DE2212215A1

DE2212215A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Zählen von Bakterienkolonien

Info

Publication number: DE2212215A1
Application number: DE19722212215
Authority: DE
Inventors: PaIo Alto Calif. Sweet Richard Gordon (V.StA.)
Original assignee: Varian Associates Inc
Current assignee: Varian Medical Systems Inc
Priority date: 1971-03-22
Filing date: 1972-03-14
Publication date: 1972-10-05
Also published as: FR2130532A1; US3736432A; FR2130532B1; GB1361567A; CA942094A

Description

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dii.n Detektoren an den b©Id©n Eades. der Re .ibt w©rd@i3. iiiffl Sehutzdetektoren zu bilden, s© daß Kolonien geß&u werden und Kolonien, die benachbart© Abfrage-Wege tibsrlappea, nur einmal gezählt werden.

, Technik

18s sind bereits Zählmaschinen für Bakterienkolonien vorgeschlagen worden, bei denen Licht von einer lokalisierten Quelle durch eine Kultur geschickt wird, auf deren Oberseite eine Anzahl Bakterienkolonien gebildet ist. Die Bakterienkolonien dienen als Linsen &ur Fokussierung von Bildern der lokalisierten Quelle in ein Bildmuster in einer Ebene oberhalb der Oberfläche der Kultur* Bine Projektionslinse wurde dazu verwendet, das Bildmuster der Bakterienkolonien zu vergrößern und in einer zweiten Bildebene zu fokussieren» in der eine Reihe von Fotodetektoren angeordnet war. Eine Relativbewegung wurde dann zwischen der Kultur uad dem optischen System herbeigeführt, um das Muster aus Licht-Bildern mit der Fotodetektorenreihe abzufragen* Ein Impulsausgang, der von jedem Fotodetektor erhalten wird, der ein Licht-Bild antrifft, wurde mit einer Möhster-Kaohbar-Sperr-Sonaltung verarbeitet, so daß der Ausgangsimpuls von dem Detektor, der das Bild zuerst antraf, gewählt wurde und außerdem die Zählung 'ran Impulsmusgllng©n der näcästta Naenfrarn blc-ck;isri;e? so »IkS jadts Bild mir ei.xao.al gewählt wurde= Di© Reih® aus F^todetektorea arstreskts ai-sli quer über die ganze radiale Augäebx^uß des BiM-Esters, so daS nur ein kreisförmiger Abfrageweg oder .-,aufweg über a&s Bildimister dazu verwendet wurde, e±B.e SSh-'iung der

zu eriialten (US-Patentschrift 3 ^ιΘ3 '/72).

Bei dieser fcesaaaten BaktsriensghXung wird eins relativ

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benötigt 9 vm ©ines. Radius tösj. d@n Radius

τ zu

Is ist deshalb erwünscht, ein Ver£ahr©3& vmä ©in© Zählen von Bakterienkolonien in ©in©r Eultur 2» erhalten, bei der die Anzahl der Fotodetektoren und der zugehörigen herabgesetzt ist.

Aufgabe d@r Erfindung ist es also» ein ·φ zum Zählen von Bakterienkolonien und eis© dasu ge richtung verfügbar zu machen»

Gemäß einem Merkmal der Erfindung werden dl@ Kolonien mitttels einer ReiJie von Fotodetektoren gezählt ₉ die B&@fcmals üb©r das Lieirfemsster ggführt werden, das von dea Bakteri©nkol@ni©ja fekussiert wird» so daß eine Vielzahl von ne"b©nelnand©rli®genfen Abtast-Laufwegen erhalten wird. Die Detektorreihe weist an federn Ende einen Detektor auf, der für Kolonien empfindlich ist* die gerade außerhalb des abgetasteten oder abgefragten Streifens liegen. Die Ausgänge dieser Enddetektoren werden nicht in die Zählsumme eingeschlossen, sondern werden dazu verwendet_P die Zählungen benachbarter Detektoren zu sperren _s so daß ^ ede Kolonie mir einmal gezählt wird und Kolonien, die in Positionen liegen, die benachbarte Laufwege Überlappen, nur ©inmal gesähB werden.

