DE2260280A1 - Verfahren zur bestimmung des verlaufs einer chemischen reaktion - Google Patents

Description

Priorität: 9. Dezember 1971, Nr. 2o6

Die Erfindung bezieht sich auf die Bestimmung des Verlaufs bzw. des Fortschreitens einer chemischen Reaktion zwischen Seruinproben und einem Reagenz. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zum schnellen Betreiben eines Spektrophotometers, um das Vorhandensein einer Substanz in einer Vielzahl von Proben zu analysieren, die in einem Zentrifugalfeld rotieren.

Wegen der zahlreichen mikroanalytischen Untersuchungen in der biochemischen Forschung,infolge von klinischen Routineuntersuchungen für Ärzte und Krankenhäuser, sowie aufgrund enzymatischer Untersuchungen und dergleichen, hat sich in letzter Zeit der Bedarf für schnelle, automatisch arbeitende Analysevorrichtungen beträchtlich erhöht. Es sind jedoch

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BAD ORIGiNAL

nur wenige Vorrichtungen verfügbar, mit denen Analysen in ausreichender Schnelligkeit und genügend genau vorgenommen werden können, um mit der wachsenden Anzahl der verschiedenen Untersuchungen fertig zu werden, wie sie von Ärzten und Forschern gefordert werden.

Für die schnelle Analyse einer breiten Vielfalt von Flüssigkeiten wie Blutserum und andere Körperflüssigkeiten, Nahrungsmittel und dergleichen, steht bereits ein eine Vielzahl von Stationen aufweisendes analytisches Photometer zur Verfügung, welches ein Zentrifugalfeld benutzt. Da zahlreiche ""Analysen schnell und gleichzeitig durchgeführt werden können, sind diese Vorrichtungen dann von besonderem Interesse, wenn eine große Anzahl von Proben vorliegt oder eine Vielzahl von Versuchen an einer Probe vorgenommen werden soll. Da diese Vorrichtungen die Verwendung relativ kleiner Volumina von Reagenzien gestatten, kann der Einsatz von teuren Reagenzien auf ein Minimum reduziert werden.

Eine derartige Vorrichtung für mikroanalytische Untersuchungen, die ein Zentrifugalfeld benutzt,'ist in "Analytical Biochemistry" 28, 5^5 bis 562, 1969 beschrieben. Diese Vorrichtung benutzt das Prinzip der Doppelstrahl-Spektrophotometrie, wobei die Absorption in einer flüssigen Probe und in einer Bezugslösung miteinander verglichen werden. Die Anordnung besteht grundsätzlich aus einer Reihe von Küvetten bzw. Aussparungsräumen, die um den Umfang des Rotors so angeordnet sind, daß bei dessen Rotation die Zentrifugalkraft die Reagenzien und Proben mischt und den Aussparungsräumen zuführt, wo die Analyse spektrophotometrisch vorgenommen wird. Dabei ist eine Scheibe für das Aufbringen von Proben vorgesehen, die Reihen von Hohlräumen enthält, welche konzentrisch angeordnet sind. In dieser Scheibe werden zu analysierende Serumproben in den inneren Hohlräumen und die Reagenzien in den Hohlräumen angeordnet, die einen größeren radialen Abstand als

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die Hohlräume haben, weiche die Serumprotoen 'enthalten. Di« Scheibe für das Aufbringen von Proben wird dann einrastend in dem Rotor angeordnet. Beim Beschleunigen des Rotors bewegt die Zentrifugalkraft die jeweilige Probe zu dem das Reagenz enthaltenden Hohlraum, wo sie gemischt werden. Das Gemisch von Reagenz und Probe wird dann durch einen Verbindungskanal in den Aussparungsraum . bzw. die Küvette bewegt. Die gefüllten Küvetten drehen sich schnell an einem lagefesten Lichtstrahl vorbei, wobei der Durchgang von Licht durch die Küvetten, d. h. durch die \ Proben, gemessen wird.

Wenn bisher eine Vielzahl von Versuchen durchgeführt werden sollte, wurde für jedes Gemisch aus Probe und Serum ein "blankes" Reagenz vorgesehen, um einen Nullwert der Absorption für den Vergleich mit Farbänderungen einzustellen, die während der Reaktion des Serums mit dem Reagenz auftreten, wodurch das Ausmaß der Reaktion zwischen dem Serum und dem Reagenz bestimmt wurde. Dies machte es erforderlich, daß die Serumproben nur in abwechselnden Hohlräumen angeordnet werden konnten, wodurch die Anzahl der Versuche, die gleichzeitig durchgeführt werden konnten, und die Geschwindigkeit, mit der die Versuche ausgeführt werden konnten, begrenzt waren.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht deshalb darin, ein Verfahren der eingangs genannten Art zu schaffen, mit dem sich das Untersuchungsvermögen rotierender Spektrophotometer erhöhen läßt, die für analytische Untersuchungen verwendet werden.

