DE2254645A1

DE2254645A1 - Verfahren zur herstellung von nukleosidzyklischen phosphaten

Info

Publication number: DE2254645A1
Application number: DE19722254645
Authority: DE
Inventors: Tasneem Afzal Khwaja; Roland Kenith Robins
Original assignee: ICN Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Valeant Pharmaceuticals International Inc USA
Priority date: 1972-11-08
Filing date: 1972-11-08
Publication date: 1974-05-16

Description

Verfahren zur Herstellung von nukloesid-zyklischen Phosphaten Die Erfindung betrifft ein neues Antivirusmittel sowie Zwischenprodukte, die während der Synthese dieses Mittels auftreten, sowie ein neues Syntheseverfahren zur Herstellung dieaer Verbindung.
Während der letzten 10 Jahre wurde gewunden, dass viele Nukleosid-Analoga eine gute Antitumor- und Antivirus-Aktivität besitzen. Von den derzeit beknnten synthetischen Nukleosid-Antivirusmitteln werden als die bedeutendsten 5'-Jod-2'-Deoxyuridin (IDU), 9-ß-D-Araginofuranosyladenin (Ara-A) und 1-ß-D-Arabinofuranosylcytosin (Ara-C) angesehen. Von diesen Verbindungen ist nur IDU ala Antivirusmittel im Handel verfügbar. Diese Verbindung besitzt eine extrem niedrige Löslichkeit, und zwar eine maximale Löslichkeit von 0,1 Gewichts-%, wobei noch hinzukommt, dass diene Verbindung sehr toxisch ist. Ara-A wurde und wird klinischen Tests als Antivirusmittel unterzogen. Obwohl Anzeichen dafür vorhanden sind, dass Ara-A ein wirksames Mittel gegentiber einem Spektrum von virusinfektionen ist, so ist dennoch seine Verwendbarkeit duroh seine geringe Löslichkeit begrenzt. Die maximale Lösliohkeit beträgt ungefähr 1 Mikrogramm pro ml.
Werden Nukleosid-Analoga nur Inhibierung eines Viren oder Tumorwachstums verwendet, dann werden die Nukleoside in vivo su ihren entsprechenden Mono- oder Polyphosphaten metabolisiert, welche die tatsächlichen Inhibitoren für ein derartiges Wachatum eind. Der Hauptnachteil bei der Verwendung von Nukleosid-Analoga in der Ohemotherapie ist Jedoch das auftreten einer Zellresistenz gegenüber derartigen Verbindungen, da die eindringenden Zellen einen geringen Grad an Kinase- oder Pyrophosphorylase-Aktivität zeigen und daher keine wirksamen Inhibitoren erzeugen. Dieses Problem könnte natürlich dadurch gelöst werden, dass Nukleosidphosphate verwendet werden. Derartige Derivate können Jedoch entweder nicht durch die Zellmembran hindurchtreten oder werden schnell in der interzellularen Flüssigkeit zersetzt und sind damit als Inhibitoren unwirksam.
Im Hinblick auf die vorstehenden Überlegungen wird es deutlich, dass ein Bedarf an einem Nukleosid-Analogen besteht, das in wirksamer Weise die Entwicklung von Virusinfektionen zu inhibieren vermag und auch eine bessere Löslichkeit als die bekannten Antivirusmittel besitzt. Die Herstellung einer derartigen Verbindung iet Jedoch sehr schwierig, da relativ wenige Nukleosidverbindungen bekannt sind, die auch nur eine geringe Antivirußaktivität besitzen. Die Aufgabe, eine Verbindung zu schaffen, die nicht nur eine annehmbare Aktivität besitzt, sondern auch die Zellmembran zu durchdringen und die Virus infektion in wirksamen Konzentrationen zu kontsktieren vermag, ist daher in vielerlei Hinsicht schwierig zu lösen.
Nukloesid-zyklischen Phosphate könnten infolge ihrer besonderen Struktur dazu in der Lage sein, durch die Zellmembran hindurchzugehen. Es besteht Jedoch dann immer noch keine Gewähr, dass derartige Verbindungen wirksame Inhibitoren sind, wenn sie den Virus kontaktieren. Beispielsweise ist ein 3',5'-tykliaches Adenosin-Monophosphat der Formel: eine Naturverbindung, die keine Antivirusaktivität besitst.
Auch besitzen die bei der Durchfithrung des erfindungsgemässen Syn theseverfahrens anfallenden Zwischenverbindungen keine Antivirusaktivität. In äusserst tiberraschender Weise besitzt Jedoch das zyklische Monophospbat-Nukleosid der Erfindung eine sehr stark ausgeprägte Antivirusaktivität.
Die Erfindung betrifft daher ein Antivirusmittel, Zwischenprodukte, die bei der Synthese dieses Mittels anfallen, sowie das Syntheseverfahren selbst. Die erfindungsgemässen Verbindungen entsprechen der allgemeinen Formel: worin X für H, OH, SH, ein Halogen oder einen Anhydrorest steht, R H oder Acyl bedeutet, R1 H oder OH versinnbildlicht, R2 H oder eine verdrängbare Gruppe, wie beispielsweise Tosyl, darstellt, und Y H, ein Alkalimetall oder Ammonium ist. Bedeutet R1 9H, dann stehen R und R2 fUr H und X fUr H oder SH. R ist nur dann Acyl, wenn X ftir OH steht, R1 H bedeutet und R2 eine verdrängbare Gruppe ist. X ist nur dann Halogen, wenn R und R1 Wasserstoff sind und R2 eine verdrängbare Gruppe daretellt.
