DE2205986C3 - Preßpapier-Testblättchen für mikrobiologische Untersuchungen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Preßpapier-Testbiättchen für mikrobiologische Untersuchungen, d. h. z. B. zur Prüfung der Wirksamkeit von Antibiotika und Chemotherapeutika gegenüber bakteriellen Erregern sowie für die Sensibilitätsbestimmung mikrobieller Erreger.

Für die Bakteriologie und auch für die Klinik ist die Keimidentifikation sowie die Bewertung der Resistenzbestimmung gegen Antibiotika und Chemotherapeutika unentbehrlich Die Feststellung der Erreger und die Bestimmung ihres Verhaltens gegen Antibiotika und Chemotherapeutika in vitro ermöglicht ec dem Fachmann, wie beispielsweise dem Mediziner, dem Bakteriologen, dem Pharmazeuten, dem Biochemiker, die geeigneten Mittel anzuwenden bzw. zu entwickeln. Darüber hinaus kann ein neuer Erreger durch sein Verhalten gegenüber einer Reihe von bekannten und genau dosierten Antibiotika und Chemotherapeutika, die bereits gegenüber anderen Erregern bestimmt worden sind, charakterisiert und seine Resistenz bestimmt werden. Auch ein neues Antibiotikum oder Chemotherapeutikum kann auf Grund einer solchen Prüfung in seiner Wirksamkeit gegenüber bekannten Erregern bzw. im Vergleich zu bekannten Antibiotika und Chemotherapeutika definiert werden. Ebenso kanu dann auch eine Substanz qualitativ und gegebenenfalls auch quantitativ auf ihre eventuelle antibiotische or¹ .r chemotherapeutische Wirksamkeit untersucht werden.

Als Testverfahren wird der Diffusionstest seit vielen iJahren angewandt. In einem der üblichen Nährmedien, in denen Mikroorganismen angezüchtet werden, z. B. Pepton-Bouillon-Agar, wird ein Antibiotikum bzw. ein Chemotherapeutikum deponiert, welches dann vom Depot her in dem beimpften Nährboden diffundiert. In dem Bereich, in dem das Antibiotikum durch die Diffusion eine genügende Konzentration erreicht, findet eine Hemmung der Keime statt; in diesem Bereich wird dann kein Wachstum der Keime sichtbar. Die Hemmung wird also als kreisähnliche Fläche auf dem Nährboden sichtbar. Diese Fläche wird Hemmhof genannt. Ihr Durchmesser kann auch als ein Maß für die Wirksamkeit des Wirkstoffes gegenüber dem Erreger gewertet werden. Dadurch kann man eine genaue Bestimmung der Antibiotika-Konzentration und umgekehrt der Sensibilität der Keime erreichen. »S

Wie schon der Name Diffusionstest sagt, kommt es entscheidend auf die Diffusion an. Hierbei hängt die Diffusion von der Art des Nährbodens, von der Diffusionskonstante der jeweiligen Substanz und von der Art der angewandten Technik ab. Die Auftragune des Antibiotikums oder des Chemotherapeutik wird nach folgenden Techniken durchgeführt: Wi kstoff oder Wirkstofflösung in gestanzte Löcher, a .gespatelte Substanzpulver, mit einem mit einer Wirkstoff lösung gefüllten aufgelegten gläsernen Zylinder, als Tablette, als dünne Stäbchen odre mit runden Filte; papierscheibchen verschiedenen Durchmes-T«.. als Träger oder auch als Mehrfachträger (Sternform der runde Scheiben, seitlich an einem Papiergestell angebracht). Am häufigsten und fast ausschließlich werden die genannten Fiiterpapierscheiben verwendet.

Die vorgenannten Verfahren haben jeweils Nachteile. Zum Beispiel werden die Tabletten in der Diffusion von den Hilfsst of fen beeinflußt; man benötigt Füllmittel, Bindemittel, Adsorptionsmittel, Feuchthaltungsmittei und Sprengmitiel für die Anwendung. Außerdem bewirken diese Hilfsmittel je nach Wirkstoff eine Beeinflussung seiner Wirksamkeit. Dasselbe gilt auch für Stäbchen.

Bezüglich der Filter-Papierblättchen ergeben sich auch viele Nachteile und verschiedene Schwierigkeiten. Erstens ist die Herstellung der Filter-Papierblättchen aufwendig. Die Testsubstanzen müssen vor dem Auftragen auf gesondert hergestellten standardisierten Filterblättchen aufgelöst werden.