Ausgehend von bekannten rotierenden Spektrophotometem, die eine Reihe von Küvetten haben, die konzentrisch um eine horizontal drehbare Scheibe so angeordnet sind, daß beim Drehen der Scheibe die Zentrifugalkraft die Reagenzien und Proben den Küvetten vermischt zuführt, wobei jede Küvette

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an einer Lichtquelle vorbeigeht, so daß die Absorption durch jede einzelne Probe bestimmt und photometrisch gemessen werden kann, wobei ein elektrisches Signal geschaffen wird, welches das Ausmaß der Reaktion zwischen dem Reagenz und der Probe anzeigt, wird zur Erzielung einer genauen Messung des Ausmaßes der Reaktion zur Lösung der der Erfindung zugrunde liegenden Aufgabe ein elektrisches Bezugssignal erforderlich, das erfindungsgemäß dadurch geschaffen wird, daß die die Küvette enthaltende Scheibe mit einer Geschwindigkeit gedreht wird, daß man ein elektrisches Anfangssignal erhält, ehe irgendeine wesentliche Reaktion zwischen dem Reagenz und der Probe in den Küvetten stattgefunden hat.

Anhand der beiliegenden Zeichnungen wird die Erfindung beispielsweise näher erläutert.

Fig. 1 zeigt eine Draufsicht auf die drehbare Scheibe eines Spektrophotometers für die analytische Untersuchung.

Fig. 2 zeigt die Scheibe von Fig. 1 in einer Seitenansicht im Schnitt sowie eine Lichtquelle, eine Photodetektoreinrichtung, die Küvettenanordnung und den Antriebsmotor.

Fig. 3 zeigt ein Blockschaltbild der elektrischen Meßanordnung für die Einrichtung von Fig. 1 und 2.

Die in den Figuren 1 und 2 gezeigte drehbare Aufgabescheibe loo eines Spektrophotometers hat dreißig Reihen von Hohlräumen, die mit 1 bis 3o bezeichnet sind, wobei jede Reihe einen Serumhohlraum 33 und einen Reagenzhohlraum 31 hat. Bei 4o ist ein Schlitz für das Einrasten der Aufgabescheibe gezeigt. Das bisher bekannte Standardverfahren bestand darin, das Reagenz in den Hohlräumen 31 in abwechselnder Lage anzuordnen, also in den Hohlräumen 1, 3, 5 bis 29, wobei die benachbarten radial ausgerichteten Serumhohlräume 33 leer

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Sowohl Serum als auch Reagenz wurden in dien jeweils zugeordneten Hohlräumen 33 und Jt in den Lagen 2,, k, 6, 8 bis 3o. angeordnet _A DadureJb war für jede durchzuführende Analyse in den Lagen 1₁ 3» 5 bis 29 ein. "blankes" Reagenz vorhanden« Wenn die Proben und Reagenzien enthaltende Scheibe eingerastet bzw. indiziert und in der Rotoranordnung 35 angeordnet war, war jede Reihe von Hohlräumen zu einer zugeordneten Küvette 37 ausgerichtet. Während des Laufens der Rotoranordnung 35 bewegte die Zentrifugalkraft die Inhalte aus Serum und Reagenz zu den äußersten Hohlräumen 39· ®^as Serum und das Reagenz der Lagen 2, k, 6, 8 usw. wurden gemischt und von dem Hohlraum 39 durch Kanäle 5° den jeweiligen Küvetten zugeführt. Die Küvetten, die mit denHohlräumen der Lagen 1, 5 usw. in Verbindung standen, wurden nur mit Reagenz, gefüllt, während die Küvetten 37» die mit den Hohlräumen der Lagen 2, 4, 6 usw. in Verbindung standen, mit einem Gemisch von Serum und Reagenz gefüllt wurden. Die gefüllten Küvetten 37 drehten sich zwischen der Lichtquelle 55 und dem Photovervielfacher 6o. Die Küvetten 37 der Lagen 1, 3» 5 usw. enthielten nur Reagenz, so daß der Photovervielfacher 6o dafür einen Wert hervorbrachte, der als Nullabsorption, d. h. als "unverfälschter" Wert, bezeichnet wurde. Die von" dem Photovervielfacher bzw. Photoelektronenvervielfacher für die anderen Lagen 2, k, 6 usw. erzeugten Signale konnten mit den entsprechenden "unverfälschten" Signalen verglichen werden, wodurch alle Farbänderungen infolge der Reaktion zwischen dem Reagenz und dem S.erum angezeigt wurden.

