DE2253297A1

DE2253297A1 - Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten

Info

Publication number: DE2253297A1
Application number: DE2253297A
Authority: DE
Inventors: Rolf Dipl Chem Dr Geiger; Dietrich Langner; Hans Dipl Chem Dr Wissmann
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1972-10-31
Filing date: 1972-10-31
Publication date: 1974-05-30
Also published as: FR2204617B2; AT333448B; NL7314766A; BE806832R; US3884897A; DE2253297B2; FR2204617A2; JPS4980092A; AU6198173A; JPS528836B2; ATA916273A; GB1453865A; DD113352A6

Description

FARBWERKE HOECHST AG vormals Meister Lucius & Brüning

Aktenzeichen:

HOE 72/F

Datum: 2M, Oktober 1972 Dr. Hg/stl

Verfahren zur Herstellung von Insulin, Insulin-Analogen und -Derivaten

Zusatz zu P ...» (HOE 72/P 326)

Gegenstand dee Hauptpatents ist ein Verfahren zur Herstellung von Insulin, Insulin-Analogen und -Derivaten, das dadurch gekenn zeichnet ist, daft man eine Verbindung der allgemeinen Formel I

CO-

SX

O=C- [GIy A-Kette

SX X

ν-:

Ly

1 B-Kette

in der X Wasserstoff oder eine S-Schutzgruppe und Y Wasserstoff, einen Alkanoylrest mit 1 bis ¹I C-Atomen, einen Phenyl-alkanoylrest mit 1 bis 3 C-Atomen im Alkanoylteil, Benzoyl oder einen Alkyl-oxycarbonyl- bzw. Aralkyl-oxycarbonylrest, wobei der Alkylteil 1 bis k C-Atome enthält, einen Amino-acyIrest, der sich von den natürlich vorkommenden^- oder ß-Amino3äuren oder gegebenenfalls deren D-Enantiomeren ableitet, oder Acyl-aminoacylrest bedeutet und h einen Rest der allgemeinen Formel II

-CH-W-CH-

NH
Ac

NH

1 Ac

II

darstellt, in der Ac eine protonensolvolytisch abspaltbare N-Schutzgruppe ist und W für (CH₂J₃ bis (CH₂J₁₁, CH₃-S-CH₂,

409822/1101

CH₀-S-CH₀-CH₀ und für deren Sulfone steht, durch Abspaltung von Ac

2i Δ Δ
und X und Dehydrierung in eine Verbindung der allgemeinen

Formel III

	GIy	•	s—	R'	k	CO	-	,ys

		ι - S I S	A-Kette

O=C-	B-Kette

überführt wird, in der Y die obengenannte Bedeutung besitzt und R¹

-CH-W-CH-

NH₂ NH₂

steht und W die obengenannte Bedeutung besitzt, und aus dieser Verbindung die -CO-R'-CO- Brücke durch Edman-Abbau herausspaltet.

Gegenstand des Hauptpatents sind ferner Verbindungen der allgemei-Forraeln I und III, in denen R, R', X und Y die oben angegebene Bedeutung besitzen.

Gegenstand des Zusatzpatentes ist ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel III, in der R¹ einen Rest der allgemeinen Formel

-CH₀-NH-(CH₀) -NH-CH₀-

Δ Δ Yl Δ

bedeutet, worin η für die Zahlen 2 oder 3 steht, während Y die im Hauptpatent angegebene Bedeutung hat und in der allgemeinen Formel I des Hauptpatentes R den Rest der allgemeinen Formel II

-CH₂-N-(CH₂)_n-N-CH₂-

I II

Ac Ac

bedeutet, worin η für die Zahlen 2 oder 3 steht.

Gegenstand des Zusatzpatentes sind ferner Verbindungen der allgemeinen Formeln I und III des Hauptpatentes, in denen R die obige Bedeutung besitzt und R' die Bedeutung -CH₀-NII-(CH₀) -NH-CH₀- hat

ζ δ η 2

4 0 9 822/1101

-- 3 - HOE 72/F

η für die Zahlen 2 oder 3 steht, während X und Y die im Hauptpatent genannte Bedeutung haben.

Die für die bifunktionelle Brücke verwendeten Ausgangsverbindungen

I *

HOOC-R'-COOH mit R« = -CH₀-NH-(CH₀) -NH-CH₀- und η = 2 oder 3 sind bekannt.

