DE2226297C3

DE2226297C3 - Verfahren zur Herstellung von modifiziertem Agar oder modifizierter Agarose

Info

Publication number: DE2226297C3
Application number: DE2226297A
Authority: DE
Inventors: Kenneth Balm Union Me. Guiseley (V.St.A.)
Original assignee: FMC Corp
Current assignee: FMC Corp
Priority date: 1971-06-07
Filing date: 1972-05-30
Publication date: 1980-02-14
Also published as: DE2226297A1; GB1350024A; SE384372B; FR2140452B1; CH579598A5; FR2140452A1; CA955591A; DE2226297B2; ZA722242B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Modifizieren von Agarose oder Agar zwecks Senkung ihrer Gelier- und Schmelztemperaturen.

Sowohl Agar als auch Agarose (einer der Bestandteile von Agar) wurden in Form wäßriger Gele in großem Umfang als Kulturmedien und als Substrate für die Elektrophorese sowie für verschiedenartige Umsetzungen unter Diffusion verwendet; Agarosegele bieten spezielle Vorteile wegen ihrer im wesentlichen nicht ionogenen Beschaffenheit. Bei allen derartigen Anwendungen sowie bei Verwendung von Agar und Agarose als Verdickungsmittel in Nahrungsmitteln und Kosmetika sowie bei anderen üblichen Verwendungen dieser Materialien ist die Geliertemperatur von besonderer Bedeutung. Zwar ist beispielsweise die Geliertemperatur von Lösungen vieler Proben von Agar und Agarose aus natürlichen Quellen ca. 35 bis 36° C, aber langes Stehenlassen derartiger Lösungen bei einer Temperatur von 40° C oder sogar noch höher führt häufig zur Verdickung oder beginnenden Gelierung. Wenn man derartige Lösungen für biologische Untersuchungen verwendet, ist es daher schwierig, Proben herzustellen, ohne bei so hohen Temperaturen zu arbeiten, daß die verwendeten Organismen oder Reagenzien getötet oder inaktiviert werden.

Die Untersuchung des verschiedenen Methoxygruppengehaltes von Agarose, die aus natürlichen Quellen erhalten wurde, zeigte, daß Proben mit höherem Methoxygruppengehalt auch höhere Geliertemperaturen haben.

Die Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung von modifizierten Agar oder modifizierter Agarose, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Agar oder Agarose, gegebenenfalls nach vorhergehender Reduktion der endständigen Aldehydgruppen zu Hydroxylgruppen, äthyliert, propyliert, alkenyliert oder hydroxyalkyliert, wobei die eingeführten Alkenylgruppen 2 oder 3 Kohlenstoffatome und die Hydroxyalkylgruppen 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten. Die so erhaltenen Produkte sind wasserlöslich und haben eine um mindestens 1°C niedrigere Geliertemperatur hat als das entsprechende unmodifizierte Agar oder die entsprechende unmodifizierte Agarose.

Der Begriff »Geliertemperatur bedeutet die Temperatur, bei der eine Flüssigkeit oder ein Sol beim Abkühlen zu einem steifen Gel erhärtet und muß von der Gelatinisierung unterschieden werden, bei der, wie im Falle der Stärke, beispielsweise Hydratisierung eintritt Insbesondere bedeutet die »Geliertemperatur« die Temperatur, bei der Härtung eintritt, wenn eine 1,5 Gew.-% Agarose oder Agar enthaltende Lösung mit einer Geschwindigkeit von 0,5⁰C pro Minute abgekühlt wird.

Weil erfindungsgemäß kein? ionischen Gruppen in Agar oder Agarose eingeführt werden, ist die Erfindung besonders wertvoll für die Herstellung von Agarose mit niedriger Geliertemperatur für die Verwendung als Substrat bei der Elektrophorese. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine Abnahme der Geliertemperatur sogar bis zum Gefrierpunkt von Wasser oder noch niedriger erzielt werden.

Auch andere wichtige Eigenschaften von Agar und Agarose werden durch die Erfindung verbessert; die Schmelztemperatur wird gesenkt und die Klarheit des Gels erhöht

