DE2140353A1

DE2140353A1 - Neues Proteid biologischen Ursprungs und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE2140353A1
Application number: DE19712140353
Authority: DE
Inventors: Jean Pierre Osny Agneray Jean Durand Genevieve Feger Jeanne Paris Buret, (Frankreich)
Original assignee: Roussel Uclaf SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1970-08-12
Filing date: 1971-08-11
Publication date: 1972-02-17
Also published as: BE771042A; NL7111115A; DK133129C; DK133129B; GB1357564A; FR2101041B1; ES393796A1; HU164498B; SE388125B; FR2101041A1

Description

Dr. F. Zumsteln sen. - Dr. E. Assmann Dr. R. Koenlgsberger - Dlpl.-Phys. R. Holzbauer - Dr. F. Zumsteln Jun.

PATENTANWÄLTE TELEFON: SAMMEL-NR. 225341

TELEX 529979

TELEGRAMME: ZUMPAT POSTSCHECKKONTO: MÜNCHEN 91139

BANKKONTO: BANKHAUS H. AUFHÄUSER

8 MÜNCHEN 2.

BRÄUHAUSSTRASSE 4/III

Cas 1409 D

ROUSSEL-UCLAF, Paris/Frankreich

Neues Proteid biologischen Ursprungs

und Verfahren zu dessen Herstellung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Proteid biologischen Ursprungs.

Sie betrifft insbesondere ein Glykoprotein aus tierischem oder menschlichem Serum oder aus der Placenta.

Sie betrifft insbesondere ein Serum-Glykoprotein, das bei der Elektrophorese eine vor dem Albumin liegende Mobilität besitzt und durch seinen isoelektrischen Punkt von 4,0 ί 0,2, bestimmt durch Elektrofokalisierung mit Hilfe einer Vorrichtung LKB 8101,

Ve
und durch sein Verhältnis sr- zwischen 1,30 und 1,75 definiert ist uud das in Phytinsäure löslich ist.

DiesesGlykoprotein kann ebenfalls durch seine biologische Aktivität gegenüber biologischen Aminen und insbesondere gegenüber zirkulierendem Histamin definiert werden. Man definiert eine

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histaminopexische Einheit als die minimale Menge von reinem oder gemischtem Glykoprotein, das, gelöst in 1 ecm physiologischer Lösung nach Tyrode, die kontrahierende Wirkung von Histamin auf das isolierte Meerschweinchen-Ileum maximal vermindert.

Andere Arbeiten, die von Parrot und Laborde (Presse Med. 61, (1953), 1267) durchgeführt wurden, zeigten mit Untersuchungen, die in vitro durchgeführt wurden, einen Serumfaktor, der in der Lage ist, Histamin zu binden. Diese Autoren zeigten ebenfalls, daß die Seren vpn allergischen Patienten nicht in der Lage sind, das Meerschweinchen gegen die kontrahierenden Wirkungen des Histamins zu schützen. Es ist daher möglich, daß dieser Serumfaktor in mehr oder weniger beträchtlichen Mengen beim Menschen vorhanden ist und dessen Anwesenheit in zu geringen Mengen, dazu führt, diese pathologischen Manifestationen hervorzurufen.

Erste biochemische Arbeiten, die auf der selektiven Ausfällung dieses Faktors durch halbgesättigtes Ammoniumsulfat oder Äthylalkohol beruhten, führten die Autoren dazu, diesen Faktor als ein Globulin zu identifizieren.

Später haben die "gleichen Autoren die serische Bindung des Histamins (die histaminopexische Funktion) beim normalen Individuum einer Proteinfraktion zugeschrieben, die zwischen p_H 6,5 und 5,2 ausfällt, ähnlich einem jf-Globulin (Plasmapexin I) mit einer Sedimentationskonstanten von 7 S.

Das Serum des allergischen Individuums enthielt diesen Körper nicht, jedoch ein anderes histaminopexisches Globulin, das Plasmapexin II, das bei normalen Bedingungen inaktiv ist, das im normalen Serum nicht vorhanden ist und mit einem Inhibitor des Plasmapexins I, dem Antipexin, assoziiert ist.

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Demgegenüber haben andere Autoren (Gesce et coll., J.Pharm. Pharmac., 2£, (1968), 655) diesem Faktor die Struktur eines Polypeptids und nicht eines Proteins zugesprochen.

Neuere Arbeiten von J. Agneray (C.R.Ac.Sc. 267 (1968), 260) und von J. Parrot (C.R.Ac.Sc- 26 8 (1969), 2536) haben das . Verfahren zur Herstellung von Fraktionen, die reich an dem. histaminopexischen Faktor sind und bei dem von Serumproteinen ausgegangen wird, präzisiert.

Es zeigte sich, daß diese Fraktionen keine Immunoglobuline sind. Vielmehr bemerkten diese Autoren durch elektrophoretische und immunoelektrophoretische Analyse (mit Humanplasma- f Immunserum-Antiproteinen) die Anwesenheit eines Globulins der Mobilität ß-1 und eines Proteins der Albumin-Mobilität.

Die Reinigung über Sephadex-Gel G 200 erlaubte es bereits, eine aktive Fraktion herzustellen, die 50 000 histaminopexische Einheiten pro mg enthielt.

Es bestand daher eine große Ungewißheit bezüglich der Art, der Identität und der Einzigartigkeit des Serumfaktors, der in der Lage ist, Histamin zu binden. Die Erfindung beruht auf der Tatsache, daß neue Isolierungs- und Reinigungs-Verfahren es gestatteten, eine Fraktion in ultrareiner Form zu erhalten, die a für die Histaminopexie verantwortlich ist.