Bei dem erfindungsgeraäßen Verfahren des Susatzpatents zur Verknüpfung der A- und B-Ketten des Insulins geht man beispielsweise so vor, daß man als Aktivester z.B. den äJ-Mitrophenylester der . nachstehenden Formel umsetzt -

NPO-CO-CH₀-N-CH₀-CH₀-N-CH₀-CO-ONp £. τ * 2 I c

- 2 - 2 j Boc Boc

Hin arbeitet nach der im Hauptpatent beschriebenen Weise und erhält dementsprechend ein Zwischenprodukt der Formel

NpO-CO-CH^-N-CHg-CHg-N-CHg-CO-A-Ketten-sulfonat Boc Boc

Als Reaktionsprodukt entsteht eine schwerlösliche Verbindung der Formel I mit X = SO ", R = -CH₂-N(BOc)-CH₂-CH₂-N(BoC)-CH₂-

und Y = Boc-QIy.

Die beschriebene Verknüpfung von A- und B-Ketten kann wie im Hauptpatent auch in umgekehrter Reihenfolge vorgenommen werden.

Nun spaltet man durch 30 bi3 60 Minuten Behandeln mit Trifluore83igsüure die Boc-Gruppen ab, fällt das Reaktionsprodukt.mit Äther und nimmt die getrocknete Substanz in hinreichend Wasser von pH 5 bis 8 auf. Man versetzt unter Stickstoff bei 0 bis 60 C mit einem 10 bis 200-fachen Überschuß an Thioglycol, extrahiert nach

409822/1101.-

- 4 - HOE 72/P 331

5 bis 100 Minuten Reaktionszeit bei Rauntemperatur mit Essigester, trennt ab und. vertreibt restlichen Essigester mit Stickstoff. Dann verdünnt man auf eine Konzentration von O₁I bis 0,5 J,stellt das
pH auf etwa 10.6 ein und rührt über Nacht bei 0 bis 20' C im langsamen Luftstrom. Anderntags stellt man mit 1 η HCl auf pH 5.5 und ' Iyophilisiert oder dampft im Vakuum zur Trockene ein.

Zur Reinigung, Edman-Spaltung und Isolierung der Insuline arbeitet maη wie im Mauρtρateηt bes chriebeη.

A u c h i hi V e r f ah r e η d s s Z u satz ρ a t e η t s k δ η η en anstelle der in den
nachstehenden Beispielen beschriebenen Synthesen von A- und B-Ketten mit Hilfe der Fentkörpertechnik auch die bekannten Methoden der

Pragmentkondei !,sation , ■ fie ζ .B. Carbodiimid-Methode , gegebenenfalls

unter Z u s a t ζ ν c η N - ί Iy d ι ο χ y - s υ c c i η i mi d, 1 - H y d r ο χ y b e η ζ ο t riazoien,

3-Hydroxy-3-oxo-3>^-dihydro-1,2 ₁ 3 benzotriaziη oder 4er Azid-Methode

zur Herateilung der jeweils al ι Ansgangsmaterial benutzten A- und

B-Ketten herangezogen werden.

__β £■ _Μ

HOE 72/P 331 Beispiel 1

Rinder- Insulin

a) Α-Kette - S-Tetrasulfonat (RI

wird wie im Hauptpatent_s Beispiel la) hergestellt»

b) N^-Boc-Gly-B-Kette-S-disulfonafe

siehe Hauptpatent, Beispiel Ib)

c) Herstellung von Brückenreagentien

) /N.N'-Di-Boc-Äthylendiamin-N,W'-diesaigsäure

8,8 g Äthylendiamin-N.N"-diessigsäure werden in 60 ml Dioxan und 50 ml Wasser gelöst. Man versetst mit 28 ml Triäthylamin und 21 ml Boc-azid und rührt 21 Stunden kräftig bei 50⁰C (nach 21 Stunden wurden nochmals I¹J ml Triäthylamin zugefügt)«

Dann engt man auf ein kleines ¥olua@n ein, säuert bei 0⁰C mit KHSOjj-Lösung an, extrahiert mit Essigester„ wäaeht die Essigesterphase mit Wasser, trocknet über Ha₅SQ,, und destilliert den Essigester im Vakuum ab. Dex° Rückstand wird aas Sssigester umkristallisiert. Ausbeute 12,8 g* Schmp₀

