DE2247943A1

DE2247943A1 - Verfahren zum vernetzen von agarose oder agar

Info

Publication number: DE2247943A1
Application number: DE19722247943
Authority: DE
Inventors: Erkki Juhani Dr Techn Honkanen; Anna Maija Teppo
Original assignee: Orion Yhtyma Oy
Current assignee: Orion Oyj
Priority date: 1971-10-01
Filing date: 1972-09-29
Publication date: 1973-04-26
Also published as: US3860573A

Description

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF „

PATENTANWÄLTE ZZh /jHO

8 MÜNCHEN 8O. MAUERKIRCHERSTR. 45

Dr. Berg Dipl.-Ing. Stopf, 8 MOnchen 80, MouerkircherstraSe 45 ·

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Orion-Yhtymä Oy
Mlsiänkatu 10- H
00510 Helsinki 51

Verfahren zum Vernetzen von Agarose oder Agar

Die -vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Vernetzen von Agarose oder Agar, worin die Agarose bzw. der Agar zuerst suspendiert und anschließend mit einer bifunktionalen Verbindung zur Reaktion gebracht wird.

Agarose ist ein neutrales Polysaccharid mit einem Molekülgewicht von etwa 120000 (Biochem. Biophys. Acta 165» S. 4-3 - 58, 1968: T.G.I*. lickson and A. Poison, "Some physical characteristics of the agarose molecule"). In der Polysaccharidkette

3098 17/1017 _ ₉ ι

wechseln D-Galactose und 3_f6-Anhydro-L-Galacto3e ab (Bull, ehem. Soc. Japan 29, S. 543, 1956: C. Araki aowie Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Academic Press 1969t Vol. 24, S. 277 - 278: D. A. Rees: "Polysaccharide gels and networks).

CH OH

Agarose bildet bei Erhitzen in Wasserlösung und anschließendem Abkühlen ein festes, durchsichtiges Gel. Solche neutrale Agarosegele werden u.a. als Nährsubβtrat für Mikroorganismen sowie In der Immunodiffusions- und Elektrophoresetechnik verwendet.

Die Anwendung von Agarose bzw. Agar zu den obengenannten Zwecken hat Schwierigkeiten bereitet. Von den Nachteilen sei erwähnt, daß die Trennung einiger Proteine in der Elektrophorese eine schlechte ist, daß das Syneresephänomen der Agarose (worunter man die spontane Abscheidung des Wassers vom Gel während der Aufbewahrung versteht) hinderlich ist, wenn aus Agarose Produkte (Substrate für Mikroorganismen, Dip Slide-Produkte) hergestellt werden, die während des Transports, der Lagerhaltung oder der Verwendung Temperatur-

i 0 H 0 ! 7 / 1 0 1 7

Variationen ausgesetzt werden, sowie daß die Hydrophilie der Agarose "bei Dip Slide-Erzeugnissen mit einem in geeignete Nährlösung gekochten, auf Kunststoffunterlage gegossenen Gel "bewirkt, daß sich das Gel von seiner Unterlage löst*

Vernetzung der Agarose ist z.B. nach der USA-Patentschrift 3 507 851 zuvor "bekannt. Hierbei hat man als "bifunktionale Verbindung Epiclilorhydrin verwendet. Dieses enthält zwei verschiedene funktionale Gruppen. Man kann dabei nur die Zahl der vernetzenden Kreuzbindungen der Agarose verändern, nicht aber die Länge der Kohlenwasserstoffketten und daher nicht die chemische Natur der Agarose, und hiermit werden die obengenannten Nachteile nicht beseitigt.

Die vorliegende Erfindung bezweckt Abhilfe der obengenannten Nachteile. Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß beim Vernetzen der Agarose bzw. des Agars als bifunktionale Verbindung eine solche Verbindung verwendet wird, die zwei gleichartige funktionale Gruppen hat, aus einer der folgenden bestehend: -0001, -SO^Cl oder -N=C=S, und daß die entstandene vernetzte Agarose bzw. der Agar filtriert und ge- " waschen wird.

Nach der Erfindung vernetzte Agarose bzw. Agare haben einige

J 17/1 (.) 1 7

Eigenschaften, die sie hesser als zuvor au den zeitigeren Verwendungszwecken anwendbar machen sowie fernerhin die Verwendung von Agarose bzw. Agar in neuen Zusammenhängen möglich machen. Im folgenden einige Beispiele.

1. Molekularsieb-Effekt

Erfindungsgemäß vernetzte Agarosen haben neben Absorptions· eigenschaften ferner das Vermögen, als Molekularsieb zu arbeiten. Dieses Vermögen ist umso wirksamer je reichlicher die Zahl der Zwischenbrücken (je höher der CL-Örad).

