroäthyl)-1-nitrosoharnstoff günstig.

Claims (7)

Patentansprüche

1. 2,2'-Anhydro-1-(-D-arabinofuranosyl)-5-fluorocyto sin und pharmazeutisch aufnehmbare Salze desselben.

2. 2,2' -Anhydro-1-( D-arabinofuranosyl)-5-fluorocytosinformat.

3. Verfahren zur Herstellung von 2,2'-Anhydro-l-(P-D-arabinofuranosyl)-5-fluorocytosin, dadurch gekennzeichnet, daß es die Reaktion von 5-Fluorocytidin mit einem Dehydrierungsmittel enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 3, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t daß das Dehydrierungsmittel Phosphorylchlorid in Gegenwart von Dimethylformamid ist.

5. Verfahren zum Synthetisieren der Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die Verfahrensschritte enthält: a) Reaktion von 5-Fluorocytidin mit einem Dehydrierungsmittel, b) Abkühlen der Reaktionsmischung mit einem wäßrigen Abkühlungs- bzw. Abschreckmittel, c) Adsorbieren des Produktes aus Verfahrensschritt (b) in einem Ionenaustauscherharz in saurem Zustand, d) Nacheinanderfolgende Elution dieses Harzes mit i) Wasser ii) O,1M Pyridiniumformat iii) 0,5M Pyridiniumformat, e) Sauermachen des Eluats der Verfahrensstufe (d) (iii) mit Ameisensäure und f) Entfernen des Lösungsmittels.

6. Verfahren nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch den zusätzlichen Verfahrensschritt der Tituration bzw.

Pulverisierung des Restbestandteils aus Verfahrensstufe (f) mit einem Halogenkohlenwasserstoff, um das gewünschte Produkt in kristalliner Form zu erhalten.

7. Antileukämiezusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Verbindung nach Anspruch 2 und einen pharmazeutisch aufnehmbaren Träger enthält.