CN115612185A - 一种大孔刚性琼脂糖凝胶微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大孔刚性琼脂糖凝胶微球的制备方法。其特征是向琼脂糖非均相水溶液中添加环状酸酐使其与琼脂糖链发生单一酰化反应，然后在琼脂糖均相水溶液中发生交联反应，通过温度控制酸酐与琼脂糖链的交联程度，形成的交联琼脂糖溶液通过高压喷雾将形成的液滴喷入冷却的乙酸乙酯溶液中迅速凝固成球，制备得到大孔刚性琼脂糖微球。本发明所述方法工艺简单，产品孔径可控。所得产品在原有琼脂糖凝胶优良性能的基础上，刚性及孔径大大增加，是一种理想的色谱固定相介质和优良的固定化酶载体，特别是用作液相色谱介质时，可以在较高流速下工作，实现生物大分子的快速、高效分离。
Description
技术领域
本发明涉及琼脂糖凝胶介质的制备技术领域，尤其涉及一种大孔刚性琼脂糖凝胶微球的制备方法。
背景技术
琼脂糖微球由于其固有的中性、亲水性和多孔性，已被广泛用于生物大分子纯化的色谱填料。但琼脂糖凝胶的柔软性使其形成的微球在色谱填料的应用中受到限制。当流量增加时，填充琼脂糖基色谱介质的色谱柱有压缩的趋势，压降将急剧增加。虽然大粒子的使用可以减轻这种影响，但这只能以粒子内传质距离的大幅增加为代价，这对生物大分子的分离是不可取的。在高流速时，其负面影响尤为明显，会导致波段变宽以及分辨率差。因此，迫切需要开发具有增强传质性能的刚性琼脂糖微球，以满足高速色谱的要求。交联是一种常用的提高琼脂糖微球力学强度的方法。它通过交联剂化学结合多糖链来稳定凝胶主链。通常，交联剂是在凝胶颗粒形成后引入的，称为后交联，即交联剂必须在凝胶颗粒内部扩散，才能接近羟基位置。琼脂糖凝胶网络的空间位阻严重阻碍了扩散过程。因此交联效率大大降低，得到的琼脂糖微球硬度不够。此外，作为色谱介质最重要的特性之一，孔结构有助于蛋白质分子通过凝胶网络的运输，并且直接影响色谱分析的效率。影响琼脂糖凝胶微球孔结构的因素很多，例如琼脂糖的性质、交联剂、致孔剂等。第一，琼脂糖溶液的性质对孔结构的形成有很大影响，并且孔径随琼脂糖溶液的浓度而变化，然而，琼脂糖类型的影响，例如分子结构，还没有报道；第二，交联剂对孔结构有重要影响，然而，目前还没有关于交联度影响的报道。第三，成孔剂在孔隙结构中起着重要作用，据报道，通过双乳化程序或使用碳酸钙颗粒作为成孔剂可形成非常大的流动孔。基于琼脂糖层析介质的凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析和亲和层析等分离技术在蛋白、病毒、核酸和多肽等纯化领域同样有很好的效果。此类介质虽然商品化程度较高，但由于技术保密等原因，成熟的制备技术鲜有报道。目前我国在微球制备以及功能化方面的发展还处于探索阶段，国内对此类凝胶微球的需求多依赖进口，价格昂贵，应用成本较高。
发明内容
为了解决这一问题，本发明提出预交联法。该方法的特点是在凝胶微球形成前将交联剂加入琼脂糖均相溶液中，可制备出交联剂均匀分布于整个粒子内部的改性琼脂糖微球。除机械稳定性外，色谱性能还与固定相的质粒内传质阻力密切相关。众所周知，在琼脂糖网络中，蛋白质等生物大分子的粒子内扩散是相当缓慢的。而扩大色谱介质的孔径是提高传质效果最有效的方法之一。现行的解决方案是以固体颗粒为致孔剂，采用双乳化法制备琼脂糖微球。但双重乳化形成的孔隙过大，难以控制。而固体致孔剂的缺点是，除非使用高含量的致孔剂，否则难以形成互穿孔结构，而互穿孔结构又会形成力学性能较差的多孔微球。本发明发现琼脂糖在温度介导下与环状酸酐发生交联反应，酸酐前体的引入可有效提高琼脂糖凝胶网络的孔径，即实现交联程度及孔径的可控调节，为大孔径刚性琼脂糖微球这一前沿科学问题提供解决方案。
