DE2226297A1

DE2226297A1 - Verfahren zur Herstellung von modifiziertem Agar oder modifizierter Agarose

Info

Publication number: DE2226297A1
Application number: DE19722226297
Authority: DE
Inventors: Kenneth Balm Union Me. Guiseley (V.StA.). P
Original assignee: Marine Colloids Inc., Springfield, N.J. (V.St.A.)
Priority date: 1971-06-07
Filing date: 1972-05-30
Publication date: 1972-12-14
Also published as: GB1350024A; SE384372B; FR2140452B1; CH579598A5; FR2140452A1; CA955591A; DE2226297B2; ZA722242B; DE2226297C3

Description

Marine Colloids, Inc., Springfield (N.J., USA)

Verfahren zur Herstellung von modifiziertem Agar oder modifizierter Agarose

. Die vorliegende Erfindung bezieht-: sich auf
modifizierte Agarose und modifizierten Agar mit niedrigeren Gelier- und Schmelztemperaturen als die entsprechende unmodif izierte Agarose bzw. der entsprechende unrnodifizierte Agar sowie auf ein Verfahren zum Modifizieren von Agarose und Agär zivecks Senkung ihrer
Gelier- und Schmelztemperaturen.

Sowohl Agar als auch Agarose (einer der Bestandteile von Agar) wurden in Form wässriger Gele in grosser« Umfang als Kulturmedien und als Substrate für

für
die Elektrophorese sowie -m*€ verschiedenartige Umsetzungen

25.5.72/Dr.PB/gl

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unter Diffusion verwendet; Agarosegele bieten spezielle Vorteile wegen ihrer im wesentlichen nicht ionogenen Beschaffenheit. Bei allen derartigen Anwendungen sowie bei Verwendung von Agar und Agarose als Verdickungsmittel in Nahrungsmitteln und Kosmetika sowie bei anderen üblichen Verwendungen dieser Materialien ist die Geliertemperatur von besonderer Bedeutung. Zwar ist beispielsweise die Geliertemperatur von Lösungen vieler Proben von Agar und Agarose aus natürlichen Quellen ca. 35 bis J)6 ⁰C, aber langes Stehenlassen derartiger Lösungen bei einer Temperatur von 4o ⁰C oder sogar noch höher führt häufig zur Verdickung oder beginnenden Gelierung. Wenn man derartige Lösungen für biologische Untersuchungen verwendet, ist es daher schwierig, Proben herzustellen, ohne bei so hohen Temperaturen zu arbeiten, dass die verwendeten Organismen oder Reagenzien getötet oder inaktiviert werden.

Die Untersuchung des verschiedenen Methoxygruppengehaltes von Agarose, die aus natürlichen Quellen erhalten wurde, zeigte, dass Proben mit höherern Methoxygruppengehalt auch höhere Geliertemperaturen haben.

Die Erfindung bezieht sich auf einen modifizierten Agar oder eine modifizierte Agarose, der bzw. die dadurch gekennzeichnet ist, dass er bzw. sie alkyliert,

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alkenyliert, acyliert oder hydroxyalkyliert worden ist, wobei die Alkyl-, Alkenyl- und Acy!gruppen 1 bis 3 Kohlenstoffatome und die Hydroxyalkylgruppen 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten, üKd« dass er bzw. sie wasserlöslich ist und eine um mindestens 1 ^C'C niedrigere Geliertemperatur hat als der entsprechende unmodifizierte Agar oder die entsprechende unmodifizierte Agarose.

Der Begriff "Geliertemperatur" bedeutet die Temperatur, bei der eine Flüssigkeit oder ein Sol beim Abkühlen zu einem steifen Gel erhärtet und muss von der Gelatinisierung unterschieden werden, bei der wie im Falle der Stärke beispielsweise Hydratisierung eintritt, insbesondere bedeutet die "Geliertemperatur" die Temperatur, bei der Härtung eintritt, wenn eine 1,5 Gew.-% Agarose oder Agar enthaltende Lösung mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ⁰C pro Minute abgekühlt wird.