In der Gelelektrophoresetechnik, z.B. beim elektrophoretlschen Fraktionieren von Proteinen, bringt diese Eigenschaft großen Nutzen, insbesondere wenn man wünscht, im übrigen ähnliche elektrophoretische Beweglichkeit besitzende Proteine voneinander zu trennen.

Unter anderen können Hämopexin und Transferrin, die schwer separierbar sind, mittels dieser Technik getrennt werden» Die untenstehende Tabelle zeigt den Einfluß der Zahl der Kreuzverbindungen (der Zwischenbrücken) auf die Separation von Hämopexin und Transferrin. Zum Vernetzen der Agarose wurde erfindungsgemäß Bernsteinsäuredichlorid benutzt und der Lauf fand bei pH 8,6 in 2#igem Agaroeeiedium statt.

3 0 9 in 7 / 1 ü 1 7

Olr-arad # Verhältnis der von Hämopexin

und Iransferrin zurückgelegten Strecken

O 1,0

4 1,09

6 1,17

9 1,25

12 1,29

15 1,35

20 1,4-5

Auch in der Immunoelektrophore se von Proteinen, worin die Proteine zuerst elektrophoretisch fraktioniert und anschliessend vermittels der Gelpräzipitationstechnik nachgewiesen werden, ergeben sich beim Verwenden kreuzvernetzter Agarosen folgende Vorteile: 1) selbst schwer separierbare Proteine können voneinander getrennt werden (z.B. Hämopexin und Transferrin; Prä-ß-Lipoprotein und ß-Lipoprotein; IgA und IgG), 2) man erhält beträchtlich schärfere Präzipitate. In der Praxis hat dies eine große Bedeutung, denn das Lesen der schwer deutbaren Immunelektrophorograrame wird erleichtert und die gewonnene Information nimmt zu.

In der Technik von Laurell (O.B.Laurell, Anal. Biochem. JJ5

(1966) 45) erfolgt quantitative Bestimmung von Proteinen im elektrischen Feld in einem Antiserum enthaltenden igarosegel.

- 6 Ί 0 G 8 17/ 1 0 1 7

Bei ihrem Wandern im elektrischen Feld werden die Proteine unter Einfluß des im Gel vorhandenen Antiserums ausgefällt. Der Flächeninhalt der erhaltenen Fällung von Raketengestalt ist zur Menge des in Frage stehenden Proteins proportional. Jedoch ist' die Bestimmung einiger Proteine, vor allem der Immunoglobuline, nach dieser Technik bei Verwendung von normaler Agarοse schwierig gewesen. Infolge ihres hohen Molekülgewichts (IgG 160.000, IgM 960.000) wandern die Immunoglobuline im elektrischen feld (bei pH 8,6) nur langsam auf die Anode zu. Gleichzeitig bewegt sich die Agarose in Richtung auf die Kathode (sog. Endosmose) und führt die Immunoglobuline mit sich.

Bei Anwendung von vernetzten Agarοsen kann man die Laurellsche Technik auch zur quantitativen Bestimmung der Immunoglobuline anwenden. Die Vernetzung setzt den Endosmoseeffekt der Agarose herab, und der Molekularsiebeigenschaft der vernetzten Agarosen zufolge wird das Wandern der großen Moleküle im Gel schneller.

Wenn übliche Agarose der Erfindung gemäß mit 20#ig mit p-Phenylen-Diisothiocyanat vernetzter Agarose ersetzt wurde, konnten wir die zur Bestimmung von IgM benötigte Laufzeit von t7 auf 8 Stunden horabbringen. In der Praxis bedeutet

ϋ)ϊί «J I 7 / I 0 I 7

dien, daß man durch Verwendung verneti'ior Agarosen auch die Immunoglobuline nach Laurells Technik bestimmen kann, und lorner läßt «ich bei Wahl eines geeigneten OL-Grads die Bestimmung im Verlauf eines normalen Arbeitstags durchf uhren» was insbesondere! in Krankenhäusern ein ent scheidender Vorzug ist.

2. Größere Stabilität

Eine kennzeichnende Erscheinung bei Agarοse ist die Synerese, worunter zu verstehen ist, daß Wasser spontan- während der Aufbewahrung vom Gel abgeschieden wird. Man vermutet, daß dies darauf beruht, daß das Gel bei schneller Erstarrung keine Zeit hat, thermodynamisches Gleichgewicht zu erreichen, wobei dann bei Temperaturveränderung eine innere Strukturänderung eintritt und das im Gel gebundene Wasser frei wird.