本发明的目的在于提供一种既保留了琼脂糖的高凝胶强度又具备数百纳米的大孔刚性琼脂糖凝胶微球的制备方法。同时该方法也解决现有致孔方法普遍存在的制备工艺复杂、致孔剂残留等问题。这种大孔刚性琼脂糖凝胶微球在保证原有琼脂糖凝胶优良性能的基础上，孔径大大增加，并且具有优异的机械强度，是一种理想的液相色谱固定相介质和优良的固定化酶载体，特别是用作液相色谱介质时，可以在较高流速下工作，实现生物大分子的快速、高效分离。
为实现上述目的，本发明提供一种大孔刚性琼脂糖凝胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将琼脂糖分散于去离子水中，配置成第一琼脂糖悬浮液；
S2、在搅拌条件下，环状酸酐用乙醇溶解成环状酸酐溶液，将环状酸酐溶液逐滴加入至上述第一琼脂糖悬浮液中进行反应得到第二琼脂糖悬浮液，反应期间维持pH8～8.5，反应结束后调节pH至6.5；
S3、通过加热使第二琼脂糖悬浮液快速完全溶解，然后快速降温进行二次反应，反应期间pH调至7～9；
S4、反应结束后，采用高压喷雾装置将琼脂糖溶液雾化，雾化液滴的接收溶剂为冷却的乙酸乙酯溶液；
S5、采用离心或过滤除去乙酸乙酯溶液，通过洗涤除去琼脂糖微球表面的有机溶剂，最终得到大孔刚性琼脂糖微球。
进一步，所述S1步骤中，琼脂糖悬浮液的质量浓度为4％～8％。
进一步，所述S1步骤中，所述琼脂糖在浓度为1.5wt％时的凝胶强度大于1500g/cm2。
进一步，所述S2步骤中，所述环状酸酐选自顺丁烯二酸酐、反丁烯二酸酐、丁二酸酐及戊二酸酐中的至少一种；
任选的，所述第一琼脂糖悬浮液中的琼脂糖与环状酸酐的摩尔比为1:1～4:1，琼脂糖以二糖单位计。
进一步，所述S2步骤中，所述反应为非均相单一酰化反应，反应温度为30～40℃，反应时间为1～2h；
任选的，所述反应为非均相单一酰化反应，所得琼脂糖在浓度为1.5wt％时的的凝胶强度为900～1300g/cm2。
进一步，所述S3步骤中，所述二次反应为均相交联反应，反应温度为60～75℃，反应时间为1～2h，反应pH维持8～8.5。
进一步，所述S3步骤中，所述反应为交联反应，所得琼脂糖在浓度为1.5wt％时的的凝胶强度大于1500g/cm2。
进一步，所述S4步骤中，采用高压喷雾装置将琼脂糖溶液雾化步骤中，所述喷雾压力为0.1～0.4MPa。
进一步，所述S5步骤中，所述的大孔刚性琼脂糖微球的粒径为45～155μm，孔径在100～500nm，耐受压力达到0.1Mpa，最高流速可达180cm/h～300cm/h，排阻极限为200000Da球蛋白。
本发明还提供一种大孔刚性琼脂糖凝胶微球，其特征在于：其由上述制备方法制得。
所述制备得到的琼脂糖微球孔径取决于琼脂糖的浓度及交联程度，凝胶孔的孔径随琼脂糖浓度的增加而减小，随交联程度的增加而增大。
与现在技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明提供的环状酸酐预交联法制备大孔刚性琼脂糖微球工艺，无需制备复乳体系，无需添加表面活性剂，即可得到大孔刚性结构。该法有效避免了复乳法中致孔过程中由于乳液稳定性差异导致内相液滴融合，引起的孔径过大以及孔径不可控的问题，根据本发明提供的方法，可通过温度控制环状酸酐与琼脂糖链的交联程度，进而实现对产品孔径的调控。
(2)与油/水体系不同，本发明是利用环状酸酐开环后形成的双羧基与琼脂糖不同糖链中的羟基发生交联反应，该交联反应取代了琼脂糖链在凝胶时氢键的作用，酸酐前体的引入起到空间位阻的作用，使琼脂糖链在形成双螺旋及网络结构时的间距增大，因此，本发明只需在水相中反应，无需添加油相，致孔剂及表面活性剂。