Gemäß einer speziellen Ausbildung der Erfindung wird die Fotodetekter-Reihein einander überlappenden Spiralwegen über das

gsführt_p das von den su wählenden Kolonien

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fokussiert wird, so daß kreisförmige Schüsseln mit Kulturen leicht und schnell dadurch abgetastet werden können, daß die Kultur um ihren geometrischen Mittelpunkt rotiert wird.

Gemäß einer speziellen Ausbildung der Erfindung weist die Zählvorrichtung für die Bakterienkolonie eine Einrichtung auf, mit der die Kultur um ihren geometrischen Mittelpunkt gedreht werden kann sowie eine Einrichtung, mit der die Fotodetektorreihe mittels eines schwenkbaren Anas zur Drehachse bzw. von dieser weg verschoben werden kann, wobei dieser schwenkbare Arm um eine zweite Drehachse schwenkbar ist, die parallel zur Drehachse der Kultur liegt, gegen diese aber versetzt ist, so daß die Fotodetektorreihe relativ zur Kultur einen spiralförmigen Abtast-Lauf weg durchlauft.

Die Erfindung soll anhand der Zeichnung näher erläutert werden; es zeigen:

Fig. 1 schematisch, teilweise in Form eines Blockschaltbildes, eine erfindungsgemäße Vorrichtung zum Zählen von Bakterienkolonien;

Fig. 2 eine schematische Aufsicht auf die Vorrichtung nach Fig. 1;

Fig. 3 schematisch einander überlappende Abtast-Lauf we ge über dem Koloniebild-Muster zur Veranschaulichung der Funktion von Fotodetektoren zur Feststellung einer Kolonie, die zwei benachbarte Abtastwege überlappt;

Fig. 4 ein Schaltbild der Detektor- und Logik-Schaltung für einen aktiven Kanal der Fotodetektorreihej \mä

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Fig« 5 ©cfoes&atiseh die Impuls~Summier~ imd ZSU-Scbaltung, mit der die Ausgänge der ©inselnen Detektor» und. Logik-Kanäle gezahlt werd®n_o

Die in Fig« 1 und 2 dargestellte Zählvorrichtung 1 für Bakterien« kolonien nach der Erfindung weist eine kreisförmige Drehstuf@ 2, beispielsweise aus Aluminium, mit einer Mittelöffnung 3 auf» An der Lippe der Hittelöffnung 3 ist eine Schulter 4 sur Aufnahme des Außenumfangs einer Petrischale 5 vorgesehen„ die ein trans» parentes Bakterienkultur-Medium 6, beispielsweise Agar, enthält. Die Petri»Schale 5 ist ebenfalls transparent« Drei Schalenhalter 7 sind in Abständen von 120° um die Schulter 4 herum angeordnet ₉ um die Petrischale zu ergreifen und in der rotierenden Stufe 2 zu halten.

Um den Umfang der rotierenden Stufe 2 sind in Abständen von etwa 120° drei Räder angeordnet. Zwei dieser Räder δ und 9 laufen frei, während das dritte Rad 11 ein Antriebsrad ist, mit der die rotierende Stufe 2 kraftschlüssig angetrieben wird. Ein Motor 12 ist mit diesem Antriebsrad 11 gekuppelt, um dieses anzutreiben und ein Torgelege 13 ist mit dem anderen Ende des Motors gekuppelt, um eine Abtast-Steuerscheibe 14 anzutreiben, die mit der Ausgangswelle des Vorgeleges 13 gekuppelt ist»

Ein optisches System 15 wird von einem schwenkbaren Träger 16 gehaltert. Der schwenkbare Träger 16 wird von einem Nookenfolger angetrieben, der auf der Kurvenscheibe 14 reitet. Der schwenkbare Träger 16 ist um eine Achse 18 schwenkbar, die parallel zur Drehachse der Petri-Schale 5 liegt und von dieser einen merklichen Abstand hat, so daß das optische System 15 etwa längs eines Radius von der Drehachse 19 der Petri-Schale 5 geführt wird.