Von besonderem Interesse ale Antivirusmittel ist 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-3',5'-zyklisches Monophosphat der Formel: Wie aus den nachfolgenden Beispielen hervorgeht, besitzt diese Verbindung in vitro eine bemerkenswerte Antivirusaktivität gegenüber einem breiten Spektrum von Viren, einschliesslich der Typen 1 und 2 Herpes simplex, Vaccinia, Myxoma und Pseudorabies, wobei diese Aktivität zumindest so gross ist wie diejenige von Ara-A und in einigen Fällen merklich höher ist.
Zur Synthetisierung diese Antivirusmittels wird ein vergleichsweise kurzes Verfahren, das sehr wirtschaftlich arbeitet, angewendet, Dieses Verfahren lässt sich durch das folgende Reaktionsschema wiedergeben, welches die einzelnen Stufen, erläutert: Zunächst wird 3',5'-zyklisches Adenosin-Monophosphat (Verbindung 1), wobei es sich bei dieser Verbindung um eine natUrlich vorkommende Verbindung handelt, zur Gewinnung von 8-Brom-3',5'-zyklischem Adenosin-Monophosphat (Verbindung 3) bromiert.
Wahlweise kann die Verbindung 3 im Handel bezogen werden, beispielsweise von der ICN Oorporation. Unabhängig davon, ob diese Verbindung in der geschilderten Weise synthetisiert oder im Handel bezogen worden ist, wird die Verbindung 3 anschliessend einem Tosylierungsverfahren zur Gewinnung von 21-O-Tosyl-8-bromadenosin-3',5'-zyklisches Monophosphat (Verbindung 4) unterzogen. Wird eine andere verdrängbare Gruppe (LG-Gruppe) als die Tosylgruppe in die 2'-Stellung eingebracht, dann ist das erhaltene Produkt die entsprechende 21-Verbindung, und zwar 2'-0-LG-8-Bromadenosin-3',5'-zyklisches Monophosphat.
Die Verbindung 4 wird anschliessend mit einer Lösung von Essigsäureanhydrid, Natriumacetat und Essigsäure sur Gewinnung von 2'-0-Tosyl-6-N-acetyl-8-hydroxyladenosin-3',5'-zyklischem Monosphosphat (Verbindung 5) behandelt. Diese Verbindung wird dann einer Behandlung mit methanolischem Ammoniak in aufeinanderfolgenden Stufen zur Gewinnung von 2'-0-Tosyl-8-hydroxyladenosin-3',5'-zyklischem Monophosphat (Verbindung 6) und 8-2'-Anhydro-8-oxy-9-ß-=D-arabinofuranosyladenin-3' 151 -zyklischem Nonosphospbat (Verbindung 7) behandelt. Wahlweise kann die Verbindung 6 durch Behandlung der Verbindung 4 mit Natriumacetat in Essigsäure und die Verbindung 7 aus der Verbindung 6 durch Behandlung mit Natrium und N,N-Dimethylformamid (DMF) hergestellt werden. Die Verbindung 7 wird anschliessend mit fltissigem Schwefelwasserstoff zur Gewinnung von 8-Merkapto-9-ß-D-arabinofuranosyladenin-3',5'-zyklischem Monophosphat (Verbindung 8) behandelt. Diese Verbindung wird dann vorzugsweise durch Reduktion in Gegenwart eines Raney Nickel-Katalysators zur Gewinnung des gewünschten 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-3',5'-zyklischen Monophosphats (Verbindung 2) umgewandelt. Die Verbindung 8 kann auch in die Verbindung 2 durch Behandlung mit p-Toluol-Sulfonylchlorid in Pyridin oder durch Oxydation mit N-Bromsuccinimid oder Jod umgewandelt werden.
Dieses Verfahren ist vergleichsweise einfach und wirksam und ermöglicht eine Isolation der Zwischenverbindungen, ohne dass dabei aufwendige säulenchromatographische Methoden angewendet werden mUssen. Bei der DurchfUhrung dieses Verfahrens werden nicht nur gute Ausbeuten an der Verbindung 2, sondern auch an den Zwischenprodukten erzielt.
Es ist darauf hinzuweisen, dass die oben angegebenen Substituenten X, R und R2 in der geschilderten Weise variiert werden können Beispielsweise kann X nicht nur ür Brom, sondern auch fUr Chlor, Jod oder Fluor in den Verbindungen 3 und 4 stehen, R kann in der Verbindung 5 ein C1-C10-Acylrest sein, und R2 kann eine leicht verdrängbare Gruppe sein, d.h. eine Gruppe, die leicht nukleophil ersetzbar sein kann, wobei es sich auch um andere Gruppen als um die Tosylgruppe im Falle der Verbindungen 4, 5 und 6 handeln kann. Im allgemeinen besteht die verdrängbare Gruppe aus Tosyl, Mesyl, Anisyl, Brosyl, Niagl oder Triisopropylbenzolsulfonyl der Formel , worin R3 fUr Methyl

