DE2163421B2

DE2163421B2 - Verfahren zur Glukosebestimmung in Körperflüssigkeiten

Info

Publication number: DE2163421B2
Application number: DE19712163421
Authority: DE
Inventors: Rudolf Dipl.-Chem. Dr. 8022 Gruenwald Fried; Joachim Dr. 8000 Muenchen Hoeflmayr
Original assignee: CH Boehringer Sohn AG and Co KG
Current assignee: Fried Rudolf Dipl-Chem Drrernat 8022 Gruen
Priority date: 1971-12-21
Filing date: 1971-12-21
Publication date: 1975-06-19
Also published as: DE2163421A1

Description

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Die Bestimmung der Glukose in Körperflüssigkeiten z. B. Blut, Plasma, Serum und Urin hat in der Erkennung und Verlaufskontrolle des Diabetes mellitus eine besondere Bedeutung.

Es gibt eine Reihe von Verfahren zur Glukosebestimmung im Serum, von denen die auf spezifischer Fermentwirkung beruhende Methode mit Glukoseoxydase — Peroxydase sehr häufig angewendet wird. Bei der Einwirkung der Glukoseoxydase auf Glukose entsteht Glukonsäure und Wasserstoffperoxyd. Letzteres wird in Anwesenheit eines Wasserstoffdonators (Chromogen) durch Peroxydase zu Wasser reduziert, wobei das Chromogen zu einem Farbstoff oxydiert wird.

Diese Methode weist zwei störanfällige Komponenten auf. Zum ersten wird das nur begrenzt haltbare Hilfsferment Peroxydase in seiner Aktivität durch Verbindungen mit Sulfhydrylgruppen beeinflußt und daher kann durch einen unterschiedlichen Gehalt des ^⁰ Blutes an Zystein oder Glutathion ein falsches Ergebnis der Glukosebestimmung erhalten werden.

Zum zweiten ist der durch Oxydation aus dem Chromogen entstandene Farbstoff im Testansatz nur beschränkt löslich. Bei höherer Glukosekonzentration ⁵^ fällt er in größeren Mengen an. wobei seine Löslichkeit überschritten wird. Es kommt zu Trübungen, die ein zu hohes Ergebnis vortäuschen.

Es hat nicht an Versuchen gefehlt, die dargestellten Mangel zu beheben.

Um diefi'irdieCilukosebestimmungspezifische Reaktion der Glukoseoxydase ohne die störanfällige Peroxydasereaktion durchzuführen, wurde unter anderem das gebildete Wasserstoff peroxyd durch d^;e katalytische Wirkung von Jodid und Molybdat deutsche Patentschrift 1 284 ?M) oder Vanad.it (deutsche Offenlegungsschrift 1 59P- ;.;28) reduziert und dabei ein Chromogen zu Farbstoff oxydiert. Außer den beiden genannten Redoxkatalysatoren sind speziell für die Zersetzung von Wasserstoffperoxyd ferner bekanntgeworden Kupfer-, Kobalt-, Eisen-, Nickel- oder Molybdänionen (USA.-Patentschrift 3 183 173), Wolfram, Bor und Oxyde der Actiniden (W. C. Schumb, »Hydrogen Peroxyd«, New York, 1955, S. 496 bis 498) oder Salze der Wolframsäure (F. Feigl, »Tüpfelanalyse«, 4. Auflage, I960, Bd. I, S. 421 und 422).

Zur Behebung der durch eine größere Menge an gebildetem Farbstoff entstandenen Trübungen hat man versucht, durch Zusatz von Schutzkolloiden wie Polyvinylpyrrolidon (deutsche Offenlegungsschrift 1 598 828), Gelatine (französische Patentschrift Nr. I 256 933) oder Alginat (deutsche Patentschrift 1 299 445) den entstandenen Farbstoff kolloidal in Lösung zu halten. H. U. Bergmeyer, (»Methoden der cnzymatischen Analyse« 2. Aufl., Bd. II, 1970, S. 1181 bis 1183) setzt 100 Teilen Puffer/Enzymlösung einen Teil Tween® 20 zu. Diese Verfahren sind jedoch unbefriedigend, weil es sich hierbei nicht um eine echte Lösung des Farbstoffs handelt.

1970 wurden außerdem verschiedene ausführliche Arbeiten über die Blutzuckerbestimmung nach der GOD/POD (Glukoseoxydase/Peroxydase)-Methode unter Verwendung eines neuen Chromogens veröffentlicht, bei dessen Verwendung eine Eichkurve erhalten wird, die bis zu etwa 500 mg % Glukose geradlinig verläuft (W. Werner et al, Zeitschrift Analytische Chemie, Bd. 252, S. 224 bis 228; K. Kahle et al. Zeitschrift Analytische Chemie, Bd. 252, S. 228 bis 231; H. Wielinger, Der Krankenhausarzt, Heft 9, 1970, S. 390 bis 391; deutsche Patentschrift 1 648 840).