(3)本发明采用喷雾的方式将环状酸酐预交联的琼脂糖溶液雾化，采用乙酸乙酯作为冷却剂。乙酸乙酯是一种常用的冷却剂，它的低粘度及低密度的特性使其具有很高的沉降率，而且乙酸乙酯还具有很高的挥发性和快速干燥性能。当琼脂糖溶液经雾化后进入冷却的乙酸乙酯中时，由于琼脂糖与之不混溶，当温度迅速下降至琼脂糖凝固点时，雾化液滴可迅速凝固成微球，因此，本发明提供的是成球速度快，效率高，洗涤方便的方法。
(4)本发明提供的大孔刚性琼脂糖微球在保证原有琼脂糖凝胶优良性能的基础上，增大了凝胶性能及大孔结构，能够在介质内产生对流，提高介质的通透性，扩大了琼脂糖微球的应用范围。该产品在生物大分子的快速分离以及固定化酶等领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是实施例1的丁二酸交联琼脂糖的微球形态(A)及微球孔径(B)结果图；
图2是实施例2的丁二酸交联琼脂糖的微球形态(A)及微球孔径(B)结果图；
图3是实施例3的戊二酸交联琼脂糖的微球形态(A)及微球孔径(B)结果图；
图4是实施例4的顺丁烯二酸交联琼脂糖的微球形态(A)及微球孔径(B)结果图；
图5是实施例5的反丁烯二酸交联琼脂糖的微球形态(A)及微球孔径(B)结果图；
图6是实施例6的环状酸酐交联琼脂糖微球(8％,w/v)孔径结果图，(A)丁二酸交联琼脂糖；(B)戊二酸交联琼脂糖；(C)顺丁烯二酸交联琼脂糖；
图7是实施例7的丁二酸酐交联琼脂糖微球的排阻极限结果示意图；
图8是对比例1的4％琼脂糖微球形态(A)及孔径(B)结果图；
图9是对比例2的8％琼脂糖微球形态(A)及孔径(B)结果图；
图10是对比例3的不同步骤琼脂糖的凝胶强度比较图；
图11是对比例4的不同步骤琼脂糖的凝胶强度比较图；
图12是对比例5的不同步骤琼脂糖的凝胶强度比较图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在下面的实施例中，如未明确说明，“％”均指重量百分比。
微球粒径、最高流速、耐受压力的测试方法见GBT38170-2019。
微球排阻极限的测试方法如下：
(1)配置缓冲液与标准物质溶液：配置0.01mol/L pH为6.5的Tris-HCl缓冲溶液，抽滤后，备用。再用缓冲液配置浓度1g/L的标准物质溶液。
(2)介质装柱及平衡；将交联琼脂糖微球装于10cm×1.5cm id的层析柱中，将流动相的速度调解为1mL/min，冲洗层析柱至平衡。
(3)进样：分别进样不同分子量：大小的标准物溶液500μL。
(4)洗脱：使用缓冲液，速度依然为1ml/min，得到保留体积Ve。
由于本发明要达到刚性的要求，所以以下实施例的原材料琼脂糖选择了在浓度为1.5wt％时的凝胶强度大于1500g/cm2的琼脂糖。其实不管原材料选择什么指标的琼脂糖，通过本发明的方法，都能达到至少保持或高于原来的刚性(浓度为1.5wt％时的凝胶强度)。
实施例1一种大孔刚性琼脂糖微球的制备
包括以下步骤：
S1、将琼脂糖(浓度为1.5wt％时的凝胶强度为1550g/cm2)分散于100mL去离子水中，配置成质量浓度为4％的琼脂糖悬浮液；
S2、在磁力搅拌下，丁二酸酐用乙醇溶解，将环状酸酐溶液逐滴加入至琼脂糖悬浮液中，在30℃下反应1h，反应期间发生单一酰化反应，反应期间维持反应pH8～8.5，所述琼脂糖与所述丁二酸酐的摩尔比为1:1，其中琼脂糖的摩尔量以二糖单位计，反应结束后调节pH至6.5；
S3、通过加热使琼脂糖悬浮液快速完全溶解，然后快速降温至60℃，继续反应1h，反应期间pH调至8～8.5，发生交联反应；
S4、反应结束后采用高压喷雾装置将琼脂糖溶液雾化，喷雾压力调节至0.1MPa，雾化液滴的接收溶剂为冷却的乙酸乙酯溶液；
S5、对接收溶剂中的样品进行过滤除去乙酸乙酯溶液，得到湿微球，然后采用去离子水进行多次清洗除去微球表面的乙酸乙酯溶液，最终得到所述大孔刚性琼脂糖微球，微球粒径在45～155μm左右，微球的孔径在200nm左右，微球耐受压力达到0.1Mpa，最高流速可达300cm/h，排阻极限200000Da球蛋白。结果如图1所示。