Weil erfindungsgemäss keine ionischen Gruppen in Agar oder Agarose eingeführt werden, ist die Erfindung besonders'wertvoll für die Herstellung von Agarose mit niedriger Geliertemperatur für die Verwendung als Substrat bei der Elektrophorese. Mittels der vorliegenden Erfindung kann eine Abnahme der Geliertemperatur sogar bic> zum Gefrierpunkt von Wasser oder noch niedriger erzielt v/erden.

Auch andere wichtige Eigenschaften von Agar 2098 51/1079

und Agarose werden durch die vorliegende Erfindung verbessert; die Schmelztemperatur wird gesenkt und die Klarheit des Gels erhöht.

Der Alkylierungs-, Alkenylierungs-, Acylierungs- oder Hydroxyalkylierungsgrad, der erforderlich ist, um eine bestimmte Abnahme der Geliertemperatur zu erzielen, hängt in einem gewissen Grade von der Herkunft und der ursprünglichen Geliertemperatur des unmodifizierten Agars bzw. der unmodifizierten Agarose sowie von der Art der vorhandenen besonderen Alkyl-, Alkenyl-, Acyl- oder Hydroxyalkylgruppen ab. Der Substitutionsgrad kann in Bezug auf die vier theoretisch zur Verfügung stehenden reaktiven Gruppen in dem aus D-Galactose und 3>6-Anhydro-L-galactose bestehenden Disaccharidrnolekül, das die Hauptkomoponente von Agarose darstellt, definiert werden. So ausgedrückt hat ein Produkt, bei dem alle zur Verfügung stehenden Gruppen vollständig umgesetzt worden sind, einen Substitutionsgrad (S.G.) von 4,0. Als spezielles Beispiel kann die Zunahme des Substitutionsgrades eines hydroxyäthylierten Produktes gemäss der Erfindung folgendermassen berechnet werden:

Zunahme des S.G. = ?06 χ ew.-^ Hy

(100 χ 45)-(44 χ Gew.-^ Hydroxyäthyl)

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Im allgemeinen haben die erfindungsgemässen Produkte eine Zunahme des Substitutionsgrades von ca. 0,01 bis 1,0; obgleich es möglich ist, eine grössere Zunahme des Substitutionsgrades zu erzielen, bietet eine Zunahme von über 1,0 wenig Vorteile. Die geringste brauchbare Zunahme des Substitutionsgrades für die erwünschtesten, und am allgemeinsten verwendbaren Produkte ist gleich derjenigen Zunahme, die erforderlich ist, um einen modifizierten Agar oder eine modifizierte Agarose mit einer um mindestens 1 ⁰C niedrigeren Geliertemperatur als der entsprechende unmodifizierte Agar bzw. die entsprechende unmodifizierte Agarose herzustellen; wie aus den Angaben in den folgenden Beispielen ersichtlich ist, handelt es sich dabei um eine Zunahme des Substitutionsgrades von mindestens ca. 0,01 je nach der vorhandenen speziellen Substituentengruppe.

Bei der Ausführung des Verfahrens gemäss vorliegender Erfindung in einem wässrigen Medium, was im allgemeinen bevorzugt wird, wird der Agar oder die Agarose zuerst in starkem wässrigen Alkali, das ca. 0,5- bis 1,5-molar an Alkalimetallhydroxyd ist, gelöst, worauf ein geeignetes Reagens zugesetzt wird, wie Dimethylsulfat, Aethylbromid, 1-Brompropan, 2-Brompropan, 3-Brompropen, Propylenoxyd, Methylenoxyd, 2-Chlor- äthanol, Epichlorhydrin, Butylenoxyd, Diepoxybutan,