Besondere Schwierigkeiten entstehen zweitens, wenn für die Testsubstanzen keine geeigneten Lösungsmittel verfügbar sind. Bei bestimmten schwer löslichen oder in Lösung instabilen Verbindungen ist dann eine Herstellung von Testblättchen nicht möglich. Bei der üblichen Herstellung der Testblättchen werden die Lösungen der Substanzen exakt dosiert auf die Filterblättchen gegeben. Anschließend muß das Lösungsmittel wieder vertrieben werden. Erst dann können die getrockneten Blättchen in besonderer, speziell für Testblättchen erarbeiteter Weise, konfektioniert werden. Da zahlreiche der in Frage kommenden Verbindungen, insbesondere da sie auf der großen, luftzugänglichen Oberfläche der Faser fixiert sind, einer schnellen Oxidation unterliegen und feuchtigkeitsempfindlich sind, werden die Testblättchen üblicherweise in Vakuumverpackung zusammen mit Trocknungsmitteln gelagert. Außerdem ist während des gesamten Herstellungsweges aseptisch zu arbeiten. Die Herstellung solcher Testblättchen ist also sehr aufwendig, bsi schwerlöslichen Substanzen schwierig oder überhaupt unmöglich, und die Haltbarkeit ist häufig sehr begrenzt.

Die anderen genannten Methoden sind bekannterweise so unpraktisch, kompliziert oder ungenau, daß sie normalerweise nicht verwendet werden können.

Daher besteht also eine Notwendigkeit, die mit den bekannten Testblättchen verbundenen Schwierigkeiten und Nachteile zu beheben, stabile, besser zu handhabende Prüfmittel für den Test zu haben, und somit ein Testmittel zu schaffen, dessen Herstellung einfacher erfolgen kann, auch bei schwer löslichen Substanzen anwendbar ist und das vor allem auch eine ausreichende Haltbarkeit und genaue Dosierung bei einfacher Konfektionierung gewährleistet. Diese Aufgabe und ihre Lösung l'sgt der Erfindung zugrunde.

Gegenstand der Erfindung sind die im Patentanspruch genannten Preßpapier-Testblättchen.

Deispicic tin Antiuioi;kö «nd: Bcc.trscin, Chloramphenicol, Penicillin, Streptomycin, Tetracyclin. Für Chemotherapeutika können folgende Beispiele genannt werden: Sulfonamide, wie 3,4-Dimethyl-5-sulfaniI-lMiirofurantoin. a-Amino-fl-fiN-ben-

zyi!rnocarbam<
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stoffe entsprechend der Zahl oder der Art zur Unter- Auf gleiche Weise wie in den Beispielen beschrieben,

scheidung zuzusetzen. können Preßpapier-Testblättchen auch mit anderen

Die Preßpapier-Testblättchen gemäß der Erfindung Antibiotika oder Chemotherapeutika als diesen herhaben gegenüber den vorstehend genannten Filter- gestellt werden.

Papierbläitchen und anderen Techniken viele Vorteile. 5 .,·,,.,., ^ .._F, · · ,,

Ein außerordentlicher Vorteil ist die Genauigkeit der Mikrofrologisches Prufbe.spiel 1

Dosierung von Antibiotika oder Chemotherapeutika Geprüft wurden die Preßpapier-Testblättchen oben

im Preßpapier-Testblättchen; die Herstellung ist ein- genannter Antibiotika und Chemotherapeutika. Als

fächer und damit billiger. Weiterhin sind die erfin- Testkeim diente Staphylokokkus aureus SH 511. Die

dungsgemäß hergestellten Preßpapier-Testblättchen i° Prüfung erfolgte auf Antibiotika-Sulfonamid-Agar-

weit weniger empfindlich gegen Feuchtigkeit, denn im Testmedium folgender Zusammensetzung:

letzten Arbeitsgang wird das Preßpapier-Testblättchen _g/l

zusammengedrückt und verfügt damit nicht über die Proteose-Pepton IG 0

großen Poren, die im üblichen Papier vorhanden sind Fleischextrakt 100

und zusätzlich durch das Aufweichen beim Tränk- 15 D ί+1-Glucose 2*0

prozeß vergrößert werden. Die Antibiotika und Chemo- Natriumchlorid 10

therapeutika werden durch Luft schnell oxidiert. Sauer- Adenin ' 001

stoff und Feuchtigkeit können daher nicht den Einfluß Guanin 001

wie bei einfachen Papierblättchen haben. Uracil 0Ό1

Bei der Anwendung der Preßpapier-Testblättchen *° Xanthin 001

auf festem Nährboden zeigen sich überraschender- Agar-Agar 120

weise verschiedeßf weitere Vorteile. Die Preßpapier-Testblättchen lassen sich, da maschinen-griffiger, ver- pH des gebrauchsfertigen Nährbodens bei 37⁰C: packungsinäßig leichter konfektionieren. Sie können 7,2 bis 7,6.