实施例2：
S1、将琼脂糖(浓度为1.5wt％时的凝胶强度为1520g/cm2)分散于100mL去离子水中，配置成质量浓度为6％的琼脂糖悬浮液；
S2、在磁力搅拌下，丁二酸酐用乙醇溶解，将丁二酸酐溶液逐滴加入至琼脂糖悬浮液中，在35℃下反应2h，反应期间维持pH8～8.5，发生单一酰化反应，所述琼脂糖与所述丁二酸酐的摩尔比为1.5:1，其中琼脂糖的摩尔量以二糖单位计，反应结束后调节pH至6.5；
S3、通过加热使琼脂糖悬浮液快速完全溶解，然后快速降温至75℃，继续反应2h，反应期间pH调至8～8.5，发生交联反应；
S4、反应结束后采用高压喷雾装置将琼脂糖溶液雾化，喷雾压力调节至0.3MPa，雾化液滴的接收溶剂为冷却的乙酸乙酯溶液；
S5、对接收溶剂中的样品进行过滤除去乙酸乙酯溶液，得到湿微球，然后采用去离子水进行多次清洗除去微球表面的乙酸乙酯溶液，最终得到所述大孔刚性琼脂糖微球，微球粒径在45～155μm，微球的孔径在200～300nm，微球耐受压力达到0.1Mpa，最高流速可达250cm/h，排阻极限200000Da球蛋白。结果如图2所示。
实施例3大孔刚性琼脂糖微球的制备
包括以下步骤：
S1、将琼脂糖(浓度为1.5wt％时的凝胶强度为1580g/cm2)分散于去离子水中，配置成质量浓度为4％的琼脂糖悬浮液；
S2、在磁力搅拌下，戊二酸酐用乙醇溶解，将环状酸酐溶液逐滴加入至琼脂糖悬浮液中，在38℃下反应2h，反应期间维持pH8～8.5，发生单一酰化反应，所述琼脂糖与所述环状酸酐的摩尔比为1.5:1，其中琼脂糖的摩尔量以二糖单位计，反应结束后调节pH至6.5；
S3、通过加热使琼脂糖悬浮液快速完全溶解，然后快速降温至70℃，继续反应2h，反应期间pH调至8～8.5，发生交联反应；
S4、反应结束后，采用高压喷雾装置将琼脂糖溶液雾化，喷雾压力调节至0.3MPa，雾化液滴的接收溶剂为冷却的乙酸乙酯溶液；
S5、对接收溶剂中的样品进行过滤除去乙酸乙酯溶液，得到湿微球，然后采用去离子水进行多次清洗除去微球表面的乙酸乙酯溶液，最终得到所述大孔刚性琼脂糖微球，微球粒径在45～155μm，微球的孔径在400nm左右，微球耐受压力达到0.1Mpa，最高流速可达200cm/h，排阻极限200000Da球蛋白。结果如图3所示。
实施例4大孔刚性琼脂糖微球的制备
包括以下步骤：
S1、将琼脂糖(浓度为1.5wt％时的凝胶强度为1660g/cm2)分散于去离子水中，配置成质量浓度为4％的琼脂糖悬浮液；
S2、在磁力搅拌下，顺丁烯二酸酐用乙醇溶解，将顺丁烯二酸酐溶液逐滴加入至琼脂糖悬浮液中，在40℃下反应1h，反应期间维持pH8～8.5，发生单一酰化反应，所述琼脂糖与所述马来酸酐的摩尔比为3:1，其中琼脂糖的摩尔量以二糖单位计，反应结束后调节pH至6.5；
S3、通过加热使琼脂糖悬浮液快速完全溶解，然后快速降温至68℃，继续反应1h，反应期间pH调至8～8.5，发生交联反应；
S4、反应结束后，采用高压喷雾装置将琼脂糖溶液雾化，喷雾压力调节至0.3MPa，雾化液滴的接收溶剂为冷却的乙酸乙酯溶液；
S5、对接收溶剂中的样品进行过滤除去乙酸乙酯溶液，得到湿微球，然后采用去离子水进行多次清洗除去微球表面的乙酸乙酯溶液，最终得到所述大孔刚性琼脂糖微球，微球粒径在45～155μm，微球的孔径在500nm左右，微球耐受压力达到0.1Mpa，最高流速可达195cm/h，排阻极限200000Da球蛋白。结果如图4所示。
实施例5大孔刚性琼脂糖微球的制备
包括以下步骤：
S1、将琼脂糖(浓度为1.5wt％时的凝胶强度为1550g/cm2)分散于去离子水中，配置成质量浓度为4％的琼脂糖悬浮液；