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Acetylchlorid, Propionylchlorid und dergleichen. Da bei Ausführung der Umsetzung in wässriger alkalischer Lösung eine Neigung zu etwas Verfärbung oder Dunkelfärbung der Lösung besteht, wodurch ein Produkt erzeugt wird, das verfärbt, wenn auch im übrigen vollständig befriedigend ist, wird es auch bevorzugt, die Aldehydendgruppe der Agarose beispielsweise durch Reduktion zu blockieren, ehe man den Agar oder die Agarose mit dem wässrigen Alkali in Berührung bringt, wodurch die Farbbildungsreaktion, an der die Aldehydgruppe beteiligt ist, verhindert wird. Das Blockierungsmittel der Wahl ist ein Borhydrid, insbesondere ein Alkalimetallborhydrid, wie Natriumborhydrid, das die Aldehydendgruppe zu einer alkoholischen Hydroxylgruppe reduziert.

Ein bifunktionelles Reagens, wie Epichlorhydrin, das unter geeigneten Bedingungen Vernetzung unter Bildung eines wasserunlöslichen Produktes herbeizuführen vermag, kann nur unter Bedingungen verwendet werden, welche die Vernetzung verhindern und zu einem wasserlöslichen Produkt führen, d.h. zu einem Produkt, das bei 90 ⁰G in einer Menge von mindestens 2 Gew.-^ löslich ist. Bekanntlich kann die Vernetzung vermieden werden, wenn man für die Reaktion eine verdünnte (weniger als 3>5-gew.^ige) Lösung von Agar oder Agarose verwendet oder andere dem Fachmann bekannte Verfahren anwendet. Abgesehen von dor

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Notwendigkeit, die Bildung eines wasserunlöslichen Produktes bei Verwendung bifunktioneller Reagen?;ien zu vermeiden, sind die Konzentrationen oder anderen angewandten Bedingungen nicht von Bedeutung.

Die Reaktion wird vorzugsweise bei einer erhöhten Temperatur von ca. 70 bis 100 ⁰C oder mehr ausgeführt, aber man kann auch niedrigere Temperaturen anwenden, um die Verfärbung zu verringern, wenn die Aldehydendgruppe nicht blockiert ist, oder um die Verluste zu verringern, wenn ein verhältnismässig flüchtiges Reagens verwendet wird. Bei niedrigeren Temperaturen verläuft die Reaktion langsamer, und in manchen Fällen wird das gewählte Reagens durch Umsetzung mit dem Wasser zersetzt, ehe der gewünschte Umsetzungsgrad mit Agarose erzielt v/erden kann.

Nach Beendigung der Umsetzung wird das Gemisch auf 50 bis βθ ⁰C abgekühlt, falls es sich auf einer höheren Temperatur befindet, das Alkali wird mit einer Säure neutralisiert oder durch Dialyse oder auf andere übliche Weise entfernt, und das Produkt wird in üblicher Weise

gereinigt. Beispielsweise kann die Lösung durch Abküh-

da*~.n len geliert, gefroren und wieder aufgetaut und der Rückstand/ gewaschen oder getrocknet v/erden, oder das Produkt kann aus der Reaktionslösung durch Mischen mit einer mit Was-_ ser mischbaren organischen Flüssigkeit, die ein Nicht-

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löser für das Produkt darstellt, wie beispielsweise Methanol, Aethanol, Propanol, Aceton usw., ausgefällt und der Niederschlag abfiltriert, mit dem Nichtlöser gewaschen und getrocknet werden.

Das Verfahren gemäss vorliegender Erfindung kann auch in einem organischen Lösungsmittel, wie Ν,Ν-Dimethylformamid, Pyridin oder ähnliche Lösungsmittel, ausgeführt werden; für die Acylierung, z.B. mit Acetylchlorid oder Propionylchlorid, wird die Umsetzung in einem derartigen Lösungsmittel sogar bevorzugt. Unter diesen Bedingungen ist eine Blockierung der Aldehydendgruppe gewöhnlich nicht erforderlich, da bei der Umsetzung wenig oder keine Verfärbung eintritt. Ausserdem können für die Acylierung anstelle von Acylhalogeniden gewünschtenfalls Säureanhydride verwendet werden.