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Das optische System 15 weist eine Lichtquelle 21, beispielsweise einen Glühdraht 22 relativ kleiner Größe, beispielsweise 2,0 χ 1,5 mm auf, um eine lokalisierte Lichtquelle zu bilden. Das von der Lichtquelle 21 emittierte Licht wird von einem Kondensor 23 aufgenommen und in einen parallelen Strahl 'angewandelt, der durch die transparente Petri-Schale 5» das Bakterienkultur-Medium 6 und Bakterienkolonien 24 gerichtet wird, die auf der Oberseite des Kulturmediums 6 liegen. Die Bakterienkolonien 24 haben allgemein eine Form, die einer Kugelform angenähert ist, so daß sphärische Linsen gebildet werden, die Bilder des Drahtes 22. in einer primären Bildebene einige Millimeter oberhalb der Oberfläche des Mediums 6 fokussieren. Die Größe dieser Quellenbilder 1st etwa gleich der Quellengröße multipliziert mit dem Verhältnis der Brennweite der Kolonie-Linsen f<j (typischerweise 3 bis 15 mm) zur Brennweite des Kondensors 23» f₂· ^{Da das} Licht vom Kondensor 23 parallel ist, ist der laterale Abstand zwischen von verschiedenen Kolonien gebildeten Bildern der gleiche wie der Abstand zwischen den tatsächlichen Kolonien, unabhängig von der Brennweite. In einer gleichförmigen Bakterienschicht können zerstörte Bakterien konkave Krater in der Form von negativen sphärischen Linsen bilden, die Bilder des Glühdrahtes in eine imaginäre Ebene unterhalb der Oberfläche des Mediums fokussieren.

Eine Projektionsoptik 26, beispielsweise ein Fünffach-Mikroskop-Objektiv (nominal 5x microscopic objective lens) 1st über der primären Bildebene angeordnet, um ein vergrößertes Bild des primären Musters aus von Kolonien gebildeten Bildern in einer Projektions-Bildebene 27 in einem Abstand von beispielsweise 30 cm von der primären Bildebene 25 zu fokussleren. Die tat-

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sächliche Vergrößerung ist etwa 7-fach und kaxm dadurch geändert werden, daß die Projektionsdistanz von 30 cm geändert wird. Bei der nicht dargestellten praktischen Ausführungsforai der Erfindimg wird der 30 cm große Lichtweg mit einem nicht dargestellten Spiegel gefaltet, um die Höhe der zweiten Bildebene 27 über den Primärbildern herabzusetzen·

Eine lineare Reihe von 12 Lichtdetektoren 28, beispielsweise Fototransistoren, die von der Firma Fairchild unter der Bezeichnung Fotodetektor FFM 100 geliefert werden, sind in Mittenabständen von 2,0 mm angeordnet und in der Ebene 27 des produzierten Bildes montiert. Wenn die Stufe 2 rotiert, kreuzen vois dem Kolonien 24 geformte Bilder die Reihe 28 in Richtimg senkrecht zu Seren Längsabmessung. Die Fotodetektorreihe 28 weist zwei SchutzcL@t@k» toren auf, d.h. Detektoren an den beiden Enden der Reihe bilden Schutzdetektoren, und ihre Impulsausgänge werden nicht gezählt. Die in der Mitte liegenden Detektoren 1 bis η (η - 10) sind für Kolonien in einem Segment des Radius der Petri-Sehale empfindlich, daß beispielsweise 0,29 cm lang 1st. Die zehn mittleren Detektoren, die 2,0 cm überspannen, sind damit für Kolonien empfindlich, die einem 0,29 cm breiten Streifen der Agar-Oberfläche liegen. Wenn die Petri-Schale 5 rotiert wird, wird die Reihe 28 gleichzeitig mittels des schwenkbaren Trägers 16 längs des radialen Weges 31 bewegt, d.h. radial relativ zur Drehachse der Petri-Schale 5, so daß ein spiralenföimiger Streifenvon 0,29 cm Breite als Abtastweg entsteht, der die gesamte Oberfläche der Petrischale 5 bedeckt.