steht, OCH

y

H3C X CH3

CH

3°s $ -' OH3

HO H

H3C

oder Werden die Substituenten verändert, dann müssen natiirlich auch die entsprechenden Verarbeitungsstufen verändert werden, beispielsweise wird die Tosylierung durch eine Nesylierung oder Brosylierung etc. ersetzt. Da die Arbeitsbedingungen für derartige Stufen bekannt sind, braucht nicht auf diese Bedingungen eingegangen werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die 1W-Spektren werden unter Verwendung eines Cary-15-Spektrophotometers aufgezeichnet. Die Infrarotspektren werden unter Verwendung eines Perkin-Elmer-Spektrophotometers (Modell 257) bestimmt. Die protonenmagnetischen Res onanzuntersuchungen werden unter Verwendung eines Hitachi Perkin-Elmer-Spektrometers (R-2QA) mit DSS als Standard durchgeführt.
Beispiel 1 Herstellung von Natrium-2'-0-Tosyl-8-bromadenosin-3',5'-zyklischem Phosphat (4) 40,9 g (100 mMol) der Verbindung 3 werden in 250 ml ln-NaOH gelöst. Der gerührten Lösung werden 76,26.g (400 mMol) p-Toluol-Sulfonylchlorid in 600 ml Dioxan während einer Zeitspanne von 15 Minuten zugesetzt. Die Reaktionslösung wird unter Rühren während einer Zeitspanne von 4 Stunden auf Zimmertemperatur gehalten, worauf die erhaltene Mischung in 5 ml Eiswasser unter starkem Rühren gegossen wird. Das ausgefällte Material wird filtriert, mit 2 1 eines eiskalten Wassers gewaschen und unter Saugen getrocknet. Der getrocknete Niederschlag wird in 800 ml Chloroform suspendiert, kräftig gerührt, filtriert und abschliessend mit 3 1 eines überschüssigen Chloroforms gewaschen.
Der weisse pulverförmige RUckatand wird in einem Vaknumexsikkator über P205 Ueber Nacht getrocknet Dabei erhält man 55,6 g (94 ) der Verbindung 4 in Form eines chromatographisch homogenen Materials. Das IR-Spektrum zeigt eine starke Band bei 1179 cm-1 entsprechend der Arylsulfonylabsorption. Das PMR-Spektrum des anomeren Protons (bestimmt auf D2O) ist bei #5,82 als Singlett zentriert. Bei einer Papierelektrophorese in einem Phosphatpuffer (pH 7,2) bewegt es sich mit einfacher ladung ähnlich Sykliachem AMP. UV-Absorption: 266 (#15100), #pH1max 264 (#17700), #pH11max 266 (#15200) Beispiel 2 Herstellung von 8,2'-Anhydro-8-oxy-9-ß-D-arabinofuranoxyladenin-3',5'-zyklischem Phosphat (7) a) Natrium-2'-0-Tosyl-6-N-acetyl-8-hydroxyladenosin-3',5'-zyklisches Phosphat (5) 32,8 g Natriumacetat werden in 800 ml Essigsäure gelöst, worauf 80 ml Essigsäureanhydrid und 24,00 g (40 mMol) der Verbindung 4 zugesetzt werden. Die Lösung wird unter Ausschluss von Feuchtigkeit während einer Zeitspanne von 3,75 Stunden (Badtemperatur 125°C) unter RUckfluss gehalten. Die Reaktionsmischung wird dann abgekühlt und zur Trockne unter vermindertem Druck eingedampft, Der Rückstand wird unter Verwendung von MeOH, ÄtOH und Dioxan zur Entfernung der letzten Spuren von Essigsäure eingedampft und anschliessend in einer Mischung aus MeOH (600 ml) und XtOH (400 ml) suspendiert. Die festen Klumpen in der Suspension werden zerstossen, worauf das ausgefällte Material filtriert wird. Dabei werden 200 ml MeOH zum Waschen verwendet.
Das getrocknete Material 5 ergibt bei der Chromatographie in verschiedenen Systemen einen homogenen Blicken. Die ausbeute beträgt 22,61 g.
UV-Absorption: #pH1max 290, #pH11max 272,5 und 309,5 #.
b) Ammonium-2'-0-tosyl-8-hydroxygladenosin-3',5'-zyklisches Phosphat (6) 2,168 g (4 mMol) der Verbindung 5,~erhalten nach der letzten Stufe, werden in 60 ml eines methanolischen Ammoniaks aufgelöst, worauf die Lösung bei Zimmertemperatur- während einer Zeitspanne von 90 Stunden stehengelassen wird. Dann wird die Lösung unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird suspendiert und mit ÄtOH (40 ml) verrieben und tiber Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen. Am nächsten Morgen wird das ausgefällte Material filtriert und mit 20 ml ÄtOH gewaschen und getrocknet. Dabei erhält man 1,7 g der Verbindung 6. Das Filtrat und die Waschlösungen werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus MeOH/ÄtOH zur Gewinnung von weiteren 0,065 g der Verbindung 6 umkristallisiert. Die Gesamtausbeute beträgt 1,765 g (85,3 %).
UV-Absorption: #H+max 265 und 288 #, #OH-max 282 #.
c) 8-2'-Anhydro-8-oxy-9-ß-D-arabinofuranosyladenin-3',5'-zyklisches Phosphat (7) Methode I: 1,551 g (3 mMol) der Verbindung 6 werden in 50 ml eines methanolischen Ammoniaks gelöst, worauf die Lösung in einer Bombe während einer Zeitspanne von 6 Stunden bei 8000 gehalten wird. Die Reaktionsprodukte werden an einer Kiesselsäuresäule (Mallinkrodt-100 mesh, 2,7 cm x 70 cm) adsorbiert. Die Säule wird mit 400 ml Chloroform und anschliessend mit MeOH/Chloroform (1/1, Volumen/ Volumen) eluiert. Das Produkt 7 erscheint in dem sweiten Hauptpeak. Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und eingedampft. Der Rückstand wird in 40 ml MeOH aufgelöst und zur Gewinnung des Produktes 7 als kristallines Ammoninmsalz abgekühlt. Das Produkt wird abfiltriert und fällt in einer Menge von 0,44 g an. Das Filtrat wird unter Verwendung von 2n-HOl auf einen pH von ungefähr 2 angesäuert. Dabei erhält man eine weitere Portion des Produktes 7 in einer Menge von 0,16 g in Porm der freien Säure. Die Gesamtausbeute beträgt 0,60 g (59,3 %).