Die Erfindung beruht ebenfalls auf der Tatsache, daß diese Extraktion und diese Reinigung auf Serumproteine tierischen Ursprungs sowie der Placenta ausgedehnt werden konnten, wodurch es möglich wurde, weit billigere Ausgangsmaterialien einzusetzen.

Die vorliegende Erfindung beruht weiter auf der Tatsache, daß die in ultrareiner Form erhaltene histaminopexische Fraktion einer chemisch definierten Klasse zugesprochen werden konnte, die sich von Globulinen, Immunglobulinen und anderen Proteinen unterscheidet.

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Die Analysen und die durchgeführten Messungen bewiesen mit Sicherheit, daß der Serumfaktor, der für die Fixierung des Histamins verantwortlich ist, ein Glykoprotein ist.

Die Erfindung beruht ferner auf der Tatsache, daß diese in ultrareiner Form erhaltene Fraktion von allen Antigen-Faktoren befreit ist, die eine Folge der Anwesenheit von anderen Proteinen oder Proteinen heterogenen Ursprungs sind.

Es ist daher möglich,·nicht nur über eine Serumfraktion, sondern über eine definierte, durch physikalische oder chemische Kriterien identifizierbare chemische Substanz zu verfügen, die durch biologische Untersuchungen und durch ihre Wirkung der Bindung des Histamins dosierbar ist und deren Verwendung in der Therapie bei der Behandlung von allergischen Zuständen leicht in die Tat umzusetzen ist.

Die Herstellung einer ultrareinen Fraktion menschlichen oder tierischen Ursprungs gestattet die therapeutische Verwendung des histamxnopexisehen Faktors in unbegrenzten Mengen, ohne Berücksichtigung der Herkunft dieses Faktors.

Bei dieser Reinigungsstufe kann man die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieses Glykoproteins angeben, die es ermöglichen, dieses Material von dem bisher bekannter Arbeiten zu unterscheiden:

- Es ist in Phytinsäure löslich und besitzt daher einen sauren Charakter;

- der optimale Ausfällbereich durch Ammoniumsulfat liegt bei P_H 7,0 zwischen 2,5 M und 2,8 M. Dieser relativ enge Bereich weist darauf hin, daß die erhaltene Verbindung kein Immunglobulin ist, da diese bei viel geringeren molaren Konzentrationen von Ammoniumsulfat ausgefällt werden;

- das Molekulargewicht, das durch Filtration über Sephadex-G bestimmt wurde, ist geringfügig größer als das eines Immunglobulins;

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- die elektrophoretisch^ Beweglichkeit auf Agarose, Celluloseacetat oder einem Saccharose-Gradienten erlaubt die Einordnung als ein Präalbumin J

- die Elektrofokalisierung gestattet es schließlich, diesem Glykoprotein einen Wert des isoelektrischen Punktes ganz in der Nähe von 4,0 zuzuordnen;

- nach der Einwirkung von Neuraminidase verschwindet die histaminopexische Wirkung. Es handelt sich daher um ein Glykoprotein}

- dieses Material ist in Wasser löslich.

Man kann annehmen, daß bei einem allergischen Zustand eine anormal erhöhte Freisetzung von biologischen Aminen und insbesondere Histamin erfolgt. Das humorale Bindungsvermögen wird dabei überfordert. Das therapeutische Ziel des histaminopexischen Glykoproteins besteht darin, das Bindungsvermögen zu nor» malisieren oder zu steigern.

Weiterhin tritt bei bestimmten akuten allergischen Zuständen eine beträchtliche Verminderung der normaltheoretischen Konzentration der histaminopexischen Fraktion, die zwischen 5 und 10 mg/l liegt, ein. Die Verabreichung von histaminopexischem Glykoprotein gestattet es, dieser Konzentrationsverminderung vorzubeugen oder die anormal geringe Menge der histaminopexischen Fraktion zu erhöhen.

Zu diesen therapeutischen Zwecken wird das histaminopexische Glykoprotein auf perlingualem, parenteralem, rektalem oder topischem Wege oder über die Schleimhäute verabreicht.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die als aktiven Wirkstoff das histam.i»opexische Glykoprotein enthalten, liegen vor in Form von Sublingualtabletten, in Form von Ampullen oder Mehrfachdosenfläschchen, in Form von Suppositorien, Cremes, Salben, Lotionen, Bronchialsprühmitteln, Nasaltropfen oder Aerosolen.

Die pharmazeutischen Formen können zusätzlich einen oder mehrere andere aktive Wirkstoffe mit unterstützender oder

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Wirkung

/beinhalten. Mann kann auch den Präparaten für Aerosole einen Bronchiendilatator, wie z.B. "Isoprenalin" zusetzen.

Die nützliche Dosierung kann in Abhängigkeit von dem Verabreichung sweg, der Art des Krankheitszustandes des Individuums und der Schwere des Krankheitszustandes variieren.

Auf perlingualem Verabreichungsweg erstreckt sich die Dosierung zwischen 5 und 20 mg täglich. Wird das Material injiziert, insbesondere auf intramuskulärem Wege, liegt die Dosierung bei etwa 1 mg/kg täglich in Form von Ampullen mit 5, 10 oder 20 mg Glykoprotein. Bei externer Verabreichung, insbesondere bei einer Verabreichung in Form einer Creme oder einer Salbe, schwankt die Konzentration an aktivem Wirkstoff zwischen 0,1 und 0,5 %.