ß) N.N'-Di-Boc-Kthylendiaiain-M.N'-diessigsäure-bis-W-hydroxysuccinimidester

3.7 g Säure und 2,3 g HOMS« werden in 100 ml·Dioxan gelöst. Man versetzt bei Raurotemperatur mit 5·_Ο3 g DCC und rührt über Nacht. Der Niederschlag (9*5 g) wird abfiltriert und mehrfach mit heißem Acetonitril extrahiert. Die beim Abkühlen ausgefallene Verbindung wird'noch zweimal aus Ae©ton£tril/Ffetfaanol usnkristallisiert. Ausbeute 3,5 g* Sehiapo 216 bis 21?°C -(Zersetzung)

"4 09822/1101

- 6 - HOE 72/F 331

K) N.N " -Di-Boc-Äthylendiamin-M.N¹ -diessigsäure-bis-'J-nitro-

£h enylester .

3,7 g Säure und 3,2 g ^-!Jitrophenol werden in 100 ml Dioxan gelöst Man versetzt mit 5,3 g DCC₁ rührt über Nacht, filtriert von Harnstoff ab, dampft das Lösungsmittel irn Vakuum ein und fällt den öligen Rückstand zweimal aus Diisopropyläther/Petroläther um. Zur Reinigung wird aus laopropanol umkristallisiert. Ausbeute 3,5 g, Schrop. 131 bis 133°C.

cf) N. N' -Di-Boc-PropyleridiaiTiin-N. N¹ -diesaigsäure-bis-^-nitrophenylester _i

Aus der nach Beispiel 1 c) hergestellten Di-Boc-Verbindung (Ausbeute 72 %, Schmp. 148 tail 151⁰C) wird analog Beispiel Ic) der Bis-^-nitrophenyleater hergestellt. Ausbeute 68 %_t Schmp. 126 bis 128°C.

dj Rinder-Insulin

Ea wird wie im Hauptpatent, Beispiel 1 d) gearbeitet.

2.8 g dee nach a) .hergestellten Α-Ketten tetrasulfonat3 werden in 100 ml 90-proz· Di methyl formamid unter Zugabe von N-Äthyl-morpholin auf pH 7.5 gebracht und mit 1.8 g des nach Ic ) hergestellten Nitropheny!ester gerührt. Nach 20 Stunden wird mit Essigester gefällt. Man erhält 2.6 g Mono-A-Ketten-tetasulfonat des Di-Boc-Äthylendiamin-diessigeäure-mononitropheny!esters (8? t). Nun nimmt man wieder in 100 ml Dimethylformamid auf gibt 3»0 g des nach Beispiel Ib) hergestellten ¹^- -Boc-Gly-B-Kettendisulfonats, 120 mg 1-Hydroxybenzotriazol und elwö.3 Triätnylamin (bis pH 9) zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigeater gefällt, Ausbeute 5.^5 g· Dan' rohe Reaktionsprodukt wird in 10 ml Trifluoreseigsäure aufgenommen. Nach *tO Minuten fällt man mit 400 ml Äther · 5.0 g Verbindung der allgemeinen Formel I mit R' =

C H,, -NH-CH₂-CH,, - N H - C H , -

8 22 / 110 1

HOE 72/P 331

anstelle von R, X = SO₃" und 1 =

■Das Produkt wird in 0.5 Liter Wasser von pH 7 «5 auf genommen. Man setzt 50 ml Thioglykol zu₉ bewahrt 1 Stunde' unter Stickstoff auf„ erwärmt noch 1 Stunde auf <sa„ ^0⁰C_s kühlt wieder auf ca« 20 C ab und extrahiert zweimal mit je 300 ml Kssigester, Der Essigester wird abgetrennt, der Rest durch einen Stickstoffstrom vertrieben« Dann verdünnt man auf 5 Liter und stellt mit 1 η NaOH auf pH 10.6 rührt 18 Stunden im leichten Luftstrom bei 10⁰C₅ gibt 1 η HCl bis pH 5.5 zu und i