Analyse: 0 10H1 0N506P Berechnet C 36,71, H 3,08, N 21,40 Gefunden C 36,85, H 3,13, N 21,22 Das IR-Spektrum zeigt keine Absorptionsbande entsprechend einer Arylsulfonylgruppe bei 1179 cm-1. In dem PMR-Spektrum (bestimmt in DMSO/NaOD) erscheint das anomere Proton als Doublett, das bei #6,5 zentriert ist. Dies deutet auf eine Arabinosekonfiguration der 2'-AnhydroverknUpfung hin. Das 2'-Proton ist ein Triplett, das bei 65,95 lokalisiert ist. UV-Absorpt$on: 259 und 286 (Schulter), #OH-max 257 #.
Methode II: 17,12 g (33,1 mMol) der Verbindung 7 werden in 200 ml eines methanolischen Ammoniaks in einer Bombe aus rostfreiem Stahl gelöst. Die Bombe wird auf 75°C während einer Zeitspanne von 9 Stunden erhitzt. Die Reaktionsmischung wird abgekühlt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der RUckstand wird in 80 ml Wasser aufgelöst und filtriert. Das Filtrat wird mit 80 ml ÄtOH vermischt und mit 2n-HCl (pH 42) angesäuert und in einem Kuhlschrank über Nacht stehengelassen. Dann erfolgt eine Filtration sowie ein Waschen mit MeOH/ÄtOH (50 %, 2 x 35 ml) und ein Trocknen. Man erhält 5,09 g der Verbindung 7 in einer Ausbeute von 47,01 %. Die Verbindung ist identisch-zu der Verbindung, die gemäss der Methode I erhalten wird.
Beispiel 3 Herstellung von 8-Merkapto-9-ß-D-arafinofuranosyladenin-3',5' zyklischem Phosphat (8) Methode I: 1,30 g (4 mMol) der Verbindung 7 werden in 15 ml DNF suspendiert, worauf die Suspension in eine Bombe überführt wird und 2 ml Pyridin und 40 ml eines flüssigen H2S zugeführt werden. Der Bombeninhalt wird auf einer Temperatur von 10000 (Badtemperatur) während einer Zeitspanne von 16 Stunden gehalten, worauf abgekühlt und unter Vakuum zur Trockne eingedampft wird. Der Rtickstand wird an einer Kieselsäuresäule (Mallinkrodt-100 mesh) mit einer Abmessung von 5 x 40 cm adsorbiert. Die Säule wird mit 950 ml Chloroform und anschliessend mit einer Mischung aus Chloroform und MeOH (1/1, Volumen/Volumen) eluiert. Man ermittelt zwei starke UV-absorbierende Peaks. Die Fraktionen, die dem ersten Peak entsprechen, werden gesammelt und eingedampft. Dabei erhält man 0,9 g der Verbindung 8 als weisses Pulver. Diese Verbindung wird aus MeOH/AtOH umkristallisiert, wobei man eine Substanzmenge von 0,835 g in drei verschiedenen Portionen (57,7 %) erhält. Ein Teil wird in Wasser gelöst. Die wässrige Lösung wird auf einen pH von 2 angesäuert. Dabei erhält man die kristalline freie Säure der Verbindung 8, die bei 80°C während einer Zeitspanne von 4 Stunden im Vakuum getrocknet wird.
Analyse: C10H12N5O6PS. H20 Berechnet C 31,60, H 3,72, N 18,46 Gefunden: C 31,44 H 3,48, N 18,34.
UV-Absorption: #pH1max 244 (# 10 620) und 308 # (# 26 170), #pH11max 294 (# 23 970).
PMR (in D20) zeigt das anomere Proton als charakteristisches Doublett, das bei #7,0 zentriert ist.
Methode II: 7,7 g (23,3 mMol) der Verbindung 7 werden in 110 ml DMF in einer Bombe aus rostfreiem Stahl suspendiert, worauf 55 ml eines flüssigen H2S unter Ausschluss von Feuchtigkeit zugeführt werden. Der Bombeninhalt wird bei einer Temperatur von 11000 während einer Zeitspanne von 20 Stunden gehalten und abgekühlt, worauf der ausgefallene Rückstand mit Hilfe von 100 ml ÄtOH filtriert, mit 100 ml Äther gewaschen und unter Saugen getrocknet wird. Dabei erhält man ein fast reines Produkt 8 in Form eines weissen pulverförmigen Materials in einer Menge von 5,39 g.
Das Produkt wird in 30 ml H20 aufgelöst und filtriert. Dem Filtrat werden 30 ml AtOS zugesetzt. Dann wird unter Verwendung von 2n-H0l auf einen pH<2 angesäuert. Das ausgefallene Produkt 8 wird bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 1 Stunde gehalten und dann filtriert. Der Niederschlag wird mit wässrigem itOH (5 ml, 50 %)' gewaschen und dann bei 600C unter einem Druck von 0,1 mmHg während einer Zeitspanne von 4 Stunden getrocknet. Auf diese Weise erhält man 3,85 g des chromatographisch homogenen Produktes 8. Das Filtrat ergibt bei einem weiteren Ansäuern eine weitere Menge von 0,20 g.
Das ursprüngliche Filtrat aus der Reaktionsmischung und die Waschlösungen werden miteinander vermischt, eingedampft und an einer trockenen Kieselsäuresäule (4,5 x 18,0 cm) adeorbiert.
Die Säule wird mit 50 %igem methanolischem Chloroform (150 ml) und anschliessend mit 10 %igem methanoliachem Ammonialc (es werden 10 ml-Fraktionen gesammelt) eluiert. Die Fraktion, welche dem reinen Produkt 8 entspricht, wird gesammelt und eingedampft.
Der Rückstand wird in MeOH unter Verwendung von 2n-NH4OH aufge-Iöst und durch Ansäuern ausgefällt. bei erhält an 1,3 g des reinen Produktes Bo Die Gesamtausbeute beträgt 5,15 g (61,2 %).