Das histaminopexische Glykoprotein findet Anwendung bei Hautallergie-Zuständen, wie akuten oder chronischen Urticarien, b»i Überempfindlichkeit gegenüber der Hitze oder der Kälte, bei Dermographie, bei polyraorphen Erythemen, bei Ekzemen, bei aller gischer Purpura als auch bei allgemeinen Allergiezuständen, wie Asthma, spasmischem Schnupfen, allergischer Rhinitis, allergischer Konjunktivitis und allergischer Keratitis, bei medikamentösen Allergien, bei der Unverträglichkeit von Penicillin, bei dem Quincke-Ödem, bei der Vergiftung durch Histamin oder durch Nahrungsmittelamine durch Aufnahme verdorbener Nahrungsmittel, bei Kreislaufkollaps durch einen anaphylaxie-ähnlichen Schock, bei allergischen Migränen, bei Gastritis, bei Dickdarmentzündungen und Dünndarm-Dickdarm-Entzündungen allergischen Ursprungs.

Es ist weiterhin nicht ausgeschlossen, daß das histaminopexische Glykoprotein auf Grund seiner Fähigkeit der Aufnahme von biologischen Aminen Verwendung bei der Behandlung von Kreislaufstörungen finden kann, die eine Folge eines Übermaßes oder eines Mangels von im Kreislauf befindlichen Catechola/ninen sind.

Das Verfahren zur Herstellung dieser ultrareinen histaminopexischen Fraktion, das ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erx±>L| X5u^QSuQT^!TT^aTJf9C'*5n'lT?SIrCiunsL, u<ii3 Itioli QIe uuiui

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Filtrationschromatographie über Sephadex-Gel (G 200) von menschlichen Serumproteinen erhaltene rohe aktive Fraktion einer Trennung durch Zonenelektrophorese mit Dichtegradienten unterzieht, man die aktive histaminopexische Fraktion mit einer Beweglichkeit, die vor der des Albumins liegt, abtrennt, sie einer erneuten Reinigung durch Elektrofokalisation in einer Mischung von "Ampholinen" unterwirft und die Fraktion, dessen isoelektrischer Punkt zwischen 3,9 und 4,1 liegt, abtrennt.

Bei den. bevorzugten Ausführungsformen wirds

a) die Zonenelektrophorese in flüssiger Schicht oder auf einem festen Träger bewirkt. ä

b) Die Elektrofokalisierung erfolgt mit einer Potentialdiffe— renz von 500 bis 700 Volt bei einer Stromstärke von 1 bis 8 mA.

Bei der histaminopexischen Fraktion tierischen Ursprungs bewirkt man zunächst eine Behandlung des Tierserums mit einer Phytinsäurelösung bei einem p„-Wert von 2,10, wodurch die Mehrzahl der Proteine ausgefällt wird. Die überstehende Flüssigkeit wird dann abgetrennt und durch Chromatographie über Sephadex-Gel G 200 fraktioniert. Die aktive Fraktion wird anschließend durch Zonenelektrophorese mit Hilfe eines Dichtegradienten und durch Elektrofokalisierung gereinigt. I

Die Reinigung ist nicht absolut notwendig, und es können weniger reine Fraktionen ebenfalls eingesetzt werden. Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung weiter erläutern, ohne sie jedoch zu beschränken.

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Beispiel 1

Herstellung von histaminopexischem Glykoprotein ausgehend von menschlichen Serumproteinen ·

Stufe A: Zonenelektrophorese mit Dichtegradienten

Die Zonenelektrophorese wird in einer Vorrichtung LKB 3340 durchgeführt, die durch eine auf eine 15 C thermostatisierte Säule gebildet wird, die an ihrem oberen Teil mit dem Kathodenraum und an ihrem unteren Teil mit dem Anodenraum in Verbindung steht. Der Dichtegradient kann diskontinuierlicher Art sein, indem man manuell Lösungen mit abnehmenden Dichten übereinander— schichtet, oder kontinuierlich sein, indem man progressiv die Konzentration durch aufeinanderfolgende Stufen variiert. Die folgende Lösung ist die bevorzugte: 175 ecm einer Pufferlösung, Pu 8,2, die durch eine Veronalnatrxumlosung (Natriumdiäthylbarbiturat), 3 g/l, gebildet wird und die die Lösung geringer Dichte (Reagens R^) darstellt. 300 ecm einer Saccharoselösung mit 500 g/l stellt die Lösung großer Dichte dar (Reagens R~).

Nach der Einführung von 300 ecm der Mischung in die Vorrichtung wird das Ablaufen gestoppt. Beim Beginn ist der eingestellte Gradient linear und weist eine steile Neigung auf.

Der erste Behälter (Behälter A) enthält 50 ecm Reagens R₁, und das Volumen bleibt konstant. Die Fläschchen B und C werden auf konstantem Niveau gehalten. Die ersten in Verbindung stehenden Gefäße enthalten 200 ecm einer Lösung von 200 g Saccharose in lOOO ecm der Pufferlösung R. (Reagens R₃).

Das zweite kommunizierende Gefäß enthält 100 ecm des Reagens R₄, das durch 600 g Saccharose und 1000 ecm der Pufferlösung R₁ gebildet wird, worin ein Röhrchen eintaucht.

Der Puffer R^ steigt in dem Röhrchen auf, bis er das Niveau des Inhalts des ersten kommunizierenden Gefäßes (Behälter B) erreicht. Beim Durchtreten des ersten Drittels der Mischung führt eine Verminderung des Niveaus der Flüssigkeit des Gefäßes B zu einer identischen Verminderung des .Inhalts des Röhrchens des

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zweiten kommunizierenden Gefäßes (Behälter C). Die Zuführung der Lösung großer Dichte ist vernachlässigbar. Wenn das Rohr leer ist, ist für eine gleiche Veränderung des Niveaus in dem Behälter B das Volumen des verdrängten Puffers R₄ weitaus wichtiger. Dies gestattet es, die Neigung des Dichtegradienten aufrechtzuerhalten.