Die Erscheinung ist äußerst nachteilig, wenn man aus Agarose Erzeugnisse (Substrate für Mikroorganismen, Dip Slide-Produkte usw.) herstellt, die während des Transports, der Lagerhaltung oder der Verwendung Temperaturvariationen ausgesetzt sind.

Durch erfindungsmäßiges Vernetzen der Agarose ist ein stabile-

- 8

8 1 7 1 (. ':*?· *■ ■ BAD ORIGINAL.

res und Temperaturvariationen gegenüber besser widerstandsfähiges Gel erzielt worden. Mit einer niedrigen Zahl von Kreuzbindungen (2 bis 10 Ji) ist in dieser Hinsieht das beste Resultat verzeichnet worden.

Die vernetzten Agarosen eignen sich somit bedeutend besser als übliche Agarosen zu Erzeugnissen, bei denen Transport und lange Bauer der Lagerhaltung notwendig sind.

Das aus vernetzten Agarosen oder Agaren hergestellte Gel scheint sich auch im mikrobiologischen Sinn besser als gewöhnliche Agarose bzw. gewöhnlicher Agar zur Bakterien-Züchtung zu eignen. Wenn (zu 5 bis 20 j6) mit Bernsteinsäure dichlorid vernetzte Agarosen (2#ige Agarose in Ilhragarbrühe) verwendet wurden, erzielte man u.a. größere und üppigere Kolonien von Enterokokken; desgleichen war bei einigen Staphylokokkenarten (S. albus und 3. aureus) die Vuchsdichte besser als unter Anwendung gewöhnlicher Agarose.

3. Geringere Eydrophilie

In sog. Dip Slid-Produkten (z.B. "Uricult") ist ein in eine geeignete Nährlösung gekochtes Gel auf eine Kunststoffunterlage gegossen. Der hydrophobe Kunststoff strebt jedoch das hydrophile Agarosegel "abzuweisen", häufig mit der Folge, daß sich das Gel während der Aufbewahrung von der Unterlage abschält.

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Durch Vernetzen der Agarose mittels eine Kohlenwasserstoffkette oder eine Phenylgruppe enthaltender Verbindungen (z. B. mit Säuredichloriden mit großer Kettenlänge oder mit Phenylen-Diisocyanaten) kann man die hydrophile Eigenschaft der Agarose' vermindern und somit die Haftung des Gels auf einer hydrophoben Unterlage verbessern.

4. Herstellung von Proteinabsorbenten

Bei Vernetzen der Agarose mittels gteignete aktive öruppen enthaltender Zwischenbrücken kann man die erhaltene vernetzte Agarose zur Herstellung von Proteinabsorbenten benutzen. Das folgende Beispiel dürfte die Sache beleuchten.

Agarose wird erfindungsgeraäß mit Malonsäuredichlorid vernetzt. Die in der Zwischenbrücke befindlichen, zwischen zwei Carboxylgruppen liegenden aktiven Wasserstoffatome können - unter Anwendung der an sich zuvor bekannten Knoevenagel-Kondensation - zur Kondensation mit Dialdehyden gebracht werden, so daß die eine Aldehydgruppe frei bleibt und mit der Aminogruppe von Proteinen zu kondensieren vermag.

Das Verfahren gründet sich, wie bereits erwähnt, auf Reaktionen mit den Hydroxylgruppen der Agarose von solchen bifunktionalen organischen Verbindungen, die zwei ebensolche funktionale Gruppen besitzen, die aus einer der folgenden bestehen; -COOl, -SO₂Cl oder -N=C=S. lachstehend

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werden verzeiohnisiaäßlg ein Teil der Verbindungen angegeben, die eine der obengenannten funktionalen Gruppen enthalten und die in einem Verfahren nach der Erfindung verwendet worden sind.

I. Dicarboxylaäurechloridej funktionale Gruppe: -COCl.

O.

c-0 ^₀

4* Q λ * \

ι ^β C=O

fa

OH Cl 1

Ton diesen seien erwähnt:

1. Gesättigte Dicarboxylsäurechloride, z.B. Oxalsäure-

diohlorid, Malonsäurediohlorid, Berasteinsäurediohlorid, Glutareäuredichlorid, Adipinaäuredlohlorid, Fimelinsäurediohlorid usw.