Beispiel 4 Herstellung von 9-ß-DßArabinofuranoszladenin-3',5'-zyklischem Phosphat (2) 3,04 g (8 mMol) der Verbindung 8 werden in 250 ml Ne OH, das 10 ml NH4OH (2n) enthält, aufgelöst. Der Lösung werden 36 g (Feuchtgewicht) Raney-Nickel-Katalysator zugesetzt, worauf die Mischung während einer Zeitspanne von 18 Stunden unter Rückflusstemperatur (Badtemperatur 750C) gehalten wird. Dann wird der Katalysator durch eine Infusorienerde-Schicht filtriert und mit 100 ml MeOH, das 10 ml 2n-NH4OH enthält9 filtriert.
Das Filtrat sowie die Waschlösungen werden zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 30 ml MeOH und einigen Tropfen 2n-NH40H aufgelöst. Die Lösung wird filtriert und angesäuert.
Dabei fällt das Produkt 2 in Form der freien Säure in einer Menge von 2,05 g aus. Das Filtrat liefert bei der Konzentrierung eine weitere Portion von 0,24 g. Die Gesamtausbeute beträgt 2,24 g (81 %). Das Produkt wird durch Auflösen in Wasser und Ansäuern umkristallisiert und bei 80 °C während einer Zeitspanne von 4 Stunden unter einem Druck von 1 mmEg getrocknet.
Analyse: C10H12O6N5P Berechnet: C 36.48, H 3.67, N 21.09 Gefunden: C 36,20, Ü 3,52, N 21,27.
UV-Absorption: #pH1max 256 (# 15 200), #pH11max 258 # (# 15 400) Beispiel' 5 Das erfindungsgemässe Antivirusmittel wird auf seine Aktivität nach der Virus-Bewertungsmethode (VR-Methode) von Sidwell et al "Proc.Soc.Exp.Biol.Med" 131,1223-30 (1969) bestimmt, wobei diese Methode dahingehend modifiziert wird, dass nur eine Virusmenge mit wechselnden Zahlen von Bechern pro Menge eingesetzt wird, eo dass die Virusaktivität in der Weise bestimmt wird, dass der eingestellte "Gesamt-C-T-Wertn durch die Anzahl der verwendeten Becher bei jeder Menge geteilt wird, wobei ferner dieses Ergebnis durch 10 dividiert wird. C-T" für eine jeweilige Menge ist der Reat, der bei der Subtraktion der cytopathischen Wirkung der behandelten Zellen von der Wirkung der nicht-behandelten, jedoch infizierten Vergleichszellen anfällt. Wird bei dieser Menge eine Toxizität festgestellt, dann wird der "C-T-Wert" durch Dividieren durch 2 "eingestellt".
Eine Virusbewertung (VR) von mehr als 1 zeigt eine definitive Antivirusaktivität, eine Virusbewertung von 0,5 bis 0,9 ist ein Zeichen fUr eine mässige Antivirusaktivität, während eine Virusbewertung von weniger als 0,5 zu erkennen gibt, dass nur eine geringe oder Überhaupt keine erkennbare Antivirusaktivität vorliegt.
Zur Durchführung der Antivirus-Versuche wird das Antivirus-Mittel (Verbindung 2) in Form des Ammoniumsalzes in einem Zellenkulturmedium aufgelöst, das aus Vitaminen, Aminosäuren, Serum, Puffer, Penicillin, Streptomycin und Indikatorfarbatoff in Wasser besteht. Der in dem Zellenkulturmedium suspendierte Virus wird einer vorbereiteten Monoschicht von EB- oder RK13-Zellen zugesetzt, worauf ein gleiches Volumen des Antivirus-Mittels innerhalb von 15 Minuten zugegeben wird. Die infizierten behandelten Zellen werden während einer Zeitspanne von 3 Tagen inkubiert. Das Ausmaß der cytopathogenen Wirkung (CPE) auf die Zellen wird anschliessend an eine mikroskopische Untersuchung ermittelt. Ferner werden pro Experiment Vergleichsversuche durchgeführt, die in einer Zellenkontrolle (nur Zellen und Zellenkulturmedium), in einer Viruskontrolle (Zellen und Virus- und Zellenkulturmedium) und in Toxizitätskontrollen (Zellen sowie chemisches Medium und Zellenkulturmedium) bsstehen.
Von den zur Durchführung der Antivirus-Experimente eingesetzten Viren versacht der Herpes-Typ 1 Labialis (Bläschenflechte), Herpes keratitis und Herpes encephalitis, während der Herpes-Typ 2 Herpes genitalis, eine verbreitete und ansteckbare Form einer Geschlechtskrankheit, zur Folge hat. Der Herpesvirus verursacht auch infektiöse Nononukleosis, Burkitt's Lymphoma und cervicale Carcinome. Myxoma hat den Tod von Haus- und Wildkaninchen zur Folge, welchem Atmungsbeschwerden u:;id starke Schwellungen vorangehen. Pseudorabies verursacht eine infektiöse bulbäre paralyse, die auch als "mad itch"-Krankheit bei Vieh-Schafen, Schweinen, Hunden und Netzen bekannt, ist. Vaccinia ist eine avirulente Form von Pockenviren, die für Pockenimpfungen verwendet werden0 Sie tritt gelegentlich als unerwünschte Nebenwirkung auf.
Die Ergebnisse der Antivirus-Experimente sind in den Tabellen I und III bis VI zusammengefasst. In der Tabelle II sind die Ergebnisse eines typischen Antivirus-Versuches unter Verwendung von Ara-A zu Vergleichszwecken gezeigt. Die Tabellen :gII bis VI enthalten vergleichbare Virusbewertungen von Ara-A1, Tabelle I Wirkung von 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-3',5'-zyklischem Phosphat auf den Herpes-Typ 1-Einfachvirus in einer Zellenkultur Versuch Nr. 1 VirusdosisÖ Versuch Nr. 2 Virusdosis: 320 Zellenkultur, 50 %ige Infektionsdosen (CCID50)/ml 320 CCID50/ml Tons, Toxizität gegen- Inhibie- Konz. Toxizität gegen- Inhibieder Über KB-Zellen rung d. der über-Zellen rung des Verb. Virus, CPE Verb. Virus, CPE (#g/ml) (#g/ml) 1000 leicht