Die Elektrophorese wird an einer Probe von 200 mg durchgeführt, die in dem Puffer R₁ in einem maximalen Volumen von 5 ecm gelöst ist und gegen den gleichen Puffer während 24 Stunden dtalysiert wurde.

Vor der Einführung in die Vorrichtung wird die Untersuchungs- λ probe auf die Dichte der Einführungssone gebracht* Dasu wird ein bestimmtes Flüssigkeitsvolua@n aus dem oberen Teil der Vorrichtung entnommen und mit dem der zu untersuchenden Probe verglichen· Wenn die Dichte der sy untersuchenden £8sung nicht ausreichend hoch ist, stellt man die Dichte durch Zugabe der Lösung starker Dichte oder durch Zugabe von Saccharose ©in.

Die Abtrennung erfolgt mit Hilfe einer Pot@ntialdiff®renz von 550 Volt und einer Stromstärke von 18 raA im Verlauf von 16 Stunden.

Der Elutionsverbrauch wird durch eine Schlauchpumpe reguliert» Das Eluat wird in einem Sammelgefäß aufgefangen und gemäß der " durch kontinuierliche Aufzeichnung der optischen Dichte bei 280 nm erhaltenen Kurve in Fraktionen aufgeteilte

Eine Dialyse gegen Wasser wird häufig wiederholt, um die Saccharose zu entfernen. Die Fraktionen werden dann gefriergetrocknet.

Man isoliert in dieser Weise zwei Fraktionen, eine mit einer Präalbuminbeweglichkeit und aie andere mit der Beweglichkeit von ß-Globulin, wovon lediglich die Fraktion der Präalbuminbeweglichkeit die kontrahierende Wirkung von Histamin auf das isolierte Meerschweinchen-Ileum vermindert.

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tNBPECHD

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die Immunelektrophorese gegen ein normales menschliches Antiserum-Immunserum zeigt einen einzigen Bogen der gleichen Beweglichkeit. Dies deutet innerhalb der Fehlergrenzen in der Immunchemie auf ein einziges Molekül in dieser aktiven Fraktion hin.

Die zweite Fraktion enthält ein Protein mit der Beweglichkeit von ß-!-Globulin, gleichgültig, ob man auf festen Träger oder auf flüssigem Träger arbeitet.

Stufe B: El ektfpfofcfJ4f3-ff^rurPffi

Während der freien Elektrophorese einer Salzlösung erscheinen zwischen den beiden Elektroden wachsende p„-Werte. Wenn man in dieses Medium eine Mischung von amphoteren Körpern mit sehr benachbarten isoelektrischen Punkten einbringt, verharrt jeder dieser Körper in eine« anderem Bereich, «ras sur Bildung eines

ftflirt.

Die längere Anwendung eines elektrischen Stromes in diesem Gradientern bewirkt eine FokaUslerung der eingeführten Proteine an pjj-Werten, die den isoelektrischen Punkten dieser betreffenden Proteine entsprechen·

Die verwendeten amphoteren Verbindungen sind aliphatische polyaminierte und polycarboxylische Säuren mit einem Molekulargewicht unterhalb lOOO, öle 3er allgemeinen Formel

-CH₀-N-(CH₀) -N-(CH₀) -N-2 ι 2 η ι 2 ρ ι

(CH_n)

2 m

NR,

entsprechen, worin R H oder (CH₂^-COOH und m, η und ρ ganze Zahlen kleiner als 5 bedeuten.

Diese Verbindungen werden unter dem Namen "Ampholine" vojn_der Firma LKB in den Handel gebracht. Sie gestatten die Herstellung

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- 11 verschiedener p^-Gradienten.

Es ist notwendig, daß man diesen p^-Gradienten zusammen mit einem Dichte-.Gradienten benutzt, um Konvektiohs strömung en zu vermeiden und die Stabilität der Fokalisierung der Proteine sicherzustellen.

Die isoelektrische Abtrennung erfolgt in einer Säule LKB 8101 mit einem Passungsvermögen von 110 ml oder LKB 8102 mit einem Passungsvermögen von 440 ml. Die zwischen zwei konzentrischen Zylindern befindliche Trennkammer wird durch Zirkulieren von Wasser mit einer Temperatur von +15⁰C auf konstanter Temperatur gehalten. Die Platinelektroden sind derart angeordnet, daß . I die Gasentwicklung bei ihrem Kontakt die Fokalisierung nicht stören kann. Weiterhin werden die Elektroden durch verdünnte Säuren oder Basen von den Ampholinen isoliert, um deren anodische Oxydation oder deren kathodische Reduktion zu vermeiden.

Die Wahl der Polarität der Elektrode ist mit der gewünschten Zone verbunden. Die Leitung variiert in Abhängigkeit von der Saccharosekonzentration und nimmt bei hohen Konzentrationen ab. Sie ist in der Zone des p„-Werts 6 bis 8 gering.

Die Konzentration der "Ampholine" sollte nicht geringer sein als 1 %, um ein ausreichendes Puffervermögen aufrechtzuerhalten. λ Eine Erhöhung der Konzentration der Ampholine begünstigt die Lösung der Proteine, die die Neigung haben, an ihrem isoelektrisehen Punkt auszufallen.