In einer typischen Petrischale 5 mit einem Radius von 4,5 cm erfordert eine Abtastung etwa 15 Umdrehungen der Schale 5, um eine spiralenf örmige Abtastung der ganzen Petrischale zu erhalten. Durch die Verwendung von 15 Umdrehungen zur Vervollständigung der

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Abtastung wird jedoch die benötigte Ansahl von Detektoren trad Detektorsohaltimgen auf ein Fünfzehßtel (plus zwei Schutedetektoren) der Anzahl der bekannten Vorrichtung (US-Patent«· schrift 3 493 772) herabgesetzte

Die Fotodetektoren der Reihe 28 sind so angeordnet, daß? wenn ein Detektor eine höhere Lichtstärke im Bildmuster feststellt, und diese Lichtintensität über einen bestimmten Schwellwert ansteigt, was durch eine Schwellwerteinstellung in der Detektorelektronik eingestellt wird, der Detektor einen Ausgangs impuls abgibt. Dieser Impuls wird über eine Signal-Detektor-und Logikschaltung 33 geführt und dann zu einem Zähler 34 zvm Auf summier en c Die Signal- und Detektor-Logik-Schaltung 33 ist so «angeordnet,, daß ein Impulsausgang von einem ersten Detektor das Zählen von Ausgangsimpulsen sperrt, die von unmittelbar benachbarten Detektoren abgeleitet werden, so daß jedes Koloniebild nur ein einziges Mal gezählt wird·

Der schwenkbare Träger 16 und die Kurvenscheibe 14 sind so dimensioniert, daß benachbarte Abtast-Lauf wege der Fotodetektor-Anordnung 28 einander um die Breite eines Abtast-Laufweg-Teils überlappen, der von zwei benachbarten Fotodetektoren gebildet wird (vgl. Fig. 3). Diese Überlappung von aufeinanderfolgenden Abtest-Laufwegen verhindert eine Doppeltzählung eines von einer Kolonie fokussierten Bildes, das auf der Grenze von zwei Abtast-Laufwegen liegt. Genauergesagt, wenn der untere Schutzdetektor G der Reihe 28 auf dem ersten Laufweg erstmalig das Koloniebild gemäß Fig. 3 antrifft, emittiert dieser untere Schutzdetektor einen Ausgangsimpuls, der die Zählung eines Impulsausgangs vom η-ten Detektor sperrte Da der Ausgang des Schutzdetektors G

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nicht gezählt wird, wird beim ersten Abtast-Laufweg, bei dem dieses Bild angetroffen wird, keine Zählung für das Koloniebild 35 aufgenommen. Beim zweiten Abtast-Lauf weg, der den ersten Laufweg um die Breite des Schutzdetektors und eines zusätzlichen De« tektors überlappt, liefert der erste Detektor, der das Kolöniebild 35 antrifft, etwa Detektor 1 oder 2, einen Ausgangsimpuls ₉ der gezählt wird und ferner die Zählung von Ausgangsimpulsen von den benachbarten Kanälen sperrt. Das Kolöniebild 35 wird also nur einmal gezählt.

In Fig, 4 ist die Signal-Detektor- und Logik-Schaltung 36 für einen der 1 bis η aktiven Detektoren der Reihe 28 dargestellt. Die Schutzkanäle sind ähnlich aufgebaut, nur daß die Impulsausgänge von den Schutzkanälen nicht zur Summierschaltung zum Zählen zugeführt sind. Gemäß Fig. 4 fällt Licht von einem durch eine Kolonie fokussieren Bild auf den Eingang eines Fotodetektors 37, so daß ein elektrisches Ausgangssignal entsteht, das einem Eingang eines Operationsverstärkers 38 zugeführt wird. Der Operationsverstärker weist einen Rückkopplungskanal 39 und eise Schwellwert-Einstellschaltung 41 auf, mit der ein Bezugspotential an den Eingang des Operationsverstärkers 38 gelegt wird, um mit dem Eingangssignal verglichen zu werden, das vom Ausgang des Fotodetektors 37 abgeleitet wird« Der Operationsverstärker wird nicht getriggertj, bis der Eingang vom Fotodetektor 37 @ia@n gewissen Schwellwert erreicht, der durch die Sehwellwert-EinsteXlschaltung festgelegt ist»

Wenn das Eingangssignal vom Fotodetektor den Schwellwert überschreitet, liefert der Operationsverstärker einen Ausgangsimpuls und ist deshalb so geschaltet, daß er wie ein Sehmitt-Trigger

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arbeitet, der durch die unterbrochene Linie 42 angedeutet ist«. Der Ausgang des Schmitt-Triggerε 42 ist ©in positiv gehender Spannungsimpuls von beispielsweise 4-5 V, dessen Dauer etwa gleich der erwarteten Dauer (Breite) der zu zählenden Koloniebilder- ist₅, beispielsweise 500 Mikrosekunden. Dieser Ausgangsimpuls wird durch den Spannungsverlauf (a) angedeutet.