toxisch 100 % 1000 leicht toxisch 100 % 320 leicht toxisch 86 % 320 leicht toxisch 100 % 100 sehr leicht 86 % 100 sehr leicht 100 % toxisch toxisch 32 nicht toxisch 86 % 32 nicht toxisch 88 % 10 nicht toxisch 73 % 10 nicht toxisch 64 % 3,2 nicht toxisch 67 % 3,2 nicht toxisch 0 % 1,0 nicht toxisch 26 % 1,0 nicht toxisch O % Virusbewertung (VR) = 1,4 VR = 1,1 Tabelle II Wirkung einer bekannten aktiven Verbindung, und zwar 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin (Ara-A), auf Herpes-Typ 1-Einfachviren in einer Zellenkultur Virusdosis: 320 CCID50/ml Konzentration der Toxizität gegenUber - Inhibierung des Verbindunge (#g/ml) KB-Zellen Virus, CPE 1000 toxisch 320 leicht toxisch 100 % 100 aehr leicht toxisch 100 % 32 nicht toxisch 82 % 10 nicht toxisch 70 % 3,2 nicht toxisch 30 % 1,0 nicht toxisch % VR = 1,0 Tabelle III Wirkung von 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-3',5'-zykliscem Phosphat auf Herpes-Typ 2-Einfachviren in einer Zellenkultur Virusdosis: 320 CCID50/ml Konzentration der Toxizität gegen- Inhibierung des Verbindung (#g/ml) über KB-Zellen Virus, CPE 1000 leicht toxisch 100 % 320 leicht toxisch 100 % 100 leicht toxisch 100 % 32 sehr leicht toxisch 88 % 10 nicht toxisch 62 % 3,2 nicht toxisch 38 % 1,0 nicht toxisch O % VR = 1,2 Ara-VR = 0,7 Tabelle IV Wirkung von 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-3',5'-zykliscem Phosphat auf Vaccinia-Viren in einer Zellenkultur Virusdosis: 320 CCID50/ml Konzentration der Toxizität gegen- Inhibierung des Verbindung (#g/ml) über KB-Zellen Virus, CPE 1000 leicht toxisch 100 % 320 leicht toxisch 10) % 100 leicht toxisch 94 % 32 leicht toxisch 88 % 10 nicht toxisch 3,2 nicht toxisch 6 % 1,0 nicht toxisch VR = 0,9 Ara-A = 0,9 Tabelle V Wirkung von 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-3',5'-zykliscem Phosphat auf Myxoma-Viren in einer Zellenkultur Virendosis: 10 CCID50/ml Konzentration der Toxizität gegen- Inhibierung des Verbindung (#g/ml) über KB-Zellen Virus, CPE 1000 toxisch 320 leicht toxisch 100 % 100 leicht toxisch 100 % 32 sehr leicht toxisch 100 % 10 nicht toxisch 41 % 3,2 nicht toxisch 16 % 1,0 nicht toxisch O ffi VR = 0,5 Ara-A = 0,8 Tabelle VI Wirkung von 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-3',5'-zykliscem Phosphat auf Pseudorabies-Viren in einer Zellenkultur Virendosis: 32 CCID50/ml Konzentration der Toxizität gegen- Inhibierung des Verbindung (#g/ml) über KB-Zellen Virus, CPE 1000 toxiach 320 leicht toxisch 100 % 100 sehr leicht toxisch 100 % 32 nicht toxisch 37 % 10 nicht toxisch 6 % 3,2 nicht toxisch 0 % 1,0 nicht toxisch 0% VR = 0,5 Ara-A VR = 0,6 Zu weiteren Vergleichs zwecken werden entsprechende Antivirus- Aktivitätswerte fUr'5-Jcd-2'-deoxyuridin (IDU) und 1-B-D-Arabinofuranosylcytosin (Ara-C) in der Tabelle VIIaufgeführt.
Tabelle VII 5-Jod-2'-deoxyuridin (IDU) 1-ß-D-Arabinofuranosylcytosin (Ara-C) Herpes-Typ 1-Einfachvirus 1,0-1,4 1,1, 1,2 Herpes-Typ 2-Einfachvirus 1,8 0,8 Pseudorabies 0,6 0,4 Vaccinia 1,3 0,8 Myxoma 0,8 0,6 Zellentoxizität : 10 Mikrogramm/ml 1,0 Mikrogramm/ml sehr unlöslich löslich bei 2000 mgXml (maximale Löslichkeit 0,1 %) Aus den vorstehenden Ergebnissen ist zu ersehen, dass das erfindungsgemässe Antivirusmittel in vitro eine Aktivität besitzt, die wenigstens so hoch ist wie diejenige von Ara-A und in den Fällen der Herpes-Viren der Typen 1 und 2 merklich höher als diejenige von Ara-A. Diese Aktivität ist vergleichbar mit der Aktivität von entweder IDU oder Ara-C oder ist sogar noch besser.
Ferner besitzt 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-3',5'-zyklisces Monophosphat den er,heblichen Vorteil, dass es in einer wässrigen Lösung in einem wesentlich grösseren Ausmaße als Ara-A oder IlU löslich ist, so dass gleichmässigere Präparate hergestellt werden können und ein besseres Eindringen in Körpergewebe -soie eine bessere Adsorption durch diese Gewebe möglich ist.
Beispiel 6 In dem folgenden Beispiel wird die Antivirus-Aktivität in vivo von 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-3',5'-zykliscem Monophosphat bestimmt. Bei der Durchführung von allen drei Versuchen werden letale Infektionen von Herpes- und Vaccinia-Viren verwendet.
Wie aus der Tabelle VIII hervorgeht, zeigt das Mittel eine ausgeprägte Wirksamkeit. Bei der Durchführung von Versuch 4 werden Vergleichswerte für Ara-A ermittelt, welche zeigen, dass Ara-A beträchtlich weniger aktiv als das erfindungsgemässe Antivirusmittel gegenüber Vaccinia-Viren ist. Ferner ist Ara-A stark unlöslich, so dass es sehr schwierig ist, die Tiere zu beimpfen, Nachfolgend sind die einzelnen Versuchsprotokolle zusnnengefasst: Versuch 1: 24 - 26 g schwere männliche Swiss-Webster-gäuse werden intracerebral (i.c.) mit 0,03 ml des Ammoniumsalzes der Verbindung 2, gelöst in einer sterilen Kochsalzlösung, oder nur mit einer sterilen Kochsalzlösung allein geimpft. Die Dosis beträgt 40 mg/kg. Dies ist ungefähr die maximale Dosis, die von den Mäusen toleriert werden kann. 24 Stunden später warden die Tiere intracerebral mit 40 50 % letalen Dosen (40 LD50) von Vaccinia-Virus (WR-Stamm) geimpft. Die Tiere werden dann täglich während einer Zeitspanne von 14 Tagen beobachtet, wobei die Mortalität aufgezeichnet wird. Die Antivirus-Aktivität gibt sich dadurch zu erkennen, dass die Anzahl der Uberlebenden, mit dem Wirkstoff behandelten Tiere oder die mittlere Überlebenszeit gröber ist als im Falle der infizierten Tiere, die nur mit der Salzlösung allein behandelt worden sind.