Die Lösungen haben folgende Zusammensetzung:

Lösung hoher Dichte;

- Ampholine mit einem p_H~Wert von 3 bis 5, 40%-ig, " 15 ml

- Saccharose ' 100 g

- destilliertes Wasser auf 150 ml

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Lösung geringer Dichte:

- Ampholine mit einem p_H-Wert von 3 bis 5, 4%-ig, 5 ml

- destilliertes Wasser ' auf 215 ml

In einer Reihe von Röhrchen vermischt man zuvor die Lösungen geringer und hoher Dichte in geeigneten Verhältnissen. Die Einführung der Probe erfolgt, indem man ein bestimmtes Lösungsvolumen geringer Dichte durch ein gleiches Volumen einer Lösung der Proteinfraktion, die 20 bis 100 mg des in der Stufe A erhaltenen Produktes in einem gleichen Volumen der Lösung geringer Dichte enthält, ersetzt.

Nach der Einführung der anodischen Lösung in die Vorrichtung wird der Dichtegradient durch Übereinanderschichten von vorher hergestellten Fraktionen abnehmender Dichte aufgebaut. Die Kathode wird durch eine verdünnte Natriumhydroxydlösung isoliert.

Dann legt man während 48 bis 7.2 Stunden an die Elektrodenanschlüsse eine Potentialdifferenz von 700 V an derart, daß die Leistung bei der Vorrichtung 8101 2 bis 3 W und bei der Vorrichtung 8102 4 bis 6 W nicht übersteigt. Dieses Verfahren kann ohne Schwierigkeiten noch um 24 Stunden verlängert werden.

Man bewirkt dann die Elution der Fokalisierungszonen mit Hilfe einer Schlauchpumpe mit sehr regelmäßigem Verbrauch, indem man den Inhalt der Säule durch destilliertes Wasser ersetzt, dessen Zufuhr durch eine LKB-Perpex-Pumpe gleichmäßig gehalten wird.

Nach der Bestimmung der optischen Dichte der Eluate bei 280 nm und 250 nm und der Bestimmung des p_H-Wertes bei der gleichen Temperatur wie der, bei der die Wanderung bei jedem Elutionsröhrchen erfolgte, trennt man die Fraktionen in Abhängigkeit von der optischen Dichte und dem p„-Wert ab.

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- "13 -

Man führt dann die Eluate über eine Kolonne von Sephadex G 25 oder G 50, um die Ampholine und die Saccharose zurückzuhalten. Ein einziges Eluat ist in der Lage, die biologische Aktivität von Histamin auf das isolierte Meerschweinchen-Ileum zu vermindern. Es entspricht einer Fokalisierungszone von einem p„—

+
Wert von 4,0 _ 0,1.

Dieses Eluat wird durch Gefriertrocknung getrocknet. Die Bestimmung der optischen Dichte der Eluate bei 280 nm zeigt drei

Ve
Peaks. Ihre Verhältnisse ^- sind vollständig vergleichbar mit denen von Fraktionen, die man durch die Chromatographie von Humanserum getrennt hat.

Die elektrophoretische und immunelektrophoretische Untersuchung ermöglicht es, die Art der Bestandteile genauer zu bestimmen.

Ve Der zweite Elutions-Peak, dessen Verhältnis rr— zwischen 1,40 und 1,70 liegt, ist allein aktiv, jedoch noch sehr heterogen.

Ve

Das reine Protein besitzt ein Verhältnis rr-~ zwischen 1.30 und

Vo '

1,58. Die Anfärbung mit Amidoschwarz enthüllt eine Bande der Beweglichkeit von Albumin, eine beträchtliche Zone der Beweglichkeit von (Xp-Globulin und.Spuren von Immunoglobulinen.

Die biologische Dosierung dieses Pulvers zeigt, daß 0,3 ng einer histaminopexischen Einheit entsprechen.

Trennung durch Zonenelektrophorese mit Dichteqradienten

Die Proteinverbindungen der oben erhaltenen aktiven Probe werden in flüssiger Schicht durch Zonenelektrophorese in einer Vorrichtung LKB 3340 C getrennt! Die Proteine werden in ihrer Wanderungszone durch einenDichtegradienten stabilisiert.

150 mg der oben erhaltenen Proteinfraktion werden in 3 ecm Barbj türpuffer gelöst. Eine Potentialdifferenz von 530 V und eine Stromstärke von 22mA werden während 12 Stunden angewandt.

's.

Die Bestimmung der optischen Dichte des Eluats bei 280 nnPzeigt drei Elutions-Peaks· Der Peak I stellt eine Präalbuminbeweglich-

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keit, der Peak II eine cCp-Globulinbeweglichkeit und der Peak III eine ß-Globulinbeweglichkeit dar.

Die drei Fraktionen werden gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann konzentriert und gefriergetrocknet.

Die Fraktion I ist die einzig aktive. Die Anfärbung mit Amidoschwarz nach der Elektrophorese auf Celluloseacetat bei einem p„-Wert von 8,6 zeigt ein Protein mit Präalbuminbeweglichkeit. Die Verunreinigungen, die nach der Chromatographie über Sephadex-Gel G 200 verblieben sind, wurden von dem aktiven Faktor abgetrennt. Die so erhaltene Probe ist weitaus aktiver.

Elektrofokalisierunq

Die isoelektrische Trennung erfolgt in einer Mischung von Ampholinen, die in der Lage sind, einen ρ-,-Gradienten zwischen 3,0 und 5,0 zu schaffen. Die Abtrennung wird in einer Vorrichtung LKB 8101 durchgeführt. 20 mg der oben angegebenen Fraktion I werden in 3 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird während 24 Stunden dialysiert. Man führt dann diese Lösung in die Vorrichtung ein. Man legt eine Potentialdifferenz von 300 V und eine Stromstärke von 1 mA während 72 Stunden an.

Die optische Dichte des Eluats, dessen Abführung durch eine Pumpe geregelt wird, wird bei 280 nm gemessen. 1 mg dieses Produkts enthält 5.10 histaminopexische Einheiten.

