DE2301211B2 - Synthetisches naehrmedium fuer mikroorganismen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein synthetisches Nährmedium, verfestigt mit hemmstofffreiem Agar oder als mit einem Membranfilter bedeckter, imprägnierter, und gegebenenfalls getrockneter steril verpackter Nährkarton, für Erreger von Harnwegsinfektionen.

Mit der Bezeichnung »synthetisch« soll zum Ausdruck gebracht werden, daß das Medium im wesentlichen aus definierten chemischen Verbindungen aufgebaut ist; insbesondere sind sonst gebräuchliche, vor allem Aminosäuren enthailtende Stoffgemische, beispielsweise Peptone, Fbischextrakte, Hefeextrakte, durch geeignete Mengen von Aminosäuren ersetzt.

Das erfindungsgemäße Nährmedium eignet sich dazu, die Empfindlichkeit der Erreger bakterieller Harnwegsinfektionen gegen Chemotherapeutika zu bestimmen und damit eine zweckmäßige Therapie zu ermöglichen. Außerdem wird eine näherungsweise Bestimmung der Keimzahl in Untersuchungsproben ermöglicht.

Die gut reproduzierbaren Eigenschaften des Nährmediums erlauben dabei eine Standardisierung des Tests; dadurch wird es möglich, rasch und einfach weit genauere Aussagen über die Anwendbarkeit eines bestimmten Therapeutikums zu machen, als es bisher möglich war.

Synthetische Nährmedien für mikrobiologische Zwecke sind bereits beschrieben worden. So sind im

to

211 „DIFCO MANUAL OF DEHYDRATED CULTURE MEDIA«, 9. Aufl. Detroit 1952, S. 230-235, verschiedene Medien zur mikrobiologischen Bestimmung von Aminosäuren angegeben. Diese Medien weisen jedoch in ihrer Zusammensetzung trotz des Vorhandenseins vieler Bestandteile, die auch erfindungsgemäß benutzt werden, hinsichtlich der Art und Menge der Bestandteile entscheidende Unterschiede gegenüber dem erfindungsgemäßen Nährmediurn auf. Sie eignen sich deshalb nicht als Nährmedien für die wichtigsten Erreger von Harnwegsinfektionen. Entsprechendes gilt von dem Bacto-Hinton-Agar, der in DIFCO SUPPLEMENTARY LITERATURE, Detroit, 1972 (nach Physiol. Zoology, 24. S. 335 [1951]) beschrieben ist. Dieser Agar ist speziell für genetische und biochemische Studien bei Drosphila melanogaster bestimmt. Auch andere bekannte synthetische Nährmedien, wie das von D a ν i s et al. (MICROBIOLOGY, New York 1967, Seite 1131) beschriebene Medium für Kulturen tierischer Zellen sowie ein Medium für Leuconostoc mesenteroides (S t a η i e r et al., GENEFlAL MICROBIOLOGY, 3. Ausg. [1972], Seite 81) weisen nicht eine für die Entwicklung von Erregern von Harnwegsinfektionen günstige, für störende Keime hemmende Zusammensetzung auf.

Das erfindungsgemäße Nährmedium entspricht der im Patentanspruch genannten Zusammensetzung.

Zubereitung des Nährmediums
.Bestandteile

L-Arginin

L-Asparaginsäure

L-Cystein

L-GIutaminsäure

Glykokoli

L-Histidin

L-Leucin

L-Isoleucin

L-Lysin

L-Methionin

L-Phenylalanin L-Prolin

L-Threonin

L-Tryptophan

L-Tyrosin

L-Valin

NaCl

KCl

Na-Acetat, H₂O-frei

Na-Pyruvat

Na-Glycerophosphat · 5 H:0

MgSO₄ ■ 7 H₂O

Adenin

Guanin

Uracil

Agar, hemmslol'ffrei

II. Bestandteile

do D-Glucose Inosit

Cholin-Cl

Nikotinsäureamid

Thiamin-HCI ds Riboflavin Pyridoxin-HCi

Pantothensäure-Ca-Salz

Folsäure

4s

50

55

23 Ol 21

Biotin run,

_Na.Glycerophosphat · 5 H₂O

p-Nitrophenylpropantnul
pimaricin

πι I0°/oige wäßrige Natronlauge
ι[Die Ingredenzien unter 1 werüen in 950 η.¹, dcsi.