Die genaue Menge des verwendeten Alkylierungs-Alkenylierungs-, Acylierungs- oder Hydroxyalkylierungsmittels hängt von den Reaktionsbedingungen und dem gewünschten Substitutionsgrad ab. Gewöhnlich wird ein grosser Ueberschuss über die theoretisch erforderliche Menge verwendet, weil das Mittel dazu neigt, falls Wasser Vorhanden ist, in einem gewissen Ausmass mit diesem zu reagieren./Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

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Beispiel 1

6 g Agarose wurde in 225 nil Wasser gekocht und die Lösung auf 8o ⁰C abgekühlt. 0,35 g Natriumborhydrid wurde zugegeben, worauf die Lösung zugedeckt 10 bis 15 Minuten lang in einem Bad von 80 ⁰C gehalten wurde. Eine Lösung von 15 g Natriumhydroxyd in 100 ml Wasser wurde zugesetzt und die Lösung mit der in Tabelle I angegebenen Menge Dimethylsulfat versetzt. 2 Stunden später wurde das Reaktionsgemisch auf 6o ⁰C abgekühlt und mit 3-molarer Essigsäure unter Verwendung von Universalindikator neutralisiert. Die neutrale Lösung wurde mit der 1,5-fachen Volumenmenge 99$igem Isopropylalkohol gemischt. Nachdem das Gemisch abgekühlt war, wurde das ausgefällte Produkt dreimal mit 6o^igem Alkohol gewaschen, möglichst trocken ausgedrückt und in einem Ofen mit Umluft bei 60 ⁰C getrocknet. Um die verschiedenen Produkte zu reinigen, wurden sie in Wasser bei einer Konzentration von 1 Gew.-^ gelöst, worauf man die Lösungen gelieren liess und die Gele gefrieren liess. Nach dem Auftauen fliesst ein grosser Teil des Wassers ab, und das eingeengte Gel wird mit Wasser und Alkohol gewaschen, um die Trocknung zu beschleunigen, und dann bei 60 ⁰C getrocknet. Die Werte und Ergebnisse sind in Tabelle I für Stamm-Agarose I angegeben, die in der unmodifizierten Form eine Geliertemperatur von 36,5 ⁰C hatte.

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Eine Agarose (Stamm-Agarose II) mit einem höheren anfänglichen MethoxygruppengehaIt und einer höheren Geliertemperatur (4o,5 ⁰G) wurde unter Verwendung von 5 bzw. 10 ml Dimethylsulfat in ähnlicher Weise behandelt. Die Reinigung durch Rekonstitution, Gelieren, Gefrieren und Auftauen wurde weggelassen und durch zusätzliche Waschungen mit oO^igem Isopropylalkohol ersetzt. Die Produkte wurden ebenfalls analysiert, um den MethoxygruppengehaIt und die Geliertemperatur zu bestimmen (siehe Tabelle I).

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Tabelle I

co co cn

Probe	τη Τ TVTa CJ /^ XIiX π6οΟυΐ(	% OCH,	Geliertem- oeratur .(⁰O	Prozentuale Zunahme von OCH,	Zunahme des S.G.	Senkung der Geliertem peratur (⁰C)
Stamm-Agarose I	0	0,72	36.5	0	0	0
A	UI	2,87	31	/2,15	0,214	5,5
B	10	5,03	27	4,31	0,434	9,5
C Stamm-Agarose II	20 0	9,06 1,85	17 40,5	8,34 0	0,855 0	. 19,5 .0
D	Ul	3,42 ,	•37,5	1,57	0,156	3
• E	10	• 5,52	32 ^;	3,67-	0,368	8,5