Die Elektrophprese und die Immunelektrophorese bestätigen die Präalbuminbeweglichkeit dieser Fraktion.

Bei dieser Stufe der Reinigung erhöht eine erneute Elektrofokalisierung die Aktivität des Produktes nicht.

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Beispiel 2

Isolierung von histaminopexischem Glykoprotein ausgehend von Serumproteinen vom Schwein

Eine Mischung von Schweineserum wird mit einer Phytinsäurelösung bei einem p_H-Wert von 2,10 behandelt. Nach dem Abzentrifugieren des Niederschlags wird die überstehende Flüssigkeit gegen destilliertes Wasser dialysiert, konzentriert und gefriergetrocknet. Der Phytinextrakt wird dann durch Chromatographie fraktioniert.

Die Proteinbestandteile des Schweineserums werden durch Filtrationschromatographie über Sephadex-Gel G 200 in Abhängigkeit ä von ihrem Molekulargewicht getrennt. 100 ml des Schweineserums werden so über eine Säule mit einer Höhe von 2 m und einem Durchmesser von 5 cm filtriert, wobei die Säule mit Sephadex-Gel G 200 gefüllt ist und mit einer tufferlösung der folgenden Zusammensetzung ins Gleichgewicht gebracht worden ist:

Tris-(hydroxymet3iyl)-aminomethaii 0,1 M NaCl 1 M

und auf einen p_H-Wert von 8 eingestellt wurde.

Die Eluate werden in einem Fraktionssammler aufgefangen. Der p_H-Wert wird für den Inhalt jedes Röhrchens bestimmt. Die Röhrchen werden in Funktion .der optischen Kurve und des p_H-Werts in vier Fraktionen aufgeteilt. Die Fraktionen werden dialysiert, konzentriert und gefriergetrocknet. Jedes der erhaltenen Produkte wird pharmakologisch untersucht.

Lediglich das Produkt II ist in der Lage, die kontrahierende Wirkung von Histamin auf das isolierte Meerschweinchen-Ileum zu vermindern.

Die Aktivität dieses Materials ist beträchtlich, da man durch das Verfahren der aufeinanderfolgenden Verdünnungen feststellt, daß eine histaminopexische Einheit 2 Nanogramm des gefriergetrockneten Pulvers entspricht.

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Die elektrophoretische Untersuchung auf Celluloseacetat bei einem p„-Wert von 8,6 bestätigt die Homogenität des Präparats. Die Behandlung mit Amidoschwarz macht eine einzige Bande der Präaluburainbeweglichkeit sichtbar. Gemäß der Fokalisierungszone kann man den isoelektrischen Punkt dieses Materials auf einen Wert zwischen 3,90 und 4,10 festlegen.

Die Ähnlichkeit zwischen der aus dem Humanserum erhaltenen aktiven Fraktion und der aus dem Schweineserum erhaltenen aktiven Fraktion ist vollständig. Diese Fraktionen besitzen bei der pharmakolögischen Untersuchung die gleiche Aktivität.

Eine Untersuchung nach dem Verfahren von Ouchterlony zeigt kein Anzeichen der Bildung eines Bogens um die Abscheidung von Schweineproteinen in Gegenwart eines Humanantiserums-Immunserums.

Ein Humanantiserum-Immunserum zeigt kein Serumprotein vom Schwein. Es besteht also innerhalb der Fehlergrenzen der immunologischen Analyse keine antigene Gemeinsamkeit zwischen den beiden Proteinen.

Beispiel 3

Reinigung über eine Membran XM 100 A (Ultrafiltermembran)

2,54 g Eiweißkörper einer Fraktion, die mit Ammoniumsulfat mit einer molaren Konzentration zwischen 2,4 und 3,3 ausgefällt wurde, werden in 12 1 verdünnt und unter konstantem Rühren mit 100 1 destilliertem Wasser diafiltriert.

Der Versuch wird bei +4 C bei einem Druck von 0,5 Bar durchgeführt.

Die zurückgehaltene Fraktion wird pharmakologisch auf ihre Aktivität hin untersucht, und anschließend untersucht man die Eiweißkörper nach dem Biuret-Verfahren auf ihre elektrophoretische· und immunelektrophoretische Zusammensetzung.

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Ergebnisse

Die Bestimmung der Einheit der Wirkung in ng des Ausgangsserums und einer zurückgehaltenen Probe ermöglicht es, die Anreicherung zu bewerten.

Bei Kenntnis der Aktivitätseinheit X' in ng berechnet man die

1 '

Zahl der Einheiten rrr .

	X¹ Cug)	l/X' (mg)
Anfangsserum Zurückgehaltene Fraktion	30 χ 10" ^ά 1 χ 10~³	33 χ 10""³ 1O⁶

Sie beträgt das 33-fache.

Die Immunelektrophorese gegen ein menschliches Immunserum-Antiserum zeigt eine wichtige Fraktion der Beweglichkeit von Albumin, zwei Bögen mit der Beweglichkeit von cc^-Globulin, einen Bogen der Beweglichkeit von cCp-Globulin ^jund einen Bogen mit der Beweglichkeit von ß .,-Globulin.

Die Immunsera-Anti-IGG, IGA und IGM zeigen keine Spur dieser drei Immunglobuline an.

Durch Elektrophorese bei einem p„-Wert von 3,9 zeigt sich überhaupt keine Zone anodischer Beweglichkeit.