Wasser aufgelöst und 20 Minuten bei 121 C im

Autoklav sterilisiert.

n'e Glucose, Vitamine und Wuchsstoffe unter 11 ι , werden in 50 ml dest. Wasser aufgelöst und durch

Sterilfiltraüon über Membranfilter, Porengröße

022 m, entkeimt.

Die 10⁰/oige Natronlauge wird 20 Minuten lang bei

121^CC im Autoklav sterilisiert. 15

Lösung I und 11 werden jeweils auf 55"C erwärmt,

dann zusammengegeben; mit Hilfe von Lösung Ul

wird der pH-Wert bei 47°C auf 7,2 eingestellt.

nie folgenden Vorteile des erfindungsgemäßen m Mährmediums sind besonders hervorzuheben:

Die Bestimmung der Empfindlichkeit der gesamten Erregerpopulation und die Schätzung der Keimzahl werden gleichzeitig auf einer Platte innerhalb von 16 bis 24 Stunden ermittelt.

Die Arten der Gattung Proteus schwärmen nicht.

Sulfonamide werden nicht gehemmt. Cycloserine ' nicht blockiert, Tetracycline nicht inaktiviert.

Hefen werden ausgeschaltet, und dadurch wird ein falsches Ablesen des Antibiogramms verhindert. .1

Das erfindungsgemäße Medium kann warm in sterilisierte Petrischalen oder Röhrchen abgefüllt und in üblicher Weise verwendet werden

Seine Vorteile zeigen sich jedoch besonders in dem nachstehend beschriebenen Anwendungsverfahren, bei dem es um die Ermittlung geeigneter Chemotherapeutika für die Behandlung von Harnwegsinfektionen geht

Man verteilt zunächst 30 ml des warmen Nährmediums in einer sterilisierten Petrischale von 140 mm durchmesser. Nach dem Erstarren wird auf diese Sundschicht eine Saatschicht (15 ml Nährmed.um plus ml Harn) gegossen. Man läßt sie erstarren und legt dann auf die Saatschicht 12 runde Pap.erblattchen von ewa 4 mm Durchmesser, die mit bestimmten Mengen geeigneter antimikrobiell Wirkstoffe beladen sind; K Wirkstoff hat einen festgelegten Platz. Als antimikrobiell Wirkstoffe werden solche verwendet, Sie gegen die üblichen Erreger von Harnwegsinek Honen eine gute Wirkung erwarten lassen. Die Beladung der Blättchen wird nach therapeutisch-pharmakologischen Gesichtspunkten dosiert

Fig 1 zeigt den Blick von oben auf eine Petrischale für das hier beschriebene Verfahren; die mit Wirkstoff beladenen Blättchen sind mil Abkürzungen für den Wirkstoff bezeichnet. Ls bedeuti¹'.-.

PN = Ampicillin

Tl- =- Tetracyclin

C = Chloramphenicol

E = Erythromycin

K = Kanamycin

S = Streptomycin

CS = Cycloserin

PB = Polymyxin »

P = Penicillin G

SXT = Suifameihoxv7ol/Trimethoprim

CN = Geniamycin

Nach 16- bis 24stündiger Bebrütung bei 36 ± Γ C wird mit Llilfe von Schablonen die Empfindliehkeitssiufe der Mikroorganismen ermittelt, die sich aus der Hemmhofgröße unter Berücksichtigung der Keimdichte in der

π uniersuchten Probe ergibt.

Die Keimdichte (Keime/ml) läßt sich optisch in bekannter Weise ermitteln, indem man die Koloniedichte auf eiern Nährmedium zwischen den Hemmhöfen mit der Koloniedichte auf Proben vergleicht, die mit

:.s bestimmten Keimzahlen erhalten worden sind. Für das erf'indungsgemäße Verfahren genügt eine Grobeinteilung in drei Bereiche der Keimdichie

> KF-IO⁵ Keime/ml; ^

> lO'-lO" Keime/ml; ι
' > 10"--IO⁷ Keime/ml 1

Für jeden dieser drei Bereiche wird zur Auswertung eine Schablone benutzt; ihre Herstellung ist weiter unten erläutert. Eine Schablone für den Bereich oberhalb IO⁵ bis 10^b Keime pro ml ist in F i g. 2 }> abgebildet. Die schwarzen Kreisflächen (=Testblättchen) sind von 2 konzentrischen Kreisen umgeben (ausgenommen Gentamycin). 1st der Hemmhofdurchmesser kleiner als der Durchmesser des inneren Kreises, so sind die in der Probe vorhandenen Keime gegen den Wirkstoff resistent. Liegt der Hemmhofdurchmesser zwischen dem Durchmesser aes inneren und des äußeren Kreises, so ist ein gewisser Effekt des Wirkstoffes gegeben; die normale Dosis reicht jedoch dann im allgemeinen für die Therapie nicht aus. Für die Therapie geeignet sind vor allem diejenigen Wirkstoffe, bei denen der Hemmhofdurchmesser größer ist als der Durchmesser des äußeren Kreises auf der Schablone. Im Falle des Gentamycins fällt der mittlere Bei-cieh weg. 1st der Hemmhof giößer als auf de<- Schablone eingezeichnet. kann Gentamycin als Thcrapcutikum verwendet werden, sonst nicht.