2. Ungesättigte Dicarboxylsäurechloride, z.B. Maleinsäuredi ohlorid,

3. Cyoloalkylendioarboxylsäurechloridet z.B. Cyclopentan-

1,2-Dioarboiylsäureohlorid, Cyelopentan-1_f3-Dioarboxyl-

- 11 -3098 17/1017

säurechlorid, Cyclohexan-1,2-3)icartooxylsäurechlorid, Cyelohexan-ifS-Dicarboxylsäureohlorid, Cyclohexan-1,4 Dicarboxylsäurechlorid usw.

4» Aromatische Dicarboxylsäureohloride, z.B. Phthalsäure dichlorid, Isophthalsäurediehlorid, Terephthalsäuredi chlorid , Haphtalen-1 ₉ 2~Dicarboxylsäuredichlorid.

II. AryldiBulfonsäurechloridej funktionale Gruppe: -SOp Von diesen sei z.B. Benzen-1,3-Disulfonsäurechlorid erwähnt.

o-cx.-

III. Diisothiocyanate; funktionale Gruppe: -N=C=S.

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OH

ο —

°Ί

Yon diesen seien erwähnt:

1. Aliphatisohe Diisothiocyanate, z.B. Äthylen-1,2-Diisothiocyanat, Butylen-1,4-Diisothiooyanat, Hexylen-1,6-Diisothiocyanat, Octylen-1,8-Diisothiooyanat, Decylen-1,10-Diisothiocyanat, Butylen-1,3-Diisothiocyanat usw.

2. Aromatische Diisothiocyanate, z.B. p-Phenylen-Diisothiocyanat.

Außer mit den obenstehend angeführten Verbindungen erzielt man eine Bildung von Zwischen!)rücken entsprechender Art auch mit zahlreichen anderen Verbindungen, die als reaktive Gruppen zwei ebensolohe -COCl, -SO₂Cl bzw. -NeCsS Gruppen

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~ 13 -

haben. Die nachfolgenden Beispiele beleuchten das Verfahren eingehender.

Beispiel 1

5 g Agarοse oder Agar werden in Benzen suspendiert} η χ 0,18 g Iriäthylamin (n = 1 bis 10) werden zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bis nahe an den Gefrierpunkt des Benzens (etwa + 6⁰C) abgekühlt und unter kräftigem Umrühren werden η χ 0,1 g Oxalsäurediohlorid zugefügt. Man läßt die temperatur auf + 25⁰C (nioht darüber hinaus) ansteigen und das Umrühren wird noch 6 Stunden lang fortgesetzt. Die erhaltene vernetzte Agar ο se bzw« eier -vernetzte Agar wird filtriert und sorgfältig mit lanzen, Wasser und Aceton gewaschen, und man läßt das Srz@iigQ.is bei Zimmertemperatur trocknen.

Beispiel 2

5 g Agarοse werden in Äther suspendiert; es werden η χ 0,14 g (η ^B 1 bis 10) Iriäthylarain zugesetzt. Sie Suspension wird auf etwa + 6⁰C abgekühlt und ansohliessend werden η χ 0,1 g Maleinsäuredichlorid hinzugegeben. Fortsetzung wie in Beispiel 1.

Beispiel 3

5 g Agarose werden in Petroläther suspendiert; es werden

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-H-

n χ 0,12 g N,H-Dimethylanilin zugesetzt. Der erkalteten (+ 6⁰O) Suspension werden η χ 0,1 g (η ■ 1 bis 10) Cyolohexan-I^-Dioarboxylsäurechlorid zugegeben. Portsetzung wie in Beispiel 1.

Beispiel 4

5 g Agarοse werden in Toluen suspendiert; es werden η χ 0,1 g (n a 1 bis 5) Triäthylamin zugesetzt, ebenso wie η χ 0,1 g Phthalsäuredichlorid. Fortsetzung wie in Beispiel 1.

Beispiel 5

5 g Agarοse werden in Dioxan suspendiert. In der Mischung werden η χ 0,11 g (na 1 bis 10) kristallwasserfreies, soeben getrocknetes Natriumacetat gelöst, und bei etwa + 10⁰O werden unter umrühren η χ 0,1 g Bernsteinsäurediohlorid zugegeben. Fortsetzung wie in Beispiel 1.

Beispiel 6

5 g Agarοse werden in ither suspendiert; es werden η χ 0,075 g Triäthylamin (n » 1 bis 5) und η χ 0,1 g Benzen-1,3-Disulfonsäurechlorid zugesetzt. Man läßt bei -ι- 10 bis 30⁰C 2 bis 4 Stunden reagieren. Fortsetzung wie in Beispiel 1.