Der Rückstand wird in 50 ml iO-proz. Essigsäure gelöst und über eine Säule 4 χ 100 cm Sephadex G-?5₂ fine» ehromatographiert„ Di® Säule ist mit Insulin geeicht» Mach einem Vorpeak (1.5-g) erscheint der Insulinpeais (2„(| g)_o Der ¥orpealc wird mit Difchiothreitol in. fluss<. Asnaonialc reöüaiert und in 1„5 Liter Wasser wie oben bei pH 10.6'oxydierte

Die nach Chromatographie erhaltenen 2„6 g vorletztes Rohinsulin werden in 60 ml 95-pros« Fyridin 3 Stunden bei 26°C mit 0_s7 al Phenylsenföl gerührt. Das Fyridin tdlpol auf 10 sil eingeengt. Dur eh Zusatz von Äther fallen 2«^ g Ph@Hylftlhd©eaFb©moy!verbindung aus» Sie wird nach Trocknen 2 Stunden lsi "2© ml Trafluoressi-gsäurs "boi 25°G aufbewahrt. Man.ffillfe mit 200 al Stheρ 2.2g Roh-Insulin aus iach erneuter Reinigung QME³Ch ehFöiaatog^aphi© über S@phad@x 6=75 ⁷Is oben erhält man eine irasMlinfpaitfesr^ di-a in üblicher lisise -:12h Zugabe von ZnCl₂ nnü lins teller ües pH auf 5 Λ amorph ausfällt ii;3r im Verlauf von 1 bis 2 Tagen k^ist.allin d?d. Man sehleudes³^

von iniehtkrisiailisier.tsE! Material ab_s wiederholt äi© Iisation imü erhält 1,2 g (20 %_s besogön auf @ing@s@tstG mit 23 bis 2*1 S = SoZaBg₀

?/?y -:?he"¥al)^Dj- -s — lii"'---/.? ^ⁱⁱ"^£"^; """ ^¹⁰^-^ Insulin (Schwein

H *"' 11 Jj i ft

i ^{s c} :■"■■" -L i; PsuliOat (Schwein)

HOE 72/F 331

b) N^oi—Boc-des-Phe^B1-des-Ala^B30-In3Ulin-B-Kette-S-disulfonat (Schv/ein)

werden wie im Hauptpatent, Beispiel 2 a) und b) hergestellt.

c) De3-(Phe-Val)^B1~²-de3-Ala^B5°-ßla^A12'^li4>l8'²¹7-Insulin (Schwein)

2.8 g de3 nach a) hergestellten A-Ketten-tetrasulfonats werden in 100 ml 90-proz. Dimethylformamid unter Zugabe von N-Äthylmorpholin auf pH 7,5 gebracht und mit 1.8 g des nach Ic ) hergestellten Nitrophenylesters gerührt. Nach 20 Stunden wird mit E3sigester gefällt. Man erhält 2.6 g Mono-A-Ketten-tetrasulfonat des Di-Boc-Äthylendiamin-diessigsäure-mononitrophenylesters (87 J). Nun nimmt man wieder in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 3.0 g des nach Beispiel 2b) hergestellten B-Kettendisulfonats, 120 mg 1-Hydroxybenzotriazol und etwas Triäthylamin (bis pH 9) zu und rührt 1 Std. bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute 5.3 g, Das rohe Reaktionsprodukt wird in Ί0 ml Trifluores3igsäure aufgenommen. Nach ^O Minuten fällt man mit ^00 ml Xther. Ί.9 g Verbindung der allgemeinen Formel I mit R¹ anstelle von R, X = SO ' Y=H und um B¹ " ⁵ und B?? verkürzter B-Kette.

Das Produkt wird in 0,5 Liter Wasser von pH 7,5 aufgenommen. Man setzt 50 ml Thioglykol zu, bewahrt 1 Stunde unter Stickstoff auf, erwärmt noch 1 Stunde auf ca. ¹IO⁰C, kühlt wieder auf ca. 20°C ab, und extrahiert zweimal mit je 300 ml Essigester. Der Eseigester wird abgetrennt, der Rest durch einen Stickstoffstrom vertrieben. Dann verdünnt man auf 5 Liter und stellt mit 1 η NaOH auf pH 10,6 rührt 18 Stunden im leichten Luftstrom bei 10⁰C, gibt In HCl bis pH 5·5 zu und lyophilisiert.