später leicht den Vorratsgefäßen entnommen und auf »5 _Der verflüssigte Nährboden wurde bei 45° C mit

die Nährböden gelegt werden Für bestimmte Zwecke _{einer Sl!spen},j_on des Bakterienstammes Staphylokok-

köflnen die rehuv harten Preßpapier-Testblättchen _{kus aureus SG 5n} ^ _ft (4 - 104 Keime/ml Agar)

senkrecht in den festen Nährboden gesteckt oder in _{und in bekar nter W},_{ise in} Petrischalen mit 9 cm Durch-

diesen eingeschoben oder eingedruckt werden. Nach _messer ausgegossen

dem Feuchtwerden auf der Nährboden-Oberfläche 3° _{Im Tesf}/_{wurden dann jewei]s} 3 _bzw. 4 _Preßpapier-

werden die Preßpapier-Testblättchen durch Mikro- _{Testblättchen auf den} Agar gelegt. Hierbei müssen die

Sprengungen porös und geben so besonders leicht die PreSpapier-Testblättchen der Beispiele 6, 7 und 8 mit

Testsubstanzen zur Diffusion in den Nährboden frei. _{einer metal!ischen Kapp3 (z}. _B. Aluminium) 20 mm

Bei der Herstellung werden keine Losungsmittel not- _{Durchmesser wä}hrend des Versuchs überdeckt werden,

wendig, somit entfallt ein irockr.jn_?sprozeß zur Ent- 35 _{um den flüchti en wirkstof}f _am Entweichen in den

fernung des Lösungsmittels, was leicht den Wirkstoff Cesamt-Schalenraum zu hindern. Die beimpften und

verändern konnte. Gunstig ist daß auch schwer los- _mit Preßpapier-Testblättchen versehenen Nährböden

liehe Antibiotika und Chemotherapeutika verwendet _Wurden 18 h bei 37° C bebrütet

bzw. geprüft werden können, ohne nach einem spe- Ergebnis: Der Teststamm Staphylokokkus aureus

zielten Lösungamitte! suche., zu müssen. Hervorzu- 4« _{SQ 5 u wa} Bacitracin, Pemdllin. Streptomycin,

heben ist, daß durch den kurzen Herstellungsweg und _Tetracyclin, a-Amino-i?-[(N-benzylthiocarbamoyl)-

die Möglichkeit, herkömmliche Vorrichtungen der _thio]-prcpionsäure, Nitrofurantoin, Sulfonamide,

pharmazeutischen Technik zu nutzen, die erforderliche chloramphenicol, sensibel, 'aseptische Herstellung erleichtert wird. Die Anwendung

der erfindungsgemäßen Preßpapier-Testblättchen er- 45 Mikrobiologisches Pniibeispiei 2

folgt in bekannter Weise. , Sensibilitätsprüfung gegen Pseudomonas aeruginosa

Als Beispiele für Preßpapier-Testblättchen dienen: _{3pec auf} Nährbouillon-Agar. In Petrischalen, 9 cm

Dh Durchmesser, wurden 0,1 ml einer Suspension von

Menge b ο fname _m"^_r" Pseudomonas aeruginosa spec, ausgespatelt und, wie

: : ^5P in Beispiel 1 beschrieben, wurden die Preßpapier-Tesf-

> ü ^^ItraCin _L · , „ ^m blättchen aufgelegt. Die Bebrütung erfolgte, wie in

2 50 meg Chloramphenicol 9 mn, Beispiel 1 während 18 h bei 37° C.

3 2IE Penicillin 6 mm

4 25 meg Streptomycin 3 mm Zusammensetzung: eil

5 5G meg Tcirscycür. S «srn 55 Sp?™lpenton 15.6

6 Ϊ60 meg a-Amino-/?-[(N-benzyl- Hefeextrakt 2,8

thiocarbamolyl)-thio]- Natriumchlot 1 5,6

propionsäure 6 mm D (-f)-Glucose 1,0

■ 7 160 meg a-Amino-/?-[iN-benzyi- Agar-Agar 13,0

thiocarbamo .'..-hm ^v' _;._M j. . _jchsfer.■ ·,- \., !cn, κ,-. ■

propionsäure 9 mn -, ₄ , ,

8 160 meg a-\mino-ß-\'^K- hen/^l-

thiocarbam«i ^;i!hio' ' rvi-^n'- · ■ lesKl.inu'= ■ .·';■ . ,!■ - !in-«-, ι

propionsäure 9 mni ·.;>·■ *;ir;· ·,' r_Cp- ■ .rriyi ■> >. - ■ ■: >! ->■ ■

9 2ÖOnicg Nitrofurant« 5 n\r. ; iso _MR. , , ./ λ_Π:: ,,,;[,% ·,,. , 10 500 mcg Sulfonamk! i Γ^ΓΠΓ s_t ,,K