ro ro cn

Beispiel 2

Eine Lösung von 120 g Agarose In 4500 ml Wasser wurde hergestellt und bei 80 ⁰C aufbewahrt. Sie wurde mit 25 ml einer 4,4-molaren Lösung von Natriumborhydrid in l4-molarem wässrigem Natriumhydroxyd versetzt. Nach 10 Minuten wurden 2 Liter einer Lösung, die 3OO g Aetznatronflocken enthielt, zugesetzt. Darauf wurden I60 ml Dimethylsulfat in 20 ml-Portionen im Verlauf von ca. einer Minute zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden lang gelinde gerührt, dann auf 52 ⁰C abgekühlt, mit 3-molarer Essigsäure neutralisiert und mit 85 g des Filterhilfsmittels Hyflo Super-Cel filtriert. Das klare Piltrat wurde zu 2,l4 Volumen 85$igem Isopropylalkohol gegeben, um das Produkt auszufällen. Der kleinfaserige Niederschlag wurde gewaschen mit öo^lgem Isopropylalkohol, zweimal mit Wasser und nochmals mit Isopropylalkohol von einer solchen Konzentration, dass sich zusammen mit dem Wasser in der Methylagarose eine Konzentration von ca. 60 % ergab. Nach Trocknen bei 60 ⁰C wurden 107*5 S Methylagarose erhalten, die eine Geliertemperatur von 30,5 ⁰C (gegenüber 36,5 ⁰C für die Stamm-Agarose), eine Schmelztemperatur von 73*5 ⁰C (gegenüber 90 bis 9I ⁰C) und einen" MethoxygruppengehaIt von 3*38 % (gegenüber 0,63 %) hatte und ein deutlich klareres Gel bildete als.die Stammagarose.

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Beispiel 3

250 g Agarose wurden in 4,5 kg Wasser gelöst und bei 80 ⁰C aufbewahrt. Das Sol wurde mit 50 ml 4,4-molarem Natriumborhydrid in 14-molarem wässrigem Natriumhydroxyd und nach I5 Minuten'mit 500 ml einer wässrigen 34-gew.$igen Lösung von Natriumhydroxydflocken versetzt. Man liess unter Rühren im Verlauf von 10 Minuten eine Lösung von 100 ml 2-Chloräthanol in 500 ml Wasser zulaufen. Nach einer weiteren Stunde wurden ca. 1,3 kg kaltes Wasser und dann 1700 ml 3-^molare Essigsäure zugesetzt. Die Lösung wurde auf 10 kg verdünnt und nach Zugabe von 100 g des Filterhilfsmittels Hyflo. Super-Cel filtriert. Das Produkt wurde isoliert, indem man das Filtrat mit 2,13 Volumen 85$igemIsopropylalkohol mischte. Die resultierenden fest verflochtenen Fasern wurden viermal mit 6 Liter-Portionen von 6Q$igem Isopropylalkohol gewaschen und getrocknet, wobei man 231>5 g Hydroxyäthylagarose mit einer Geliertemperatur von 28 ⁰C und einer Schmelztemperatur von 66 ⁰C (gegenüber 36,5 ⁰C bzw. 93 ⁰C für das Ausgangsmaterial) erhielt. Das Gel war klarer als dasjenige der Stamm-Agarose, was quantitativ festgestellt wurde, indem· man jedes Gel bei einer Konzentration von 1 % und einer Schichtdicke von 5 crn in.einen Pisher-Elektrophotometer mit einer Standardtonsuspenslon verglich, was ein Routinetest bei der Wasser-

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- l4 -

analyse ist. Die Stamm-Agarose war 198 Teilen pro Million Teile und das in diesem Beispiel hergestellte Derivat 120 Teilen pro Million Teilen der Tonsuspension äquivalent. Das 2-Chloräthanol konnte durch Aethylenoxyd ersetzt werden, wobei ähnliche Ergebnisse erhalten wurden.