Basierend auf der Beobachtung, daß Serum-Reagenz-Reaktionen einen endlichen Zeitraum benötigen, um eine merkliche Farbänderung, d. h. eine Änderung der Absorption, aufzuweisen, wird erfindungsgemäß ein Verfahren geschaffen, bei welchem alle Lagen 1 bis 39 sowohl mit Serum als auch mit Reagenz in den zugeordneten Hohlräumen 33 bzw. Jl versehen werden können.

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Die Scheibe loo wird dann sehr schnell, beispielsweise mit looo Upm, gedreht, wodurch alle Küvetten zwischen der Lichtquelle 55 und dem Photoelektronenvervielfacher 6o in einem sehr kurzen Zeitraum vorbeilaufen, d. h. in weniger als l/lo s. Dadurch entsprechen die von dem Photoelektronenvervielfacher 6o abgegebenen Signale während des Beginns der Rotation einem unbeeinflußten Wert, da in diesem Zeitraum keine bedeutende Farbänderung infolge der Seruia-Reagenz-Reaktion eintritt. Die elektrischen Signale von dem Photoelektronenvervielfacher 6o werden, wie in Fig. J, gezeigt, einem herkömmlichen logarithmischen Verstärker 6l zugeführt. Diese Signale liefen, in Form elektrischer Impulse infolge des "Zerhackungseffekts" der Rotoranordnung 35 ^v°^r· Man nimmt einen logarithmischen Verstärker, da die Absorptionserscheinung der Serum-Reagenz-Reaktionen einenlogarithmischen Charakter haben. In dem Verstärker 6l werden die von dem Photoelektronenvervielfacher 6o erzeugten elektrischen Stromimpulse in Spannungsimpulse umgewandelt, die bezüglich der Stromimpulse eine logarithmische Beziehung haben. Die Spannungsimpulse aus dem logarithmisphen Verstärker 6o werden einem herkömmlichen Spitzendetektor 62 zugeführt (Peak Detector Module 4o84/25 der Firma Burr-Brown Research Corporation). Der Spitzendetektor 62 beobachtet den Spitzenwert eines jeden zugeführten Impulses und hält diesen Wert, bis er von dem Generator 64 für die Steuerfunktion zurückgesetzt wird, der mit der Rotoranordnung 35 synchronisiert und gekoppelt ist. Die während der beginnenden Rotation der Rotoranordnung 35 erhaltenen Spitzensignale werden dem Spitzendetektor 62 für jede der Küvettenlagen 1 bis 3° zugeführt, wobei der Generator 64 für die Steuerfunktion den Spitzendetektor 62 jeweils nach Empfang eines jeden Impulses rücksetzt. Jedes von dem Spitzendetektor 62 empfangene Spitzensignal wird dem Analog-Digital-Umsetzer 66 zugeführt, der unter Verwendung des herkömmlichen Binärsystems eine Gruppe von Impulsen erzeugt, deren Wert der von dem Spitzendetektor 62 gemessenen Spitze

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entspricht (als Analqg-Digital-Ums'etzer kann ein Teledyrie Philbriclc Nexus Modell 4lo3 verwendet werden). Die von dem Analog-Digital-Umsetzer 66 während der beginnenden Rotation der Rotoranordnung 35 erzeugten Impulsgruppen werden gespeichert und in der Speichereinheit 68 über einen elektronischen Schalter 7o gehalten, der durch den Generator 6k für die Steuerfunktion im geeigneten Zeitpunkt betätigt wird. Die Impulsgruppen stellen "unbeeinflußte Werte" dar, da keine bedeutende Reaktion zwischen dem Serum und dem Reagenz während der Anfangsumdrehung der Rotoranordnung 35 eintritt. Die von dem Analog-Digital-Umsetzer 66 für die darauffolgenden Umdrehungen der Rotoranordnung 35 in vorher gewählten Zeitpunkten erzeugten Impulsgruppen werden der Speichereinheit 72 über den elektronischen Schalter 7^ zugeführt, der von dem Generator 64 für die Steuerfunktion im geeigneten Zeitpunkt betätigt wird.