Der Rückstand wird in 50 ml 10-proz. Essigsäure gelöst und über eine Säule ^ χ 100 cm Sephadex Q-75, fine, chromatographiert. Die Säule ist mit Insulin geeicht. Nach einem Vorpeak (1.5 g) erscheint der Insulinpeak (2.6 g) nach Eindampfen im Vakuum.

409822/1 101

⁹ ilOE 7?/F 331

Der Vorpeak wird nach J.Am. Chem. Soc. .£3 (197D, Seite 3080 mit Dithiothreitol in flüssigem Ammoniak reduziert und in 1.5 Liter Wasser wie oben bei pH 10.6 oxydiert.

Die nach Chromatographie erhaltenen 2.6 g vernetztes Rohinsulinderivat werden in 60 ml 95-proz. Pyridin 3 Stunden bei 26 C mit 0.7 ml Phenylsenföl gerührt. Das Pyridin wird auf 10 ml eingeengt. Durch Zusatz von Äther fallen 2.4 g Phenylthiocarbamoylverbindung aus. Sie wird nach Trocknen 2 Stunden in 20 ml Trifluoressigsäure foei 25°C aufbewahrt. .Man fällt mit 200 ml Äther 2,2 g Ron-Insulin aus. Nach erneuter Reinigung durch Chromatographie über Sephadex G-75 wie oben erhält man eine Insulinfraktion von 1.0 g (17 %)i bezogen auf eingesetzte A-Kette mit ca. 20 I.E./mg.

Beispiel 3

¹ Bl "

Des-Pheny!alanin -Insulin (Rind)

a) A-Kette-S-tetrasulfonat (Rind)

1
siehe Hauptpatent, Beispiel 3 a)

b) N^OC-Boc-B-Kette-S-di3ulfonat (Rind)

siehe Hauptpatent, Beispiel 3b)

c) Des-Phe^B1-Insulin (Rind)

2.8 g des nach a) hergestellten A-Ketten-tetrasulfonats werden in 100 ml 90-proz. Dimethylformamid unter Zugabe von N-Äthylmorpholin auf pH 7,5 gebracht und mit 1.8 g des nach Beispiel Ic ) hergestellten Nitrophenylesters gerührt. Nach 20 Stunden wird mit Essigester gefällt. Man erhält 2,6 g Mono-A-Ketten-tetrasulfonat des Di-Boc-äthylendiamin-diessigsäure-mononitrophenylesters (87 %). Nun nimmt man wider in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 3.0 g des nach Beispiel 1 b) hergestellten N -Boc-B-Kettendisulfonats,

409822/1101

HOE 72/P 331

120 mg l-Hydroxybenzotriazol und wenic Triäthylamin zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute 5.45 g. Das rohe Reaktfcnsprodukt wird in 40 ml

Trifluoressigsäure aufgenommen. Nach 40 Minuten fällt man mit

400 ml Xther 5.0 g Verbindung der allgemeinen Formel I mit

R¹ anstelle von R, X = SO," und Y=H.

Das Produkt wird in 0,5 Liter Wasser von pH 7*5 aufgenommen. Man setzt 50 ml Thioglykol zu, bewahrt 1 Stunde unter Stickstoff auf, erwärmt noch 1 Stunde auf ca. 40⁰C, kühlt wieder auf ca* 20°C ab und extrahiert zweimal mit je 300 ml Essigester. Der Essigester wird abgetrennt, der Rest durch einen Stickstoffstrom vertrieben. Dann verdünnt man auf 5 Liter und stellt mit 1 η NaOH auf pH 10.6, rührt 18 Stunden im leichten Luftsrom bei 10⁰C, gibt 1 η HCl bis pH 5·5 zu und lyophilisiert.