Bei den in den vorstehend zitierten Literaturstellen beschriebenen Bestimmungsmethoden werden im allgemeinen Eichkurven erhalten, die bis zu 300 mg V₀ Glukose geradlinig verlaufen. In den zuletzt zitierten Arbeiten wird ein geradliniger Verlauf der Eichkurven bis 500 mg % Glukose angegeben. Werden höhere Werte errechnet, so muß die Bestimmung nach entsprechender Verdünnung des Analysenguts wiederholt werden.

Die Aufgabe der Erfindung bestand daher in der Schaffung eines Glukose-Bestimmungsverfahrens, mit dem auch bei höheren Glukose-Konzentrationen geradlinige Eichkurven erhalten werden.

Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren zur Bestimmung der Glukose in Körperflüssigkeiten, bei dem in an sich bekannter Weise die eiweißfreie Analysenlösung mit einem Reagens zusammengebracht wird, das Glukoseoxydase, ein Chromogen, ein wasserlösliches Jodid, einen Redoxkatalysator und einen Lösungsvermittler enthält, dadurch gelöst, daß als Redoxkatalysator ein wasserlösliches Salz der Wolframsäure oder der Borsäure oder ein Uranylsalz und als Lösungsvermittler für den entstehenden Farbstoff ein wasserlöslicher Fettsäureester oder Fettsäureäther, vornehmlich Polyoxyäthylensorbitanoleat oder Polyoxyäthylenlauryläther in einer Konzentration von 0,001 bis 2% zugesetzt wird.

Bevorzugt wird dabei als Redoxkatalysator ein Salz der Wolframsäure, z. B. Natriumwolframat in einer Konzentration von 0,005 und 3 % angewendet.

Man erhält mit dem erfindungsgemäßen Verfahren vollkommen geradlinige Eichkurven bis über 1100 mg/ 100 ml Glukose.

Zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens sei folgendes Beispiel gebracht:
Reagentien:

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1. Reaktionslösung 2. Standard:

200 mg Glukose/100 ml dest. Wasser

a) 15 U Glukoseoxydase Arbeitsvorschrift:

50 mg Natriumwolframat 0,1 ml Blut bzw. Glukosestandard werden mit je

500 mg Kaliumjodid 5 1 ml Trichloressigsäure (5%ig) versetzt. Die Analyse

8 mg o-Dianisidin wird zentrifugiert.

5 mg Polyoxyäthylenlauryläther 0,1 ml Überstand bzw. Standardgemisch werden

,.,,.,.„,, . zu 2,0 ml Reaktionslösung gegeben und 30 min bei

^b> 15 U Glukoseoxydase Zimmertemperatur oder 15 min bei 37⁰C stehen

150mgUranylacetat _{10 lassen}

500mg Kaliumiodid _{Nach djeser zdt werden dje Extinktionen von}

8 mg o-üianisidin Analyse und Standard bei 436 mm gegen die Reak-

100 mg Polyoxyathylensorb.tanoleat tionslösung als Leerwert photometrisch gemessen. Die

c) 15 U Glukoseoxydase Berechnung erfolgt nach der Formel:

100 mg Natriumtetraborat ^l5 Extinktion Analyse _ΛΛΛ „ , _linn .

500 mg Kaliumjodid Extinktion Standard ' ²°° = ^{mg Glukose}/^{100 ml}
10 mg Polyoxyathylensorbitanoleat

Für die einzelnen Elemente der erfindungsgemäßen

werden in etwa 80 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,2 Kombination der Merkmale wird im Rahmen der

gelöst und mit diesem Puffer auf 100 ml aufgefüllt, ao vorliegenden Anmeldung kein Schutz beansprucht.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung der Glukose in Körperflüssigkeiten, bei dem in an sich bekannter Weise die eiweißfreie Analysenlösung mit einem Reagens zusammengebracht wird, das Glukoseoxydase, ein Chromogen, ein wasserlösliches Jodid, einen Redoxkatalysator und einen Lösungsvermittler enthält, dadurch gekennzeichnet, daß als Redoxkatalysator ein wasserlösliches Salz der Wolframsäure oder der Borsäure oder ein Uranylsalz. und als Lösungsvermittler für den entstehenden Farbstoff ein wasserlöslicher Fettsäureester oder Fettsäureäther, vornehmlich Polyoxyäthylensorbitanoleat oder Polyoxyäthylenlauryläther in einer Konzentration von 0,001 bis 2% zugesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß als Redoxkatalysator vornehmlich ao ein Salz der Wolframsäure z. B. Natriumwolframat in einer Konzentration von 0,005 bis 3% angewendet wird.