Ein Ausgangsimpuls dieses Schmitt-Triggers 42 wird einem Inverter 43 zur Inversion zugeführt. Der Ausgang des Inverters wird einer Anzeigelampe 44 zugeführt, um den Betriebszustand des Schmitt-Triggers darzustellen. Einweiterer Ausgang des Schmitt-Triggers 42 wird einem zweiten Inverter 45 zugeführt ₉ um einen Ausgangsimpuls zu erhalten, dessen Spannungsverlauf bei (b) dargestellt ist» Diese invertierten Ausgangsimpulse werden Gattern in benachbarten Logikkanälen zugeführt, um die Zählung von Impulsen von benachbarten Kanälen zu sperren.

Der invertierte Ausgang des Schmitt-Triggers 42 wird ferner einer Differenzierstufe 46 zugeführt, mit der zu Beginn des Schmitt-Trigger- Impulses eine negative Spitze und am Ende des Triggerimpulses eine positiv© Spitze erzeugt wird, wie das bei (c) angedeutet ist» Der Ausgang der Differenzierstufe 46 wird einem dritten Inverter 47 zugeführt, um einen wvm Spannungsverlauf (c) invertierten Spannußgsverlauf zu erhalten* Die erste Spitze läuft durch ein Gatter 48 zu einer Summierschaltung 49* sofern keine Sperr-Eingangssignale von benachbarten Kanülen am Gatter 48 liegen*

In Fig. 5 ist die impuls-Summations-und Zählasaalbung 49 dargestell*. Die Ausgänge aller Gatter 48 entsprechend den

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Claims

su sohlenden Kanälen sind über Gatter 52, w&ä Dic»ä@n 53 samen Leitung 51 g@gattert_o Einzelne Impuls© ₉ <di© der g®fflaissam®n Leitimg 51 zugeführt werden» haben, ©ine Amplitude -won etwa 5 V mid eine Impulsbreite von etwa 5 MikrOsekund@n_e lin ©Isktronisclier Zähler 54 ist mit dem Ausgang der gemeinsamen Leitimg 51 verbuMen, um die Impulse zu zählen * a© daß eine Zählung der Bakterienkolonien entsteht»

Im Betrieb wird zunächst eine Petrischale 5 mit den Bakterienkolonien oder Bakterien-Kratern _t die von zerstörten Bakterien gebildet werden, auf die drehbare Stufe 2 gebracht» Die Abtastung beginnt an einem Punkt außerhalb der Kant® der Petrischale 5* Die Lippe 3 der rotierenden Stufe 2 blockiert den Llehtdurchgang, bis die Achse des optischen Systems sich gerade innerhalb der Kante der Schale 5 befindet, s© daS vom Rand der Schale 5 kein Licht gebrochen wird. Wenn die optische Achse die Mitte der Stufe überkreuzt, wird ein Schnappschalter betätigt, der durch eine unterbrochene Linie 55 angedeutet ist, der ein weiteres Zählen im Zähler 54 unterbricht. Nach der Uberkreuzung der Mitte führt die Kurvenscheibe 14 das optische System sim Startpunkt zurück, wobei sich die optische Achs® gerade außerhalb der Kante der Schale 5 befindet. Der Zähler 54 wird auf 0 zurückgestellt und mit einem manuellen Schalter neu gestartet ₉ ehe die Abtastung einer neuen Schale 5 beginnt.

Die Abtastrate ist durch Veränderung der Drehzahl des Motors einstellbar. Eine zuverlässige Zählung wird mit Stufendrehzahlen bis zu 90 ü/min (1,5 U/sec) erhalten. Die entsprechende gesamte Abtastzeit beträgt etwa 10 see.

Is sind zwei Einstellmöglichkeiten für die Bedienung vorgesehen»

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