Der Äthylierungs-, Propylierungs-, Alkenylierungs- oder Hydroxyalkylierungsgrad, der erforderlich ist, um eine bestimmte Abnahme der Geliertemperatur zu erzielen, hängt in einem gewissen Grade von der Herkunft und der ursprünglichen Geliertemperatur des unmodifizierten Agars bzw. der unmodifizierten Agarose sowie von der Art der vorhandenen besonderen Alkyl-, Alkenyl-, Hydroxylalkylgruppen ab. Der Subslitutionsgrad kann in bezug auf die vier theoretisch zur Verfügung stehenden reaktiven Gruppen in dem aus D-Galactose und 3,6-Anhydro-L-galactose bestehenden Disaccharidmolekül, das die Hauptkomponente von Agarose darstellt, definiert werden. So ausgedrückt hat ein Produkt, bei dem alle zur Verfügung stehenden Gruppen vollständig umgesetzt worden sind, einen Substitutionsgrad (S. G.) von 4,0. Als spezielles Beispiel kann die Zunahme des Substitutionsgrades eines hydroxyäthylierten Produktes gemäß der Erfindung folgendermaßen berechnet werden:

Zunahme des S. G. =

χ Gew.-% Hydroxyäthyi
(T(X) χ 45)-(44 χ Gew.-% Hydroxyäthyi)'

In dieser Gleichung bedeuten:

306 das Molekulargewicht einer Moleküleinheit der Agarobiose [(Anhydro)disaccharid], die als der Agarose äquivalent angesehen werden kann,
45 das Molekulargewicht einer Hydroxyäthylgruppe 44 das Molekulargewicht einer Hydroxyäthylgruppe vermindert um das Atomgewicht des bei der Substitutionsreaktion
Stoffs.

abgespaltenen Wasser-

Für andere Ausgangsstoffe und Substitutionsreaktionen sind die entsprechenden Molekulargewichte der jeweiligen Einheiten bzw. Gruppen einzusetzen.

im allgemeinen haben die erfindungsgemäßen Produkte eine Zunahme des Substitutionsgrades von ca.

0,01 bis 1,0; obgleich es möglich ist, eine größere Zunahme des Substitutionsgrades zu erzielen, bietet eine Zunahme von über 1,0 wenig Vorteile. Die geringste brauchbare Zunahme des Substitutionsgrades für die erwünschtesten und am allgemeinsten verwendbaren Produkte ist gleich derjenigen Zunahme, die erforderlich ist, um einen modifizierten Agar oder eine modifizierte Agarose mit einer um mindestens 1°C niedrigeren Geliertemperatur als das entsprechende unmodifizierte Agar bzw. die entsprechende unmodifizierte Agarose herzustellen; wie aus den Angaben in den folgenden Beispielen ersichtlich ist, handelt es sich dabei um eine Zunahme des Substitutionsgrades von mindestens ca. 0,01 je nach der vorhandenen speziellen Substituentengruppe.

Bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in einem wäßrigen Medium, was im allgemeinen bevorzugt wird, wird das Agar oder die Agerose zuerst in starkem wäßrigen Alkali, das ca. 0,5- bis l,5molar an Alkalimetallhydroxyd ist, gelöst, worauf ein geeignetes Reagens zugesetzt wird, z. B. Äthylbromid, 1-Brompropan, 2-Brompropan, 3-Brompropen, Propylenoxyd, Äthylenoxyd, 2-Chloräthanol, Epichlorhydrin, Butylenoxyd oder Diepoxybutan. Da bei Ausführung der Umsetzung in wäßriger alkalischer Lösung eine Neigung zu etwas Verfärbung oder Dunkelfärbung der Lösung besteht, wodurch ein Produkt erzeugt wird, das verfärbt, wenn auch im übrigen vollständig befriedigend ist, wird es auch bevorzugt, die Aldehydendgruppe der Agerose, beispielsweise durch Reduktion zu reduzieren, ehe man das Agar oder die Agerose mit dem wäßrigen Alkali in Berührung bringt, wodurch die Farbbildungsreaktion an der die Aldehydgruppe beteiligt ist, verhindert wird. Das Reduktionsmittel der Wahl ist ein Borhydrid, insbesondere ein Alkalimetallborhydrid, wie Natriumborhydrid, das die endständige Aldehydgruppe zu einer alkoholischen Hydroxylgruppe reduziert.

Ein bifunktionelles Reagens, wie Epichlorhydrin, das unter geeigneten Bedingungen Vernetzung unter Bildung eines wasserunlöslichen Produktes herbeizuführen vermag, kann nur unter Bedingungen verwendet werden, welche die Vernetzung verhindern und zu einem wasserlöslichen Produkt führen, d. h. zu einem Produkt, das bei 9O⁰C in einer Menge von mindestens 2 Gew.-% löslich ist Bekanntlich kann die Vernetzung vermieden werden, wenn man für die Reaktion eine verdünnte (weniger als 3,5gew.-%ige) Lösung von Agar oder Agarose verwendet oder andere dem Fachmann bekannte Verfahren anwendet. Abgesehen von der Notwendigkeit, die Bildung eines wasserunlöslichen Produktes bei Verwendung bifunktioneller Reagenzien zu vermeiden, sind die Konzentrationen oder anderen angewandten Bedingungen nicht von Bedeutung.