S2、在磁力搅拌下，反丁烯二酸酐用乙醇溶解，将反丁烯二酸酐溶液逐滴加入至琼脂糖悬浮液中，在40℃下进行单一酰化反应2h，反应期间维持pH8～8.5，发生单一酰化反应，所述琼脂糖与所述环状酸酐的摩尔比为1.5:1，其中琼脂糖的摩尔量以二糖单位计，反应结束后调节pH至6.5；
S3、在搅拌的条件下，通过加热使琼脂糖悬浮液完全溶解，然后降温至70℃，进行交联反应2h，反应期间pH调至8～8.5，发生交联反应；
S4、反应结束后，采用高压喷雾装置将琼脂糖溶液雾化，喷雾压力调节至0.1MPa，雾化液滴的接收溶剂为冷却的乙酸乙酯溶液；
S5、对接收溶剂中的样品进行过滤除去乙酸乙酯溶液，得到湿微球，然后采用去离子水进行多次清洗除去微球表面的乙酸乙酯溶液，最终得到所述大孔刚性琼脂糖微球，微球粒径在45～155μm，微球的孔径在500nm左右，微球耐受压力达到0.1Mpa，最高流速可达185cm/h，排阻极限200000Da球蛋白。结果如图5所示。
实施例6大孔刚性琼脂糖微球的制备
包括以下步骤：
S1、将琼脂糖(浓度为1.5wt％时的凝胶强度为1580g/cm2)分散于去离子水中，配置成质量浓度为8％的琼脂糖悬浮液；
S2、在磁力搅拌下，丁二酸酐、戊二酸酐、顺丁烯二酸酐分别用乙醇溶解，将环状酸酐溶液逐滴加入至琼脂糖悬浮液中，在40℃下进行单一酰化反应2h，反应期间维持pH8～8.5，发生单一酰化反应，所述琼脂糖与所述环状酸酐的摩尔比为1.5:1，其中琼脂糖的摩尔量以二糖单位计，反应结束后调节pH至6.5；
S3、在搅拌的条件下，通过加热使琼脂糖悬浮液完全溶解，然后降温至75℃，进行交联反应2h，反应期间pH调至8～8.5，发生交联反应；
S4、反应结束后，采用高压喷雾装置将琼脂糖溶液雾化，喷雾压力调节至0.1MPa，雾化液滴的接收溶剂为冷却的乙酸乙酯溶液；
S5、对接收溶剂中的样品进行过滤除去乙酸乙酯溶液，得到湿微球，然后采用去离子水进行多次清洗除去微球表面的乙酸乙酯溶液，最终得到所述大孔刚性琼脂糖微球，微球粒径在45～155μm，微球的孔径在100nm～150nm左右，微球耐受压力达到0.1Mpa，最高流速可达180cm/h，排阻极限200000Da球蛋白。结果如图6所示。
实施例7大孔刚性琼脂糖微球的制备
包括以下步骤：
S1、将琼脂糖(浓度为1.5wt％时的凝胶强度为1620g/cm2)分散于去离子水中，配置成质量浓度为4％的琼脂糖悬浮液；
S2、在磁力搅拌下，丁二酸酐用乙醇溶解，将丁二酸酐溶液逐滴加入至琼脂糖悬浮液中，在40℃下进行单一酰化反应2h，反应期间维持pH8～8.5，发生单一酰化反应，所述琼脂糖与所述丁二酸酐的摩尔比为1.5:1，其中琼脂糖的摩尔量以二糖单位计，反应结束后调节pH至6.5；
S3、在搅拌的条件下，通过加热使琼脂糖悬浮液完全溶解，然后降温至70℃，进行交联反应2h，反应期间pH调至8～8.5，发生交联反应；
S4、反应结束后，采用高压喷雾装置将琼脂糖溶液雾化，喷雾压力调节至0.1MPa，雾化液滴的接收溶剂为冷却的乙酸乙酯溶液；
S5、对接收溶剂中的样品进行过滤除去乙酸乙酯溶液，得到湿微球，然后采用去离子水进行多次清洗除去微球表面的乙酸乙酯溶液，最终得到所述大孔刚性琼脂糖微球，微球粒径在45～155μm，微球的孔径在400～500nm，微球耐受压力达到0.1Mpa，最高流速可达280cm/h，排阻极限200000Da球蛋白。结果如图7所示。
对比例1(没有改性的琼脂糖)一种琼脂糖微球的制备
S1、将琼脂糖(浓度为1.5wt％时的凝胶强度为1520g/cm2)分散于去离子水中，配置成质量浓度为4％的琼脂糖悬浮液；
S3、在搅拌的条件下，采用水浴加热使琼脂糖悬浮液完全溶解，然后降温至60℃；
S4、用高压喷雾装置将琼脂糖溶液雾化，喷雾压力调节至0.1MPa，雾化液滴的接收溶剂为冷却的乙酸乙酯溶液；