Der Rückstand wird in 50 ml 10-proz. Essigsäure gelöst und über eine Säule 4 χ 100 cm Sephadex 0-75, fine, chromatographiert. Die Säule ist mit Insulin geeicht. Nach einem Vorpeak (1.4 g) erscheint der Insulinpeak (2.5 g)· Der Vorpeak wird nach J.Am.Chem. Soc. 21 (1971), Seite 3080 mit Dithiothreitol in flüssigem Ammoniak reduziert und in 1,5 Liter Wasser wie oben bei pH 10.6 oxydiert. Die nach Chromatographie erhaltenen 2.5 g vernetztes Rohinsulin werden in 60 ml 95-proz. Pyridin 3 Stunden bei 26⁰C mit 0,7 ml Phenylsenföl gerührt. Das Pyridin wird auf 10 ml eingeengt. Durch Zusatz von Xther fallen 2.4 g PhenyIthiocarbamoylverbindung aus. Sie wird nach Trocknen 2 Std. in 20 ml Trifluoressigsäure bei 25°C aufbewahrt. Man fällt mit 200 ml Xther 2.2 g Roh-ⁿInsulinⁿ aus. Nach erneuter Reinigung durch Chromatographie über Sephadex G-75 wie oben erhält man eine Insulinfraktion, die in üblicher Weise fiaoh Zugabe von ZnCl₂ und -Einstellen des pH auf 5.4 amorph ausfällt, aber im Verlauf von 1 bis 2 Tagen kristalin wird. Man schleudert vorsichtig von nichtkristallisiertem Material ab, wiederholt die Kristallisation und erhält 1.22 g Des-Phe^B1-Insulin (Rind) (20 J, bezogen auf eingesetzte Α-Kette) mit 23 bi3 24 I.E./mg.

409322/1101

Beispiel Ί " " " ^{11Oii 72/P 331}

Bl-Acetyl-InsuiLi,!} (Schwein)

a) A—Kette-S-tetrasulfonat (Schwein)

b) Bl-Acetyl-B-Kette-S-disulfonat

werden wie im Hauptpatent, Beispiel ¹I a) und b) hergestellt.

c) Bl-Acetyl-Insulin (Schwein)

2.8 g des nach a) hergestellten A-Ketten-tetrasulfonats werden in 100 ml 90-proz. Dimethylformamid unter Zugabe von N-Äthylmorpholin au,f pH 7.5 gebracht und mit 1*8 g des nach Ic ) hergestellten Ni'trophenylesters gerührt. Nach 20 Stunden wird mit Essigester gefällt. Man erhält 2,6 g Mono-A-Ketten-tetrasulfonat des Di-Boc-Ä^hylendiamin-diessigsäure-mononitrophenylesters (87 Jt). Nun nimmt man wieder in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 3.0 g des nach b) hergestellten N-Acetyl-B-Ketten-disulfonats, 120 mg 1-Hydroxybenzotriazol und wenig Triäthylamin (bis pH 9) zu und rührt 1 Std. bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute 5.^5 g. Das rohe Reaktionsprodukt wird in ^O mil Trif luoressigsäure aufgenommen. Nach ^O Minuten fällt man mit ¹IOO ml Äther 5·Ο6 g Verbindung der allgemeinen Formel I mit R' anstelle von R, X= SO ~ und Y = Acetyl.

Die Aufarbeitung erfolgt wie im Hauptpatent, Beispiel 4 c).

Man erhält 1.14 g Insulin (19 Jt), bezogen auf eingesetzte A-Kette mit 22 bis 2k I.E./mg. '

Beispiel 5

Human-Insuliη

0 9 8 2 2/1 101

¹² HOE 72/F 331

a) A-Kctte-S-tetrasulfonat (human) 2253297

Herstellung analog Hauptpatent, Beispiel 5a)

b) N^-Boc-Gly-D-Xette-S-disulfonat (human)

Synthese analog Hauptpatent, Beispiel 5b)

c) Human-Insulin

2.8 g des nach a) hergestellen A-Ketten-tetrasulfonats werden in 100 ml 90-proz. Dimethylformamid unter Zugabe von N-Äthylmorpholin auf pH 7.5 gebracht und mit 2.8 g des nach Beispiel 1 cß) hergestellen Nitropheny!esters gerührt. Nach 20 Stunden wird mit Essigester gefällt. Man erhält 2.6 g Mono-A-Ketten-tetrasulfonat des Di-Boc-Äthylendiamin-diessigsäure-mononitropheny!esters (87 Ϊ). Nun nimmt man wieder in 100 ml Dimethylformamid auf gibt 3.0 g des nach Beispiel Ib) hergestellen IT^-Boc-Gly-B-Ketten-disulfonats, liO mg 1-Hydroxy-benzotriazol und etwas Triäthylamin (bis pH 9) zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute 5,43 Z- Das rohe Reaktämsprodukt wird in 40 ml Trifluoressigsäure aufgenommen. Nach 40 Minuten fällt man mit 400 ml Äther 5·0 g Verbindung der allgemeinen Formel I mit R¹ anstelle von R, X s SO," und Y : GIy.