Beispiel 4

Aus der in Beispiel 3 verwendeten Stamm-Agarose wurde unter Anwendung verschiedener Verhältnisse von 2-Chloräthanol zu Agarose Hydroxyäthylagarose hergestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben.

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Tabelle II

Probe	Zunahme von CH₂CHpOH⁺	Gelier tempera tür (⁰C)	Zunahme des S.G.	Senkung der Gelier temperatur (⁰C)
Stamm-Agarοse	0	36,5	__	—
A	3,44 fo	28,5	0,242	8
B	4,02 fo	28	0,285	8,5
C	5,75 fo	24	0,4l4	12,5
D	10,62 fo	10,5	o,8o6	26

+ Analysiert mittels der modifizierten Methode von Zeisel nach Morgan [Ind. Eng. Chem., Anal. Ed^-. ^8, 500 (1946)3 und Lortz [Anal. Chem. 28, 892 (1956)]. Der Methoxygruppengehalt von 0,66 f> der mimodifliierten Stamm-Agarose wurde in Hydroxyäthyl (0,94 fo) umgerechnet und als Grundwert für die Stamm-Agarose verwendet und von den Hydroxyäthylwerten aller Proben abgezogen, um die prozentuale Zunahme der Hydroxyäthylgruppen zu bestimmen. Probe B ist das in Beispiel 3 hergestellte Material.

Beispiel 5

Eine Losung von 6 g Agarose in 225 ml Wasser wurde mit 1 ml 4,4-molarer Natriumborhydridlösung bei 8o ⁰C 15 Minuten lang behandelt und dann mit 100 ml 3,75-molarem Natriumhydroxyd stark alkalisch gemacht.

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Die Temperatur der Lösung wurde dann auf einen für das zu verwendende Reagens geeigneten Wert eingestellt und dieses, wie in Tabelle III angegeben, zugesetzt. Nach einer Stunde wurde das Gemisch mit 3-molarer Essigsäure auf ca. pH =6,8 neutralisiert und das Derivat durch Ausfällung aus Lösung mit 2,l4 Volumen 85$igem Isopropylalkohol isoliert. Die Analysen wurden nach der Methode von Zeisel oder einer abgeänderten Ausführungsform derselben oder im Falle von Allylagarose direkt durch Bromaufnahme bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III wiedergegeben.

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	Reagens	Derivat	Tabelle III	Menge des Reagens	Zunahme des S.G.	Senkung der Gelier temperatur (⁰C)
	Propylenoxyd	Hydroxypropyl		5,4 ml	0,141
	Propylenoxyd	Hydroxypropyl	Reaktionstempera tur (⁰C)	10,8 ml	0,206	7,5·
	Propylenoxyd	Hydroxypropyl	43	10,0 ml .·	0,486	12,0
	3-Brompropen	Allyl	42'	6,9 ml ·	0_s125	8_T0
	3-Brompropen ·	Allyl	25	13j8 ml ' '	0,738	17,5 ^
ro	2-Brompropan	'Isopropyl	71	7,5 ml.	0,013	1,3
ο CD	2»3rompropan	Isopropyl	71	• 15/0 ml , ..■	0,023	• -1,?
CD cn	1-Brompropan	n-Propyl	52	7_; 3 ml	0,065	l.i 5
	1-Brompropan	• n-Propyl	52 ;	• 14., 6 ml	OjlO3.	2,7
ο		65
co	65

* 10 ml Propylenoxyd für 5 S Agaröse, die in 100 ml 1,15-molarem Natriumhydroxyd, das 0,5 ml 4,4-molare Natriumborhydridlösung enthielt, aufgeschlämmt war. Das Gemisch wurde 65 Stunden lang auf ca. 25 ⁰C gehalten.