S5、对接收溶剂中的样品进行过滤除去乙酸乙酯溶液，得到湿微球，然后采用去离子水进行多次清洗除去微球表面的乙酸乙酯溶液，微球粒径在45～155μm，微球的孔径在50～100nm，微球耐受压力达到0.05Mpa，最高流速可达50cm/h，排阻极限102000Da球蛋白。结果如图8所示，其中(A)为微球形态，(B)为孔径。
对比例2(没有改性的琼脂糖)一种琼脂糖微球的制备
S1、将琼脂糖(浓度为1.5wt％时的凝胶强度为1550g/cm2)分散于去离子水中，配置成质量浓度为8％的琼脂糖悬浮液；
S3、在搅拌的条件下，采用水浴加热使琼脂糖悬浮液完全溶解，然后降温至70℃；
S4、采用高压喷雾装置将琼脂糖溶液雾化，喷雾压力调节至0.4MPa，雾化液滴的接收溶剂为冷却的乙酸乙酯溶液；
S5、采用尼龙网纱对接收溶剂中的样品进行过滤，微球粒径在45～250μm，微球的孔径小于50nm，微球耐受压力达到0.08Mpa，最高流速可达80cm/h，排阻极限102000Da球蛋白，结果如图9所示，其中(A)为微球形态，(B)为孔径。
对比例3琼脂糖微球的制备
包括以下步骤：
S1、将琼脂糖(浓度为1.5wt％时的凝胶强度为1520g/cm2)分散于去离子水中，配置成质量浓度为2％的琼脂糖悬浮液；
S2、在磁力搅拌下，丁二酸酐用乙醇溶解，将丁二酸酐溶液逐滴加入至琼脂糖悬浮液中，在30℃下进行单一酰化反应1.5h，反应期间维持pH8～8.5，发生单一酰化反应，所述琼脂糖与所述丁二酸酐的摩尔比为2:1，其中琼脂糖的摩尔量以二糖单位计，反应结束后调节pH至6.5；
S3、在搅拌的条件下，通过加热使琼脂糖悬浮液完全溶解，然后降温至40℃，进行反应2h，反应期间pH调至8～8.5，发生交联反应；
S4、反应结束后，采用高压喷雾装置将琼脂糖溶液雾化，喷雾压力调节至0.1MPa，雾化液滴的接收溶剂为冷却的乙酸乙酯溶液；
S5、对接收溶剂中的样品进行过滤除去乙酸乙酯溶液，得到湿微球，然后采用去离子水进行多次清洗除去微球表面的乙酸乙酯溶液，最终得到所述大孔刚性琼脂糖微球，微球粒径在10～200μm，微球的孔径在90nm，微球耐受压力达到0.04Mpa，最高流速可达50cm/h，排阻极限60000Da球蛋白。可以看出，S3降温低于60-70℃后，琼脂糖交联程度大大降低，所制备得到的琼脂糖微球的孔径在90nm。
对比例4琼脂糖微球的制备
包括以下步骤：
S1、将琼脂糖(浓度为1.5wt％时的凝胶强度为1520g/cm2)分散于去离子水中，配置成质量浓度为4％的琼脂糖悬浮液；
S2、在磁力搅拌下，丁二酸酐用乙醇溶解，将丁二酸酐溶液逐滴加入至琼脂糖悬浮液中，在50℃下进行单一酰化反应1.5h，反应期间维持pH8～8.5，发生单一酰化反应，所述琼脂糖与所述丁二酸酐的摩尔比为2:1，其中琼脂糖的摩尔量以二糖单位计，反应结束后调节pH至6.5；
S3、在搅拌的条件下，通过加热使琼脂糖悬浮液完全溶解，然后降温至80℃，进行反应2h，反应期间pH调至8～8.5，发生交联反应；
S4、反应结束后，采用高压喷雾装置将琼脂糖溶液雾化，喷雾压力调节至0.1MPa，雾化液滴的接收溶剂为冷却的乙酸乙酯溶液；
S5、对接收溶剂中的样品进行过滤除去乙酸乙酯溶液，得到湿微球，然后采用去离子水进行多次清洗除去微球表面的乙酸乙酯溶液，最终得到琼脂糖微球，微球粒径在45～155μm，微球的孔径在50～100nm，微球耐受压力达到0.05Mpa，最高流速可达55cm/h，排阻极限60000Da球蛋白。可以看出，S2的非均相单一酰化反应反应温度超过30～40℃，S3降温超过60～70℃后，琼脂糖交联程度大大降低，所制备得到的琼脂糖微球的孔径在50～100nm。
对比例5一种琼脂糖微球的制备
包括以下步骤：
S1、将琼脂糖(浓度为1.5wt％时的凝胶强度为1580g/cm2)分散于去离子水中，配置成质量浓度为4％的琼脂糖悬浮液；