In der folgenden Tabelle sind die Werte angegeben, auf Grund deren die Schablonen gezeichnet werden können.

Wirkstoff

Ampicillin Chloramphenicol

Kanamycin

Cycloserin Penicillin G Nalidixinsäure Tetracyclin

Be-

zeichmint'

PN

CS

NA

TE

Blaltchcnbcladung lieivmihofdmvhmi'sser [ium] in ΛIVniir. 111!.¹U¹¹Ii

der

IO⁴--10"¹ Keime/ml

sensibel

10,ig >3(>

30 |lg >2I

30 μ_Β ■> \\

tOO με >²² 10 Einheit. > 30

30 μg > 20

30 (ig > 20

intermediär > 21 — JO

> Ib-22

> 21 -30

> 13-20
• 15-20

IVM-MlMH

1 )

13
Γ'

10', -- |(H' Keime/mi

sensibel

• 20

■· 20

:■ 2 1

-28
> 14

■> 14

diiir

I L¹Sl

stern

-- 20 28
-.· 12 — 20
. 1 > - 20
- Γ.-2Ι
-20-28
-. 12-14
-■ 14 - 14

S 1 < 14

sensibel

■ 2h

> 14 -- 14 -■ 20 - 2b ■- 1 S

Keime/ml 1:11er

- 14— 2h -■ 1 1 --14 , 11-14 ■· 14-20

^m- 2b

,11-18

res¹, sienl

23 Ol 211

ortset/imu

Wirkstoff

Bc Blättchen I lemmholdiiichmcsser |mm] in ΛΙτΙι;ιn;jijjkctt vnn der Koimdii-hic

/eich- heUuliing

mint: > KV-IO'' Kcimc/ml > 10'-- 10" Kcini<:/ml > lOf-10⁷ Kcimc/ml

Ii

1 5 }lg

sen

inter

14

ICSl

SCH

inter·

TCSl

sen

inter

ICSl

S

10 ng

sibcl

mediär

lh

stent

sibcl

nicdiär

stent

sibel

mediär

stem

Erythromycin

PB

300 Einheit.

> 14

> 14-

15

< 14

> 18

>li-18

< Ί.Ι

> 17

~> 12-17

<12

Streptomycin

SXT

25 ug

> Ib

> 12-

14

£12

> 15

5-11-15

< 11

>14

> 10-14

ί 10

Polymyxin B

> 15

> 10-

< 10

> 14

> 9-14

>U

> 9-13

s 9

Sulfamcthoxa/ol/

CN

10 nc

> 19

> 14-

S 14

> 18

> U-18

s π

> 17

> 12-17

£ 12

Trimethoprim

Gentamvcin

> 15

_

—

> 14

_.

_

U

Die Hemmhofdurchmesser der Tabelle werden in der nachstehend beschriebenen Weise ermittelt, wobei handelsübliche, mit bestimmten Wirkstoffen in festgelegten Mengen beladene Testblättchen verwendet werden.

Zunächst ermittelt man für möglichst viele Stämme der in Betracht kommenden Erregerarten die minimale Hemmkonzentration eines bestimmten Wirkstoffs und den durch das Testblättchen erzeugten Hemmhof bei bestimmter Keimdichte. Der Versuch mit dem Testblättchen wird in der gleichen Weise durchgeführt wie später im (oben beschriebenen) standardisierten Test. Zwischen minimaler Hemmkonzentration und Hemmhofdurchmesser besteht ein Zusammenhang, der sich durch eine Kurve darstellen läßt; je größer die minimale Hemmkonzentration ist, desto kleiner ist (bei gegebener Beladung des Testblättchens) der Hemmhofdurchmesser. Die im Blut erreichbare Wirkstoffkonzentration ist nun aber nicht beliebig hoch, da sie von der zulässigen Dosierung des Therapeutikums abhängt. Es können deswegen nur solche Erreger mit einem bestimmten Therapeutikum bekämpft werden, deren minimale Hemmkonzentration niedriger liegt als die höchste bei der Therapie erreichbare Wirkstoffkonzentration im Blut. Dieser höchsten minimalen Hemmkonzentration entspricht ein Hemmhof bestimmten Durchmessers.