Durch Diafiltrierung eines verdünnten Humanserums wird der Faktor, der in der Lage ist, die kontrahierende Wirkung von Histamin auf das isolierte Meerschweinchen-Ileum zu vermindern, zurückgehalten und zeigt sich als ein Protein mit einem Molekulargewicht oberhalb 100 000. Nach der Entfernung der Immunglobuline durch ein vorhergehendes Aussalzen mit Ammoniumsulfat zeigt sich das Phänomen der Polarisation der Membran deutlich,

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Chromatographie über Carboxymethylcellulose

A. Schweineserum
Verfahren

30 g Carboxymethylcellulose 52 in mikrogranulärer vorgequollener Form werden in einer 0,1 m Essigsäure/Acetat-Pufferlösung bei einem p_H-Wert von 4,2 dispergiert. Nach der Einstellung des Gleichgewichts bei p„ 4,2 wird das Gel in eine Chromatographiesäule mit einer Länge von 18 cm und einem Durchmesser von 1,5 cm eingebracht.

Die Probe wird durch 500 mg des bei der Diafiltration zurückgehaltenen Materials gebildet, und sie wird in dem Anfangspuffer gelöst und während 24 Stunden gegen den gleichen Puffer dialysiert.

Das Eluat wird nach der Aufzeichnung der optischen Dichte bei 240 nm in einem Fraktionssammler aufgefangen, wobei eine Pumpe den Eluatverbrauch auf 60 ml pro Stunde stabilisiert.

Nach der Einführung der zu untersuchenden Probe werden die folgenden Puffer nacheinander durch die Kolonne geführt:

Acetat/Essigsäure-Puffer 0,1 M, p_H 4,2

0,1 M, p_H 4,8 0,1 M, p_H 5,5

NaCl-Lösung IM

NaOH-Lösung 0,02 M

Die Veränderung des Puffers erfolgt, wenn das Eluat bei 240 nm nicht mehr absorbiert.

Die Fraktionen werden aufgeteilt, bei p_H 7,0 neutralisiert, dialysiert, konzentriert und gefriergetrocknet. Jede der so erhaltenen Proben wird pharmakologisch und immunoelektrophoretisch untersucht.

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2H0353

Ergebnisse

Von den fünf erhaltenen Fraktionen'ist nur diejenige aktiv, die durch den Kationenaustauscher nicht gebunden wurde.

Die Aktivitätseinheit beträgt 0,12 ng. Wenn man die Aktivitäten dieser Fraktionen vergleicht, stellt man eine Anreicherung um das 25-fache fest.

	X' ijaq)	l/x'img)
Serum Zurückgehaltenes Material Fraktion	1,67 3 χ 10"³ 0,12 χ 10~³	598 0,33 χ 10⁶ 8,30 χ 10⁶

Im Vergleich zu dem Ausgangsplasma beträgt die gesamte Anreicherung ausgehend von dem Serum das 13 000-fache.

Die Immunelektrophorese gegen ein Schweineimmunserum-Antiserum zeigt zwei Bogen verschiedener ,elektrophoretischer Beweglichkeit: den einen mit ß^-Globulinbeweglichkeit und den anderen mit Präalbuminbeweglichkeit.

Diskussion

Die Carboxymethylcellulose stellt einen Kationenaustauscher dar. Wenn man mit einem p_H~Wert von 4,2 beginnt, liegt die Mehrzahl der Proteine in Form von Kationen vor, die an dem Austauscher gebunden werden. Der untersuchte Faktor, der einen isoelektrischen Punkt bei einem p_H-Wert von 4,0 ί 0,1 besitzt, nimmt eine negative Ladung auf und wird nicht an dem Austauscher gebunden« Bei dieser Chromatographie-Art über Ionenaustauscher greift ein zweites Phänomen ein: die Affinität des Austauschers für verschiedene Kationen in Gegenwart von Protein und Na .

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2UQ35 3 ■

Da das Material eine größere Affinität für Na besitzt, ist eine Molarität von 0,1 M ausreichend, um eine teilweise Bindung des aktiven Wirkstoffs zu vermeiden und die Ausbeute des Verfahrens zu verbessern, ohne die Bindung der Proteinbestandteile mit einem isoelektrischen Punkt oberhalb p„ 4,2 zu stören.

Schlüsse

Dieses Chromatographie-Verfahren über Carboxymethylcellulose bestätigt den geringen Wert des isoelektrischen Punktes (4,0) des aktiven Wirkstoffs, der durch Elektrofokalisation bestimmt .wurde·

Chromatographie über Carboxymethylcellulose

B. Humanserum

Verfahren

Man wendet das gleiche Verfahren an, wie es oben bei der Untersuchung des Schweineserumfaktors verwendet wurde.

Die Probe wird durch 500 mg des gefriergetrockneten zurückgehaltenen Materials aus Humanplasma gebildet.

Ergebnisse

Die nicht durch den Austauscher bei einem p„-Wert von 4,2 gebundene Fraktion ist in der Lage, die biologische Aktivität des Histamins auf das isolierte Meerschweinchen-Ileum zu vermindern.

Bestimmung der histaminopexischen Wirkung

Die Fähigkeit einer Proteinfraktion, Histamin zu binden, wird durch die Bestimmung der kontrahierenden Wirkung von Histamin auf das isolierte Meerschweinchen-Ileum festgestellt.

Das Serum oder die Serumproteinfraktionen werden in physiologischer Flüssigkeit nach Tyrode gelöst, und die Konzentration wird derart berechnet, daß man 30/ug der Fraktion pro ml mit dem Organ in Berührung bringt.

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Bei reicheren Fraktionen und insbesondere bei der ultrareinen Fraktion geht man nach dem Verfahren der aufeinanderfolgenden Verdünnungen vor. Man trägt auf der Abszisse in logarithmischem Maßstab die reziproken Konzentrationen und auf der Ordinate die Prozentsätze des durch die untersuchte Probe ge-' bundenen Histamins auf. Man stellt fest, daß die maximale Wirkung sich bei Mengen, die in Abhängigkeit von den untersuchten Proben variieren, auf einem. Plateau hält, dann abnimmt und schließlich verschwindet.