S2、在磁力搅拌下，顺丁烯丁二酸酐用乙醇溶解，将顺丁烯二酸酐溶液逐滴加入至琼脂糖悬浮液中，在30℃下进行单一酰化反应2h，反应期间维持pH8～8.5，发生单一酰化反应，所述琼脂糖与所述顺丁烯丁二酸酐的摩尔比为1.5:1，其中琼脂糖的摩尔量以二糖单位计，反应结束后调节pH至6.5；
S3、在搅拌的条件下，采用水浴加热使琼脂糖悬浮液完全溶解，然后降温至60～75℃，进行交联反应2h，反应期间pH调至8～8.5，发生交联反应；
S4、分别取1.5g的S2中制备的单一酰化琼脂糖及S3中制备的交联琼脂糖，均加入100mL去离子水配制成1.5％的琼脂糖悬浮液，加热至琼脂糖完全溶解后到入平板中，在室温下放置24h使其完全凝固，测定其凝胶强度。结果如图10所示，其中琼脂糖的凝胶强度为1500g/cm2,在S2中30℃下进行单一酰化反应2h后凝胶强度下降至1200g/cm2(见图中的30℃)，经过S3在60～75℃，进行交联反应2h后凝胶强度逐步提高，在70℃时凝胶强度达到1570g/cm2(依次见图中的60℃，65℃，70℃，75℃)，即交联后能够保证原有琼脂糖凝胶的优良性能。
对比例6一种琼脂糖微球的制备
包括以下步骤：
S1、将琼脂糖(浓度为1.5wt％时的凝胶强度为1550g/cm2)分散于去离子水中，配置成质量浓度为4％的琼脂糖悬浮液；
S2、在磁力搅拌下，丁二酸酐用乙醇溶解，将丁二酸酐溶液逐滴加入至琼脂糖悬浮液中，在30℃下进行单一酰化反应1h，反应期间维持pH8～8.5，发生单一酰化反应，所述琼脂糖与所述丁二酸酐的摩尔比为3:1，其中琼脂糖的摩尔量以二糖单位计，反应结束后调节pH至6.5；
S3、在搅拌的条件下，采用水浴加热使琼脂糖悬浮液完全溶解，然后分别降温至60～75℃，进行交联反应1h，反应期间pH调至8～8.5，发生交联反应；
S4、分别取1.5g的S2中制备的单一酰化琼脂糖及S3中制备的交联琼脂糖，均加入100mL去离子水配制成1.5％的琼脂糖悬浮液，加热至琼脂糖完全溶解后到入平板中，在室温下放置24h使其完全凝固，测定其凝胶强度。结果如图11所示，其中琼脂糖的凝胶强度为1500g/cm2,在S2中30℃下进行单一酰化反应2h后凝胶强度下降至1300g/cm2(见图中的30℃)，经过S3在60～75℃，进行交联反应2h后凝胶强度逐步提高，在70℃时凝胶强度达到1587g/cm2(依次见图中的60℃，65℃，70℃，75℃)，即交联后能够保证原有琼脂糖凝胶的优良性能。
对比例7一种琼脂糖微球的制备
包括以下步骤：
S1、将琼脂糖(浓度为1.5wt％时的凝胶强度为1520g/cm2)分散于去离子水中，配置成质量浓度为4％的琼脂糖悬浮液；
S2、在磁力搅拌下，戊二酸酐用乙醇溶解，将戊二酸酐溶液逐滴加入至琼脂糖悬浮液中，在38℃下进行单一酰化反应1.5h，反应期间维持pH8～8.5，发生单一酰化反应，所述琼脂糖与所述戊二酸酐的摩尔比为1.5:1，其中琼脂糖的摩尔量以二糖单位计，反应结束后调节pH至6.5；
S3、在搅拌的条件下，采用水浴加热使琼脂糖悬浮液完全溶解，然后分别降温至60～75℃，进行交联反应1h，反应期间pH调至8～8.5，发生交联反应；
S4、分别取1.5g的S2中制备的单一酰化琼脂糖及S3中制备的交联琼脂糖，均加入100mL去离子水配制成1.5％的琼脂糖悬浮液，加热至琼脂糖完全溶解后到入平板中，在室温下放置24h使其完全凝固，测定其凝胶强度。结果如图12所示，其中琼脂糖的凝胶强度为1500g/cm2,在S2中30℃下进行单一酰化反应2h后凝胶强度下降至900g/cm2(见图中的30℃)，经过S3在60～75℃，进行交联反应2h后凝胶强度逐步提高，在70℃时凝胶强度达到1549g/cm2(依次见图中的60℃，65℃，70℃，75℃)，即交联后能够保证原有琼脂糖凝胶的优良性能。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种大孔刚性琼脂糖凝胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将琼脂糖分散于去离子水中，配置成第一琼脂糖悬浮液；