(3,4-Dimeih> cgen !' , ,im. ΙΊ-üm¹-'- '■ Ur. '

sulfanilami' >■ ^.i/olj 9n«i ' '' ί ■ ' ·π um ■■ ^f r ,1¹

5 ' 6

Daraus werden mit einem Druck von etwa 600 kg/

Mikrobiologisches Prüfbeispiel 3 _{cm2 5QQQQ} Preßpapier-Testblättchen ä 10 I. E. Bacitra-

Sensibilität gegen Candida albicans. ein direkt gepreßt (Durchmesser 9 mm).

Auf Sabouraud-Glucose-Agai in Petrischalen 9 cm Das Gewicht beträgt pro Einheit 100 mg, die Härte Durchmesser wurde mit der Platinöse eine Beimpfung 5 liegt zwischen 6 bis 8 kg, bestimmt mit dem Pfizermit Candida albicans durchgeführt und anschließend, Tablet-Hardness-Tester.
wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden die Preßpapier-Testblättchen aufgelegt. Die Schalen wurden 24 h bei Beispiel 2

₁₀ 1 g Chloramphenicol iwrd unter Beachtung der üb-

Zusammensetzung liehen Vorsichtsmaßregeln im Porzellanmörser mit

von Sabouraud-Glucose-Agar g/l trockener, gereinigter, gemahlener Zellulose feinst ver-

Spezialpepton 10,0 rieben. Nach und nach werden 2 g, 6 g und 20 g

D (-l-)-Glucose 4o]o Zellulose hinzugegeben und nach gründlicher Mischung

Agar-Agar 15$ 15 '^{n e}'^nen Kubusmischer umgefüllt. In bekannter Weise

... .'..·" »,"-','/ "'/ werden weiter 1,97 kg Zellulose zugemischt. Die PulverpH des gebrauchsfert_!gen N^rVdens: 5,6±. _misch_ung wird mit einem Druck von 1500 kg/cm² zu Ergebnis: Candida albicr- -*ar gegen 150 meg σ- ²⁰⁰⁰⁰ Preßpapier-Testblättchen ä 100 mg Gewicht mit Aminu-_/H(N-b_enz_ylc,rK,nGyl)-thio]-propionsäure, einem Gehalt von 50jig Chloramphenicol verpreßt sensibel. 20 (Durchmesser 9 mm, Härte nach Pfizer-Tablet-Hard-

Gegen Bacitracin, Penicillin, Streptomycin, Tetra- ness-Tester 8 bis 10 kg),
cyclin, Nitrofurantoin. Sulfonamid und Chlorampheni-

col erwies es sich als resistent. Beispiel i

. . In einem Porzellanmörser wird zunächst die 200000 Beispiel 1 *5 Einheiten entsprechende Menge Penicillin-G-Natrium • Die 500000 Einheiten entsprechende Menge Bacitra- nach und nach mit 120 g trockener, gereinigter, gecin wird genau abgewogen Und mit 10 g trockener, mahlener Zellulose sorgfältig verrieben. Nach Umgereinigter, gemahlener Zellulose feinst verrieben. Zu füllung in einen geeigneten Mischer werden die erforder Anreibung werden nacheinander 30 und 50 g ZeI- derlichen 6,88 kg Zellulose unter gründlichem Mischen ;lulose gegeben und das Ganze jeweils 20 min lang gut 3° hinzugefügt.

^durchgemischt. Das Pulvergemisch wird dann in einen Es werden sofort mit einem Druck von 2000 kg/cm^z

geeigneten Mischer (z. B. Lödige-Mischer) umgefüllt, 100000 Preßpapier-Testblättchen zu 70 mg Gewicht

der Reihe nach werden 400 g; 1,5 kg und die restlichen gepreßt {Durchmesser 6 mm, Härte nach Pfizer-Tablet-

3 kg Zellulose hinzugefügt und gründlich gemischt. Hardness-Tester 4 bis 6 kg).

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Preßpapier-Testblättchen für mikrobiologische Untersuchungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausschließlich aus trockener, gereinigter, gemahlener Zellulose zusammengepreßt in inniger Vermischung mit einem Antibiotikum oder Chemotherapeutikum bestehen.