Entsteht beim Test ein größerer Hemmhof ( = bakterizide Wirkung), so zeigt das eine niedrigere minimale Hemmkonzentration des bzw. der Erreger an. Sie können dann mit den betreffenden Wirkstoffen bekämpft werden. Ist dagegen der Hemmhof kleiner, so ist der Keim gegen den Wirkstoff weniger empfindlich (»intermediär« = baktcriostiitische Wirkung) oder resistent. Der Wirkstoff ist dann für die Therapie der Infektion weniger oder nicht geeignet.
Als Träger kann für das Nährmedium ein mit einem Membranfilter bedeckter, imprägnierter und gegebenenfalls getrockneter steril verpackter Nährkarton verwendet werden.

Damit die Hemmhöfe sich besser vom Untergrund abheben, werden die Membranfilter gegebenenfalls gefärbL Die imprägnierten Kartonscheiben werden schonend getrocknet, z. B. im Vakuum oder gegebenenfalls durch Gefriertrocknung. Das Nährmedium kann hier ohne einen Agarzusatz verwendet werden.

Um eine Kartonscheibe von 140 mm Durchmesser und 1,5 mm Stärke zu imprägnieren, benötigt man etwa 15rnl Nährmedium. Die Nährkartonscheiben werden steril verpackt und sind dann lange haltbar. Für die Anwendung werden sie lediglich in sterile Petrischalen passender Größe gelegt und angefeuchtet. Anfeuchten und Aufbringen der Saatschicht werden zweckmäßig kombiniert, indem man die zu untersuchende Urinprobe mit der Anfeuchtflüssiigkeit gemischt zu dem Nährkarton gibt. Für eine Nährkartonscheibe der oben angegebenen Abmessung werden 15 ml An.feuchtflüssigkeit (beispielsweise steriles Wasser., sterile physiologische Kochsalzlösung oder verdünntes Nährmedium) benötigt. Standardisierung und Auswertung erfolgen wie oben beschrieben. Statt eine Schablone zu benutzen, kann man auch Nährkartonscheiben mit gegebenenfalls verschiedenfarbig aufgedruckten Markierungen verwenden.

Hierzu 2 Blatt Zci

Claims (1)

1. Gl

   Patentanspruch:

   Synthetisches Nährmedium, verfestigt mit hemmstofffreiem Agar oder als mit einem Membranfilter bedeckter, imprägnierter und gegebenenfalls getrockneter steril verpackter Nährkarton, für Erreger von Harnwegsinfektionen, dadurch gekennzeichnet, daß es aus

   0,5 g L-Arginin, 1 g L-Asparaginsäure,

   0,5 g L-Cystein, 2 g L-Giutaminsäure,

   0,2 g Glykokoll, 0,3 g L-Histidin,

   0,8 g L-Leucin,0,5 g !.-Isoleucin,

   0,6 g L-Lysin, 0,3 g L'viethionin,

   0,3 g LPhenylalanin,0,4 g L-Prolin,

   0,4 g L-Threonin, 0, i g L-Tryptophan,

   0,4 g L-Tyrosin, 1 g L-Valin,

   3 g Natriumchlorid, 0,3 g Kaliumchlorid,

   1 g wasserfreies Natriumacetat,

   1 g Natriumpyruvat,

   6 g Natriumglycerophosphat-Peniahydrat,

   0,05 g Magnesiumsulfat-Heptahydrat,

   0,01 g Adenin, 0,01 g Guanin,

   0,01 g Uracil, 2 g D-Glukose,

   0,01 g Inosit, 0,01 g Cholinchlorid.

   0,01 g Nikotinsäureamid,

   0,01 gThiamin-hydrochlorid,

   0,001 g Riboflavin,

   0,006 g Pyridoxin-hydrochlorid,

   0,01 g Calciumpanthothenat, 0,01 g Folsäure.

   0,0002 g Biotin,

   0,005 g p-Nitrophenylpropantriol,

   0,1 g Pimaricin pro Liter Wasser,
   wobei die Mengen der angegebenen Bestandteile auch etwa die Hälfte oder das Doppelte betragen können, sowie einer für die Einstellung von pH 7,2 erforderlichen Menge Natriumhydroxid in verdünnter wäßriger Lösung besteht.