Versuch 2: Dieser Versuch ist mit dem Versuch 1 identisch, mit der Ausnahme, dass die infizierten Mäuse mit der Verbindung 2 oder mit'der Salzlösung 6 Stunden nach der Virusbeimpfung behandelt werden.
Versuch 3: Bei der Durchfuhrung dieses Versuches werden Mäuse intracerebral mit 10 LD50 des Herpes-Typ 1-Einfachvirpx (Stamm 123) beimpft und 6 Stunden später intracerebral, mit 40 mg/kg der Verbindung 2 oder einer Salzlösung behandelt. Die Tiere werden erneut täglich wäbrend einer Zeitspanne von 14 Tagen beobachtet.
Versuch 4: Dieser Versuch ähnelt dem Versuch 2 und wird unter Verwendung von 100 mg/kg Ara-A durchgeführt. Die Ara-A-Dosis ist gegenüber den Mäusen mässig toxisch, wobei 3 von 6 Vergleichstieren getötet werden.
In vivo-Antivirus-Aktivität von 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-3',5'-zyklischem Phosphat Überlebende Tiere / Überlebende Mittlere Über- Mittlere Zu-Gesamt Tiere lebenszeit von nahme der p1 Mäusen, die am Überlebens-oder vor dem 14. zeit Tag sterben p² Versuch 1 Vaccinia-Virus + Salzlösung 0/10 5,7 Vaccinia-Virus + Verbindung 2 3/9 # 0,3 7,3 #0,05 Versuch 2 Vaccinia-Virus + Salzlösung 0/10 5,7 Vaccinia-Virus + Verbindung 2 6/10 # 0,05 10,7 #0,01 Versuch 3 Vaccinia-Virus + Salzlösung 0/10 5,7 Vaccinia-Virus + Verbindung 2 9/10 # 0,01 #11,0 #0,05 Versuch 4 Vaccinia-Virus + Salzlösung 2/20 4,3 Vaccinia-Virus + Verbindung 2 0/4 - 7,0 #0,05 1p = Wahrscheinlichkeit , dass irgendeine Zunahme der Anzahl der Überlebenden Tiere in den virusinfizierten behandelten Gruppen im Vergleich zu der mit der Salzlösung behandelten Gruppe auf einen Zufall zurückführen ist, bestimmt nach der Chi-Quadratanalyse.
p # 0.3 = merklich, p # 0.05 = stark ausgeprägt.
2p = Wahrscheinlichkeit , dass irgendeine beobachtete Zunahmeder mittleren Überlebenszeit von mit Virus infizierten behandelten Gruppen im Vergleich zu den mit Salzlösung behandelten Gruppen auf einen Zufall zurückzuführen ist, bestimmt nach dem t-Test.
p # 0.05 = merklich, p # 0.01 = stark ausgeprägt.
Wird das erfindungsgemässe Antivirus-Mittel eingesetzt, dann wird es in wässrigen Lösungen verwendet, die ungefähr 0,025 bis ungefähr 10 Gewichts-% des Mittels, bezogen auf das Gesamtgewicht der Lösung, enthalten. Zum Einspritzen in Tiere wird eine physiologische Kochsalzlösung verwendet, die ungefähr 10 bis ungefähr 250 mg des Mittels pro. ml der Lösung enthält. Für eine orale Verabreichung in Form von Tabletten oder Kapseln werden ungefähr 5 bis ungefähr 500 mg/Tablette oder Kapsel verwendet. Bei den Kapseln handelt es sich um die üblichen Gelatinekapseln, die zusätzlich zu dem Antivirus-Mittel eine kleine.
Menge, beispielsweise weniger als 5 Gewichts-% und vorzugsweise weniger als 1 Gewichts-%, Magnesiumstearat oder eines anderen Gleitmittels, wie beispielsweise "Avicelf' (Carboxymethylsellulose) enthalten können. Die Tabletten enthalten das Antivirus-Mittel und ein Bindemittel, wie beispielsweise eine Gelatinelösung, eine Stärkepaste in Wasser, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol in Wasser etc., und weisen einen typischen Zuckerüberug auf. Im Falle einer oral zu verabreichenden Lösung werden ungefähr 10 bis ungefähr 50 mg des Mittels pro ml der wässrigen Lösung verwendet, wobei diese Lösung auch kleine Mengen an typischen Färbemitteln und/oder geschmacksgebenden Mitteln enthalten kann. FUr topische Verwendungszwecke fUr die Augen oder für die Haut kommt eine wässrige Lösung in Frage, die zusätzlich zu der angegebenen Menge des Wirkstoffes bis zu ungefähr 1,4 Gewichts-% Polyvinylalkohol enthält. Im Halle einer Creme kann eine Petrolatum-Grundsalbe verwendet werden, die Sorbitanmonolaurat und Wasser mit Methgl- und Propylparabenen als Schutzmittel enthält. Es kommt auch ein weichgemachtes Eohlenwasserstoff-Gel in Frage, beispielsweise das Gel, das von Squibb unter dem Warenzeichen "Plastibasen in den Handel gebracht wird (eine Gelbase aus Polyäthylen und einem Mineralöl).
Diese Unterlagen enthalten ungefähr 0,025 bis ungefähr 10 Gewichts- des Wirkstoffs. Die exakte Menge des Antivirus-Mittel3, die in einem gegebenen Falle eingevetst wird, schwankt natürlich innerhalb der angegebenen Bereiche in Abhängigkeit von zahlreichen Faktoren, wie beispielsweise dem Ausmaß und der Art der Virusinfektion etc. In jedem Falle bereitet die Auswahl der richtigen Menge dem Fachmann keine Schwierigkeiten.