Die Reaktion wird vorzugsweise bei einer erhöhten Temperatur von ca. 70 bis 100°C oder mehr ausgeführt, aber man kann auch niedrigere Temperaturen anwenden, um die Verfärbung zu verringern, wenn die Aldehydendgruppe nicht blockiert ist, oder um die Verluste zu verringern, wenn ein verhältnismäßig flüchtiges Reagens verwendet wird. Bei niedrigeren Temperaturen verläuft die Reaktion langsamer, und in manchen Fällen wird das gewählte Reagens durch Umsetzung mit dem Wasser zersetzt, ehe der gewünschte Umsetzungsgrad mit Agarose erzielt werden kann.

Nach Beendigung der Umsetzung wird das Gemisch auf 50 bis 60° C abgekühlt, falls es sich auf einer höheren Temperatur befindet, das Alkali wird mit einer Säure neutralisiert oder durch Dialyse oder auf andere übliche Weise entfernt, und das Produkt wird in üblicher Weise gereinigt Beispielsweise kann die Lösung durch Abkühlen geliert, gefroren und wieder aufgetaut und der Rückstand dann gewaschen oder getrocknet werden, oder das Produkt kann aus der Reaktionslösung durch Mischen mit einer mit Wasser mischbaren organischen Flüssigkeit, die ein Nichtlöser für das Produkt darstellt, wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Propanol oder Aceton, ausgefällt und der Niederschlag abfiltriert, mit dem Nichtlöser gewaschen und getrocknet werden.

Das Verfahren kann auch in einem organischen Lösungsmittel, wie N,N-Dimethy]formamid oder Pyridin, ausgeführt werden. Unier diesen Bedingungen ist eine Blockierung der Aldehydendgruppe gewöhnlich nicht erforderlich, da bei der Umsetzung wenig oder keine Verfärbung eintritt.

Die genaue Menge des verwendeten Alkylierungs-, Alkenylierungs- oder Hydroxyalkylierungsmittels hängt von den Reaktionsbedingungen und dem gewünschten Substitutionsgrad ab. Gewöhnlich wird ein großer Überschuß über die theoretisch erforderliche Menge verwendet, weil das Mittel dazu neigt, falls Wasser vorhanden ist, in einem gewissen Ausmaß mit diesem zu reagieren.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

250 g Agarose wurden in 4,5 kg Wasser gelöst und bei 8O⁰C aufbewahrt. Das Sol wurde mit 50 ml 4,4-molarem Natriumborhydrid in 14-molarem wäßrigem Natriumhydroxyd und nach 15 Minuten mit 500 ml einer wäßrigen 34gew.-%igen Lösung von natriumhydroxyflocken versetzt. Man ließ unter Rühren im Verlauf von 10 Minuten eine Lösung von 100 ml 2-Chloräthanol in 500 ml Wasser zulaufen. Nach einer weiteren Stunde wurden ca. 1,3 kg kaltes Wasser und dann 1700 ml 3-molare Essigsäure zugesetzt. Die Losung wurde auf 10 kg verdünnt und nach Zugabe von 100 g des Filterhilfsmittels Hyflo Super-Cel® filtriert. Das Produkt wurde isoliert indem man das Filtrat mit 2,13 Volumen 85%igem Isopropylalkohol mischte. Die resultierenden fest verflochtenen Fasern wurden viermal mit 6 Liter-Portionen von 60%igem Isopropylalkohol gewaschen und getrocknet, wobei man 231,5 g Hydroxyäthylagarose mit einer Geliertemperatur von 28°C und einer Schmelztemperatur von 66⁰C (gegenüber 36,5⁰C bzw. 93⁰C für das Ausgangsmaterial) erhielt. Das Gel war klarer als dasjenige der Stamm-Agarose, was quantitativ festgestellt wurde, indem man jedes Gel bei einer Konzentration von 1 % und einer Schichtdicke von 5 cm in einem Elektrophotometer mit einer Standardtonsuspension verglich. Dies ist ein Routinetest bei der Wasseranalyse. Die Stamm-Agarose war 198 Teilen pro Million Teile und das in diesem Beispiel hergestellte Derivat 120 Teilen pro Million Teilen der Tonsuspension äquivalent. Das 2-Chloräthanol konnte durch Äthylenoxyd ersetzt werden, wobei ähnliche Ergebnisse erhalten wurden.