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Beispiel 7

5 g Agarοse werden in loluen suspendiert; es werden η χ 0,1 g (η β 1 Ms 20) p-Phenylen-Diisothiooyanat zugesetzt. Unter kräftigem Rühren wird das Gemisch in einem Kolben mit Rüekflußkühler am Siedepunkt des Toluens (+ 11O⁰C) 8 Stunden lang erwärmt. Es wird filtriert und die erhaltene vernetzte Agarοse wird mit Xoluen und Aceton gewaschen und bei Zimmertemperatur trocknen gelassen.

Beispiel 8

5 g Agarose werden in Dioxan suspendiert} es werden η χ 0,1 g (n = 1 "bis 20) Butyl-1,4-Diisothiocyanat zugesetzt. Erhitzung auf den Siedepunkt τοη Dioxan (+ 101⁰C) wie in Beispiel 7 und anschließend Waschen mit Dioxan und Aceton sowie Trocknenlassen bei Zimmertemperatur.

In allen den oben dargestellten Beispielen ähnlichen Reaktionen kann man als Lösungsmittel auch andere inerte organische Lösungsmittel benutzen, wie z.B. Äther, Petroläther, Benzen, Xoluen, Dioxan usw. oder verschiedenartige Mischungen von diesen.

In Reaktionen ähnlich denjenigen in Beispiel 1 bis 5 kann man zum Binden der freiwerdenden Chlorwasserstoffsäure

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statt der genannten imine auch andere sekundäre oder tertiäre imine verwenden, z.B. Dirnethylanilin, Diäthylanilin, Triäthylamin, Pyridin, N-Ithylpiperidin und Diäthylamin, oder man kann das Amin ersetzen, indem man gemäß Beispiel 5 irgendein krietallwaeserfreieβ, soeben getrocknetes Salz einer organischen Säure, z.B. Natriumacetat, Calciumacetat usw., verwendet.

In Reaktionen ähnlich derjenigen in Beispiel 6 kann man statt Triäthylamin auch andere tertiäre Amine, z.B. N,N-Dimethy!anilin, benutzen.

- 17 Patentansprüche t

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Vernetzen τοη Agar ο sen oder Agar, worin die Agarose bzw. der Agar suspendiert und anschließend zum Reagieren mit einer "bifunktionalen Verbindung gebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß als 'bifunktionale Verbindung eine solche Verbindung verwendet wird, die zwei ebensolche funktionale Gruppen aufweist, aus einer der Gruppen -GOÖl, -SO^Cl oder -NsGsS bestehend, und daß die entstandene vernetzte Agaros© bzw. der vernetzte Agar filtriert und gewaschen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Verbindungen, die zwai funktional® Gruppen »00G1 enthalten, gesättigte Dicarboxylsäureehlorid© ₉ wi© z.B· Oxalsäuredichlorid, BernstainsäuredichlQridj, säuredichlorid, Adipinsäuredichlorid und dichlorid, verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Verbindungen, die zwei funktionale Gruppen -GOGl enthalten, ungesättigte Dicarboxylsäurediohloriäe, wie z.B. Maleinsäuredichlorid, verwendet werden*

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

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als Verbindungen, die zwei funktionale Gruppen -COCl enthalten, aromatische Dicarboxylsäurechloride, wie z.B. Phthalsäuredichlorid, Isophthalsäuredichlorid, Terephthalsäuredichlorid und Naphtalen-1,2-Dicarboxylsäuredichlorid, verwendet werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Verbindungen, die zwei funktionale Gruppen -SOpCl enthalten, AryIdisulfonsäurechloride, wie z.B. Benzen-1,3-Disulfonsäurechlorid, verwendet werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Verbindungen, die zwei funktionale Gruppen -NsC=S enthalten, aliphatische Diisothiocyanate, wie z.B. ithylen-1,2-Diisothiocyanat, Butylen-1,6-Diieothiocyanat, Hexylen-1,6-Diisothiocyanat, Octylen-1,8-Diisothiooyanat, Decylen-1,10-Diisothiocyanat und Butylen-1_f3-Biisothiocyanat, verwendet werden.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Verbindungen, die zwei funktionale Gruppen -N=O=S enthalten, aromatische Diisothiocyanate, wie z.B. p-Phenylen-Diisothiocyanat, verwendet werden.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

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beim Suspendieren der Agarose bzw. des Agars inerte organische Lösungsmittel, wie z.B. Benzen, Äther, Petroläther, Toluen und Dioxan, verwendet werden.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß beim Suspendieren der Agarose bzw. des Agars eine die Vernetzungsreaktion derselben fördernde und die Hydrolyse der Agarose verhindernde Verbindung, wie z.B. Diäthylamin, ÜT^-Dimethylanilin, iOriäthylamin und Natriumacetat, verwendet wird.

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