S2、在搅拌条件下，环状酸酐用乙醇溶解成环状酸酐溶液，将环状酸酐溶液逐滴加入至上述第一琼脂糖悬浮液中进行反应得到第二琼脂糖悬浮液，反应期间维持pH8～8.5，反应结束后调节pH至6.5；
S3、通过加热使第二琼脂糖悬浮液快速完全溶解，然后快速降温进行二次反应，反应期间pH调至7～9；
S4、反应结束后，采用高压喷雾装置将琼脂糖溶液雾化，雾化液滴的接收溶剂为冷却的乙酸乙酯溶液；
S5、采用离心或过滤除去乙酸乙酯溶液，通过洗涤除去琼脂糖微球表面的有机溶剂，最终得到大孔刚性琼脂糖微球。
2.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述S1步骤中，琼脂糖悬浮液的质量浓度为4％～8％。
3.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述S1步骤中，所述琼脂糖在浓度为1.5wt％时的凝胶强度大于1500g/cm2。
4.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述S2步骤中，所述环状酸酐选自顺丁烯二酸酐、反丁烯二酸酐、丁二酸酐及戊二酸酐中的至少一种；
任选的，所述第一琼脂糖悬浮液中的琼脂糖与环状酸酐的摩尔比为1:1～4:1，琼脂糖以二糖单位计。
5.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述S2步骤中，所述反应为非均相单一酰化反应，反应温度为30～40℃，反应时间为1～2h；
任选的，所述反应为非均相单一酰化反应，所得琼脂糖在浓度为1.5wt％时的的凝胶强度为900～1300g/cm2。
6.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述S3步骤中，所述二次反应为均相交联反应，反应温度为60～75℃，反应时间为1～2h，反应pH维持8～8.5。
7.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述S3步骤中，所述反应为交联反应，所得琼脂糖在浓度为1.5wt％时的的凝胶强度大于1500g/cm2。
8.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述S4步骤中，采用高压喷雾装置将琼脂糖溶液雾化步骤中，所述喷雾压力为0.1～0.4MPa。
9.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述S5步骤中，所述的大孔刚性琼脂糖微球的粒径为45～155μm，孔径在100～500nm，耐受压力达到0.1Mpa，最高流速可达180cm/h～300cm/h，排阻极限为200000Da球蛋白。
10.一种大孔刚性琼脂糖凝胶微球，其特征在于：其由权利要求1～9任意一项所述制备方法制得。
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2022
- 2022-10-09 CN CN202211226258.4A patent/CN115612185A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (5)
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