In ähnlicher Weise wurden aus der gleichen Stamm-Agarose wurde unter Anwendung verschiedener Verhältnisse von 2-Chloräthanol zu Agarose verschiedene Hydroxyäthylagaroseproben mit unterschiedlicher Substitutionsgrad-Zunahme hergestellt. Die Eigenschaften der Produkte sind in der Tabelle 1 zusammengestellt.

Tabelle 1

Probe

Zunahme von CH₂CH₂OH*)

Geliertemperatur

CC) Zunahme
des S. G.

Senkung der Geliertemperatur

Stamm-Agarose	O	36,5	—	—
A	3,44%	28,5	0,242	8
B	4,02 %	28	0,285	8,5
C	5,75 %	24	0,414	12,5
D	10,62 %	10,5	0,806	26

*) Analysiert mittels der modifizierten Methode von Zeisel nach Morgan [Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 18, 500 (1946)] und Lortz [Anal. Chem. 28, 892(1956)]. Der Methoxygruppengebalt von 0,66% der unmodifizierten Stamm-Agarose wurde in Hydroxyäthyl (0,94 %) umgerechnet und als Grundwert für die Stamm-Agarose verwendet und von den Hydroxyäthylwerten alier Proben abgezogen, um die prozentuale Zunahme der Hydroxyäthylgruppen zu bestimmen. Probe B ist das nach Beispiel 1 hergestellte Material.

Beispiel 2

Eine Lösung von 6 g Agarose in 225 ml Wasser wurde mit 1 ml 4,4-molarer Natriumborhydridlösung bei 8O⁰C 15 Minuten lang behandelt und dann mit 100 ml 3,75molai-em Natriumhydroxyd stark alkalisch gemacht.

Die Temperatur der Lösung wurde dann auf einen für das zu verwendende Reagens geeigneten Wert eingestellt und dieses, wie in Tabelle 2 angegeben, zugesetzt. Nach einer Stunde wurde das Gemisch mit 3molarer Essigsäure auf ca. pH=6,8 neutralisiert und das Derivat durch Ausfällung aus der Lösung mit 2,14 Volumen 85%igem Isopropylalkohol isoliert. Die Analysen wurden nach der Methode von Zeisel oder einer abgeänderten Ausführungsform derselben oder im Falle von Allylagarose direkt durch Bromaufnahme bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

Tabelle Π

Reagens

Derivat

Reaktionstemperatur

(X) Menge des
Reagens

Zunahme des S. G.

Senkung der Geliertemperatur

CQ

Propylenoxyd

3-Brompropen

3-Bromprcipen

2-Brompropan

l-Brompropjin

l-Brompropan

Hydropropyl

Hydroxypropyl

Allyl

Isopropyl

n-Propyl

43 42 25 71 71 52 52 65 65

5,4 ml	0,141
10,8 ml	0,206
10,0 ml*)	0,486
6,9 ml	0,125
13,8 ml	0,738
7,5 ml	0,013
15,0 ml	0,023
7,3 ml	0,065
14,6 ml	0,103

4,5 7,5

12,0 8,0

17,5 1,3 1,5 1,5 2,7

*) 10 ml Propylenoxyd Tür 5 g Agarose, die in 100 ml 1,15-molarem Natriumhydroxyd, das 0,5 ml 4,4-molare Natriumborhydridlösung enthielt, aufgeschlämmt war. Das Gemisch wurde 65 Stunden lang auf ca. 25°C gehalten.

Beispiel 3

Eine Lösung von 6 g Agarose (Geliertemperatur 36,5°C) in 225 ml wurde auf 80⁰C gehalten. 10 Minuten eo lang mit 0,35 g Natriumborhydrid behandelt, mit 100 ml 3,75molarem Natriumhydroxyd stark alkalisch gemacht, 2 Stunden lang aufbewahrt und dann weitere 2 Stunden lang mit 0,50 ml Epichlorhydrin umgesetzt. Das Gemisch wurde abgekühlt und neutralisiert und das (dihydroxypropylierte Produkt wie in den vorhergehenden Beispielen isoliert und gewaschen. Es hatte eine Geliertemperatur von 34,3° C, was einer Senkung um 2,2° C gegenüber dem Ausgangsmaterial entspricht.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von modifiziertem Agar oder modifizierter Agarose, dadurch gekennzeichnet, daß man Agar oder Agarose, gegebenenfalls nach vorhergehender Reduktion der endständigen Aldehydgruppen zu Hydroxylgruppen, äthyliert, propyliert, alkenyliert oder hydroxyalkyliert, wobei die eingeführten Alkenylgruppen 2 oder 3 Kohlenstoffatome und die Hydroxyalkylgruppen 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Agar oder Agarose mit 2-ChloräthanoI oder Äthylenoxid hydroxyäthylierL