Man arbeitet wie im Hauptpatent, Beispiel 5c), weiter und erhält 1.2 g Insulin (20 S) bezogen auf eingesetzte Α-Kette, mit 23 bis 24 I.E./mg.

Beispiel 6

Bl-Acety1-Human-Insulin

a) S-Tetra-tert.-butylmercapto-A-Kette (human)

Herstellung der geschützten Α-Kette analog Hauptpatent, Beispiel 6a)

b) N-Acetyl-S-di-tert.-butylmercapto-B-Kette (human)

409822/1 101

- 13 - HOE 72/F 331

Herstellung der B-Kette analog Hauptpatent, Beispiel 6b). c) Bl-Acetyl-Human-Insulin

2.8 g'des nach a) hergestellten A-Ketten-derivats werden in 100 ml 90-proz. Dimethylformamid unter Zugabe von N-Äthylmorpholin auf pH 7.5 gebracht und mit 1.8 g des nach Beispiel 1 c (P) hergestellten Nitrophenylesters gerührt. Nach 20 Stunden wird mit Essigester gefällt. Man erhält 2.6 g Mono-A-Ketten-tetrasulfonat des Di-Boc-Propylendiamin-diessigsäure-mononitrophenylesters. Nun nimmt man wieder in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 2.9 g des nach b) hergestellten N⁰^-ACety1-B-Ketten-derivats, 120 mg 1-Hydroxybenzotriazol und etwas Triäthylamin (bis pH 9)· zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute 5.HO g. Das rohe Reaktionsprodukt wird in ¹IO ml Trifluoressigsäure aufgenommen. Nach 40 Minuten fällt man mit MOO ml Äther 5.0 g Verbindung der allgemeinen Formel I mit R' anstelle von R, X = S-tert.-Butylmercapto und Y = Acetyl.

Die Aufarbeitung erfolgt wie in Hauptpatent, Beispiel 6c)

Man erhält 1,2 g Insulin (20 SS), bezogen auf eingesetzte A-Kette, Bl-Acetyl-Human-Insulin mit 23 bis 2H I.E./mg.

Claims

Patentansprüche HOE 72/F 331

1. Verfahren zur Herstellung von Insulin, Insulin-Analogen und -Derivaten nach Patent .... (HOE 72/F 326), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel III

-R¹

-CO*

LiVS

O=C- JjSIy

S-JL

-S

A-KGtte

.s-

■-L

B-Ketto

IXI

in der-Y die im Hauptpatent angegebene Bedeutung hat und R^f einen Rest der allgemeinen Formel

-CH₂-NH-(CHg)_n-NH-CH₂-

bedeutet, worin η für die Zahlen 2 oder 3 steht, nach dem Verfahren des Hauptpatentes herstellt, und wobei in der Ausgangsverbindung der allgemeinen Formel I

:- _R ■ j B-Kette ,',■.,-— .-CO sx - ■ sx . A-Kette J"" Ix
JT _ O=G- j GIy Y- ii. ...ι. ...1-"-T-IIrIr ■ .iaι. iiiii Ii π ι ι lift"

X und Y die im Haupt patent angegebene Bedeutung haben, jedoch R einen Rest der allgemeinen For nie 1 ΪΙ

4 O 9 ti 2 2 / 1 1 O

ORIGINAL INSPECTED

NACHGEREIOHT

HOE 72/F 331

-CH₂-N- (CH₂ >_n-T-CH₂-

Ac

II

Ac

bedeutet, worin η für die Zahlen 2 oder 3 steht,

2. Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der R,

X und Y-die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben«

3. Verbindungen der allgemeinen Formel III

GIy s '■■■'" * .S'
k-
I 1 Ly s '"■. · ι - .- ■ • Y- S
I
S
1 A-Kette B-Kette O=C-

III

in der X und Y die in Anspruch Ϊ angegebene Bedeutung" haben und R' einen Rest der allgemeinen Formel

. - CH₀-NH-(CH₉V-NH-CH,.

bedeutet, worin η für die Zahlen 2 oder 3 steht.

409822/1.101