Wenn die Impulsgruppen in der Speichereinheit 72 gespeichert sind, werden die Inhalte der Speichereinheiten 68 und 72 in der Subtraktionseinheit 75 subtrahiert» und die sich ergebenden Daten am Drucker 77 ausgedruckt (beispielsweise Drucker Moduprint, ModellA, Practical Automation Inc.). Dieser Wert ist ein Maß für die Farbänderung oder Absorptionsänderung in den Küvetten 37 der Rotoranordnung 35 und somit für das Ausmaß der Reaktion zwischen dem Serum und dem Reagenz in den Küvetten.

Im folgenden soll zur Veranschaulichung eine häufig durchgeführte Analyse zur Bestimmung der Glukose im- Blutserum herangezogen werden. Bei dieser Analyse werden 5 Mikroliter Serum in den Serumhohlräumen 33 und 35o Mikroliter Glukosereagenz in den Reagenzhohlräumen 31 der Probescheibe loo angeordnet. Das Glukosereagenz ist ein o,3 molarer Triäthanolamin-Puffer mit einem pH-Wert von 7)5» der o,oo4 Mol/l Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADP), o,ooo5 Mol/l

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Adenosin-Triphosphat (ATP), 7o mg/1 Hexokinase, l4o mg/l Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase und o,oo4 mol/1 MgSo^ enthält. Die kombinierte Wirkung von ATP und NAOP in Anwesenheit der Enzyme Hexokinase und Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase führt zu der Reduktion von NADP, die spektrophotometrisch durch Feststellung von Änderungen in der Absorption bei einer Wellenlänge von 3^o nm bestimmbar ist. Eine ursprüngliche Ablesung des "unverfälschten Wertes" kann bis zu 2 s nach dem Beginn des Umlaufs der Rotoranordnung 35 vorgenommen und in der Speichereinheit 68 zur Erzeugung eines "unverfälschten Wertes" gespeichert werden. Nach einem Zeitraum von Io min erfolgt die Endablesung, die in der Speichereinheit 72 gespeichert wird. Der "unverfälschte bzw. unbeeinflußte Wert" wird von dem Wert in der Speichereinheit 72 subtrahiert. Die gemessene Änderung ist proportional der Absorptionsänderung infolge des Umfangs . der Glukoseoxydation, die mit der Reduktion von NADP gleichläuft.

- Patentansprüche -

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Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH

   Verfahren zur Bestimmung des Verlaufs einer chemischen Reaktion zwischen Serumproben und einem Reagenz, wobei eine Lichtquelle, eine Photodetektoreinrichtung, die im Abstand zu der Lichtquelle daneben angeordnet ist und ein elektrisches Signal proportional zur optischen Dichte des Mediums, durch das es von der Lichtquelle getrennt ist, erzeugt, sowie eine drehbare bewegliche Rotoranordnung vorgesehen ist, die sich zwischen der Lichtquelle und der Photodetektoreinrichtung dreht, eine Vielzahl von lichtdurchlässigen Analysekammern für die Proben hat, die in einer gemeinsamen radialen Lage in der Rotoranordnung vorgesehen sind, und eine ein Reagenz enthaltende Kammer sowie eine ein Serum enthaltende Kammer aufweist, die radial zu jeder der Analysekammern für die Probe ausgerichtet sind, wodurch bei der Rotation der Rotoranordnung der Inhalt der Reagenz- und Seruinkammern sich vermischen und in die radial fluchtend dazu angeordneten Analysekammern für die Proben strömen, dadurch gekennzeichnet, daß die Rotoranordnung mit einer" Drehzahl gedreht wird, daß die Gemische aus Serum und Reagenz in die Analysekammern für die Proben eintreten, bevor zwischen ihnen eine wesentliche Reaktion eintritt, daß das elektrische Signal, das von der Photodetektoreinrichtung in dem Zeitpunkt erzeugt wird, ehe irgendeine wesentliche Reaktion zwischen dem Reagenz und dem Serum eintritt, einem Speicher für das elektrische Signal zugeführt wird, daß ein elektrisches Signal, das von der Photodetektoreinrichtung zu dem Zeitpunkt erzeugt wird, nachdem eine wesentliche Reaktion zwischen dem Reagenz und dem Serum eingetreten ist, einem Speicher für das

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   elektrische Signal zugeführt wird, und daß ein elektrisches Signal proportional zu der Differenz der beiden vorstehenden Signale als Maß für" den Umfang der Reaktion zwischen dem Serum und dem Reagenz erzeugt wird.

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   JA

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