Claims

Patentansprüche

Verbindungen der allgemeinen Formel worin X fUr H, OH, SH, ein Halogen oder einen Anhydrorest steht, R H oder Acyl bedeutet, R1 H oder OH versinnbildlicht, R2 H oder eine verdrängbare Gruppe, wie beispielsweise Tosil, darstellt, und Y H, ein Alkalimetall oder Ammonium ist.
2. 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-3',5'-zyklisches Monophosphat.
3. Verfahren zur Herstellung von 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-3',5'-zyklisches Monophosphat, dadurch gekennzeichnet, dass ein 8-H'alogen-3'5'-zyklisches Adenosin-Monophosphat unter Einbringung einer verdrängbaren Gruppe in die bestellung behandelt wird, diese 2'-Verbindung sur Gewinnung eines ?'-O-verdr.GrupPe 8-Hydroxyladenosin-3',5'-zyklischen Monophosphats mit einer Lösung behandelt wird, die Essigsäure und Natriumacetat enthält, anschliessend diese Hydroxyladenosin-Verbindung zur Gewinnung von 8-2'-Anhydro-8-oxy-9-ß-D-arabinofuranosyladenin-3',5'-zyklisches Monophosphat behandelt wird, diese Anhydroverbindung mit flüssigem Schwefelwasserstoff zur Gewinnung von 8-Merkapto-9-ß-D-arabinofuranosyladenin-3' 51 -zyklischem Monophosphat behandelt wird und anschliessend diese Merkaptoverbindung in das 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-3',5'-zyklische Monophosphat umgewandelt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung aus Essigsäure und Natriumacetat Essigsäureanhydrid enthält, und das 2' -O-verdrängbare Gruppe-6-N-Acetyl-8-hydroxyladenosin-3',5'-zyklische Monophosphat erzeugt wird, das anschliessend mit methanolischem Ammoniak zur Gewinnung der Anhydroverbindung umgesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die 8-Merkaptoverbindung in das 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-3',5'-zyklische Monophosphat durch Reduktion in Gegenwart eines Raney-Nickel-Katalysators umgewandelt wird.
6. Verfahren zur Herstellung von 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-3',5'-zyklisehem Monophosphat, dadurch gekennzeichnet, dass 8-Brom-3',5'-zyklisehes Adenosin-Monophosphat zur Gewinnung von 2'-0-Tosyl-8-bromadenosin-3',5'-zyklischem Monophosphat tosyliert wird, das 2'-Dosylat mit einer Lösung von Essigsäure, Natriumacetat und Essigsäureanhydrid zur Gewinnung von 2'-0-Tosyl-6-N-acetyl-8-hydroxyladenosin-3',5'-zyklischem Monophosphat behandelt wird, anschliessend das 2'-0-?osyl-6-N-acetyl-8-hydroxyladenosin-3',5'-zyklische Monophosphat mit einer Lösung von methanolischem Ammoniak zur Gewinnung von 8-2'-Anhydro-8-oxy-9-ß-D-arabinofuranosyladenin-3',5'-zyklischem Monophosphat behandelt wird, das Anhydroarabinofuranosyladenin-3',5'-zyklische Monophosphat mit flüssigem Schwefelwasserstoff zur Gewinnung von 8-Merkapto-9-ß-D-arabinofuranosyladenin-5',5'-zaklisehem Monophosphat behandelt wird und darauf das Mekaptoarabinofuranosyladenin-3',5'-zyklische Monophosphat zu dem 9-ß-D-arabinofuranosyladenin-3',5'-zyklischenMonophosphat umgewandelt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung mit methanolischem Ammoniak in zwei aufeinanderfolgenden Behandlungen besteht, wobei bei der ersten Behandlung 2'-0-Tosyl-8-hydroxyladenosin-3',5'-zyklisches Monophosphat entsteht, und bei der zweiten Behandlung mit methanolischem Ammoniak 8-2'-Anhydro-8-oxy-9-ß-D-arabinofuranosyladenin-3',5 zyklisches Monophosphat erzeugt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die 8-Merkaptoverbindung durch Reduktion in Gegenwart eines Ratey-Nickel-Katalysators umgewandelt wird0
9. Antivirus-Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-3',5'-zyklisches Monophosphat zusammen mit üblichen Trägern und Hilfsstoffen.
10. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es aus einer wässrigen Lösung besteht, die ungefähr 0,025 bis ungefähr 10 Gewichts-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Lösung 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-3',5'-zyklisches Monophosphat enthält.
11. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung ungefähr 1,4 Gewichts-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Lösung, Polyvinylalkohol enthält0
12. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es aus einer Kohsalzlösung besteht die ungefähr 10 bis ungefähr 250 mg 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-3',5'-zyklisches Monophosphat pro ml der Lösung enthält0
13. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es aus einer Salbe besteht, die ungefähr 0,025 bis ungefähr 10 Gewichts-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitung, 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-3',5'-zyklisches Monophosphat enthält.
14. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es aus Tabletten oder Kapseln besteht, die ungefähr 5 bis ungefähr 500 mg 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-3',5'-zyklisches Monophosphat pro Tablette oder Kapsel enthalten.