Beispiel 6

6 g Agar mit einer Ge Her temper a tür von 44 ⁰C wurden in 225 ml Wasser gelöst, mit 1 ml 4,4-molarem Natriumborhydrid reduziert und mit 100 ml 3,75-molarem Natriumhydroxyd alkalisch gemacht. Während die Temperatur auf 80 ⁰C gehalten wurde, wurden 5 ml Dimethylsulfat zugesetzt; nach einer Reaktionsdauer von einer Stunde wurde das Gemisch auf 55 ⁰C abgekühlt und mit I08 ml 3-molarer Essigsäure auf pH = 6,8 neutralisiert. Der methylierte Agar wurde durch Ausfällen mit Alkohol isoliert und hatte nach Waschen und Trocknen in geeigneter Weise eine Geliertemperatur von 38,5 ⁰C, was eine Abnahme um 5*5 ⁰C gegenüber dem Ausgangsmaterial entsprach.

Beispiel 7

Die Acylierung von Agarose.wurde in einem nichtwässrigen System folgenderrnassen ausgeführt: 21 g Agarose wurden durch Erhitzen auf 100 bis 110 ⁰C mit einem Heizmantel unter gutem Rühren in N,N~Dimethy!formamid gelöst,

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so dass sich ein Gesamtgewicht von 350 g ergab. Drei Portionen von je 100 g (die also je 6 g Agarose enthielten) wurden in verschiedene 200 ml-Rundkolben mit einem geschliffenen Glashals übergeführt. Lösungen von Essigsäureanhydrid in Dimethylformamid (5 ml, mit Dimethylformamid auf 50 ml verdünnt) und von Pyridin in Dimethylformamid (8,52 ml, mit Dimethylformamid auf 50 ml verdünnt) wurden hergestellt; gleiche Portionen dieser Lösungen wurden den drei Agaroselösungen in Mengen von 5, 10 bzw. 20 ml zugesetzt. Die Gemische wurden bei 50 ⁰C ca. 18 Stunden lang aufbewahrt und dann zu 250 ml 75$igem Isopropylalkohol gegeben, worauf die partiell acetylierte Agarose ausgefällt wurde. Alle Agaroseproben wurden viermal mit 6o$igem Alkohol gewaschen und dann getrocknet. Der Acetylgehalt wurde mittels der Methode bestimmt, die von Owens et al, Bureau of Agricultural and Industrial Chemistry, Western Regional Research Laboratory, U.S.D.A., Albany, California (1952), S. 9 für Pektin angewandt wurde, wobei aber kein aliquoter Teil in den Destillationskolben übergeführt wurde, sondern eine Probe entsprechender Grosse direkt in den Kolben eingewogen wurde, worauf die Verseifung direkt in dem Kolben ausgeführt wurde. Dies war wegen der Unlöslichkeit von Agarose bei Raumtemperatur erforderlich. Tabelle IV gibt an, wie stark die

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Geliertemperatur unter diesen Bedingungen gesenkt wurde.

Tabelle IV

	Geliertempera tur (⁰C)	Zunahme des S.G.	Senkung der Geliertempera tur (⁰C)
Verwendete Menge Essigaäureanhydrid (ml) .	35,3.	0,0	0 ,
0	34	O,O89	1,3
5	30	0,201	5,3
10	18	0,403	17,3
20	Beispiel 8

Eine heisse Lösung von 6 g Agarose in 225 ml Wasser wurde auf 50 ⁰C abgekühlt und durch Zugabe von 100 ml 3,75-molarer Natriumhydroxydlösung stark alkalisch gemacht. Es wurde kein Natriumborhydrid zur Farbverbesserung verwendet. Das Gemisch färbte sich schnell gelb und wurde rasch dunkler. Es wurde mit 5 ml Dimethylsulfat behandelt und eine weitere Stunde lang auf 50 ⁰C gehalten; dann hatte es eine intensive grünliche Farbe. Durch Neutralisieren mit 3-molarer Essigsäure hellte sich die Farbe nach braun und dann nach tiefrosa auf. Als man das Produkt durch Ausfällen mit Alkohol isolierte, löste sich ein grosser Teil der Farbe in der Mutterlauge aber das Produkt hatte nach Waschen und Trocknen noch

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eine rosabraune Farbe. Die Geliertemperatur des Produktes betrug 31 ⁰C* was einer Abnahme um 5*5 ⁰C gegenüber dem Ausgangsmaterial entsprach. Ein aus diesem Material hergestelltes l^iges Gel war viel klarer als ein aus der Stamm-Agarose hergestelltes Gel, hatte aber eine ausgeprägte rosagraue Farbe. Trotzdem ist es klar, dass die Reduktion der Endgruppe bei der Herstellung von Derivaten der hier beschriebenen Art weggelassen werden kann.

Beispiel 9

Eine Lösung von 6 g Agarose (Geliertemperatur 36,5 ⁰C) in 225 ml Wasser wurde auf 80 ⁰C gehalten, 10 Minuten lang mit 0,35 g Natriumborhydrid behandelt, mit 100 ml 3,75-molarem Natriumhydroxyd stark alkalisch gemacht, 2 Stunden lang aufbewahrt und dann weitere 2 Stunden lang mit 0,50 ml Epichlorhydrin umgesetzt. Das Gemisch wurde abgekühlt und neutralisiert und das dihydroxypropylierte Produkt wie in den vorhergehenden Beispielen isoliert und gewaschen. Es hatte eine Geliertemperatur von 34,3 ⁰C, was einer Senkung um 2,2 ⁰G gegenüber dem Ausgangsmaterial entspricht.

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Claims

- 22 Patentansprüche

J) Modifizierter Agar oder modifizierte Agarose, dadurch gekennzeichnet, dass er bzw. sie alkyliert, alkenyliert, acyliert oder hydroxyalkyliert worden ist, wobei die Alkyl-, Alkenyl- und Acylgruppen 1 bis 3 Kohlenstoffatome und die Hydroxyalkylgruppen 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten, -- dass er bzw. sie wasserlöslich ist und eine um mindestens 1 ⁰C niedrigere Geliertemperatür hat als der entsprechende unmodifizierte Agar bzw. die entsprechende unmodifizierte Agarose.
2. Agar oder Agarose nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die endständigen Aldehydgruppen zu Hydroxylgruppen reduziert werden.
3· Agar oder Agarose nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er bzw. sie methyliert ist.
4. Agar oder Agarose nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass er bzw. sie methyliert ist.
5. Agar oder Agarose nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er bzw. sie hydroxyäthyliert ist.
6. Agar oder Agarose nach Ansprüchen 1 und 2,, dadurch gekennzeichnet, dass er bzw. sie hydroxyäthyliert ist.
7. Verfahren zur Herstellung von Agar oder Agarose nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Agar oder

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Agarose alkyliert, alkenyliert, acyliert oder hydroxyalkyliert, um in den Agar oder die Agarose eine Alkyl-,· Alkenyl- oder Acylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder eine Hydroxyalky!gruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen einzuführen.
8. Verfahren zur Herstellung von Agar oder Agarose nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man den Agar oder die Agarose zuerst mit einem Reduktionsmittel umsetzt, um die endständigen Aldehydgruppen zu Hydroxylgruppen zu reduzieren, und dann alkyliert, alkenyliert, acyliert oder hydroxyalkyliert.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Alkylierung, Alkenylierung, Acylierung oder Hydroxyalkylierung in wässriger alkalischer Lösung ausführt.
10. Verfahren nach Ansprüchen 7 bis 9* dadurch gekennzeichnet, dass man Agar oder Agarose mit Dimethylsulfat methyliert.
11. Verfahren nach Ansprüchen 7 bis 9* dadurch gekennzeichnet, dass man Agar oder Agarose mit 2-Chloräthanol oder mit Acthyleiioxyd hydroxyäthyliert.

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