Die systematische Bestimmung der Fähigkeit der Histaminbindung erfolgt derart, daß man sich im Bereich der maximalen Bindung befindet, d.h'. in dem Bereich des Plateaus. \

Durch eine Reihe von Verdünnungen beobachtet man, daß dieses Plateau bis zu einer Konzentration X aufrechterhalten wird, die einer histaminopexischen Einheit entspricht. Die Kurve verläuft dann linear, und die Aktivität verschwindet bei einer Schwellenkonzentration.

Das Vermögen der Histaminbindung wird im Prozentsatz des bei diesen wohldefinierten Verfahrensbedingungen gebundenen Histamins ausgedrückt. .

Die histaminopexische Wirkung des Serums eines normalen Indivi- ä duums, die durch die pharmakologische Untersuchung bestimmt wurde, beträgt im Durchschnitt 4000 Einheiten pro ml.

Die histaminopexische Wirkung von 2 ng der ultrareinen Fraktion entspricht einer Einheit. Die histaminopexische Wirkung der ultrareinen Fraktion beträgt daher 500 000 Einheiten pro mg.

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20	135	g
10	015	g
ο,	06	g
ο,		g
ο,	g
100	g

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Beispiele für pharmazeutische Formen

1. Creme

Glykoprotein, erhalten gemäß Beispiel 1 2

Ketostearylalkohol, der selbst-emulgierbar ist

und unter dem Namen "Emulcire 12 M" von der

Societe Gattefosse im Handel erhältlich ist 10

gesättigte fluide Triglyceride, unter dem Namen
"Labrafac 1349" von der Societe Gattefosse im
Handel erhältlich

Vaseline p-Hydroxybenzoesäuremethylester p-Hydroxybenzoesäurepropylester Polysorbat 80

Wasser auf

2. Salbe

Glykoprotein, erhalten gemäß Beispiel 1 2 ς

Vaselineöl 20 g

Vaseline Codex auf 100 g

3. Lösung

Glykoprotein, erhalten gemäß Beispiel 2 2g

Polysorbat 80 0,10 g

Natriumchlorid 0,9 g

Phenylquecksilbernitrat 0,002 g

Wasser auf 100 g

Dieses Material ist für äußere Anwendungen geeignet.

4. Suppositorien

Glykoprotein, erhalten gemäß Beispiel 2 20 mg

Polyathylenglykolsorbat (span 60) 3 mg

halbsynthetische Glyceride in der Menge, die für 1 Suppositorium

von 3 g erforderlich ist.

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5. Injizierbare Formulierungen

a) Glykoprotein, erhalten gemäß Beispiel 1 20 g Phsophatpuffer, p„ =8 soweit erforderlich destilliertes Wasser auf 5 Liter

Diese Lösung wird in 5000 Ampullen zu 1 ecm verteilt und durch Filtration in germicider Atmosphäre sterilisierte

b) Glykoprotein, erhalten gemäß Beispiel 2 50 g ■ Phosphatpuffer, p_H = 8 - soweit erforderlich destilliertes Wasser auf 100 Liter

Diese Lösung wird auf 10 000 Ampullen verteilt und durch aseptische Filtration sterilisiert«," "

6. Aero so1-Lösung

Glykoprotein, erhalten gemäß Beispiel 1 0,10 g

Isopropylmyristat 2 ecm

absoluter Alkohol auf 10 ecm ■

Diese Lösung wird in eine Aerosol-Druckflasche (Mikron 5) eingefüllt.

7. Sublingualtabletten

Glykoprotein, erhalten gemäß Beispiel 2

Polyvinylpyrrolidon 30 mg i

Glasierzucker Talkum

Magnesiumstearat Lactose

Dieses Material ist ausreichend für eine Tablette, die 125 ^mg wiegt.

25	mg
30	mg
30	mg
5	mg
5	mg
30	mg

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8. Gefrierqetrocknetes injizierbares Pulver

Glykoprotein, erhalten gemäß Beispiel 2 10 rag

Phosphatpuffer, p„ = 8 · soweit erforderlich

Mepivacainhydrochlorid 5 mg

Inosit 10 mg

Dieses Material ist für ein Mehrfachdosenfläschchen von 5 ecm geeignet.

Die pharmazeutischen Formen werden nach in der Pharmakotechnik üblichen Verfahren hergestellt.

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Claims

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- 25 Patentansprüche

1.) Glykoprotein aus menschlichem oder tierischem Serum mit einem isoelektrischen Punkt von 4 _ 0,2, durch Elektrofokalisierung bestimmt, mit einer elektrophoretisehen Präalbuminbeweglichkeit und einer Löslichkeit in Phytinsäure.

2.) Pharmazeutische Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als aktiven Wirkstoff die Verbindung gemäß Anspruch 1 und ein pharmazeutisch inertes Trägermaterial, das zur Verabreichung auf sublingualem, parenteralem, rektalem, topischem Weg oder über die Schleimhäute geeignet ist, enthalten. j

3.) Zusammensetzungen gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form von Sublingualtabletten,.in Form von Ampullen oder Mehrfachdosenfläschchen, in Form von Suppositorien, Cremes, Salben, Lotionen, Bronchialsprühmitteln, Nasentropfen oder Aerosolen vorliegen.

4.) Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich einen oder mehrere aktive Wirkstoffe mit unterstützender oder synergistischer Wirkung enthalten. -

5.) Verfahren zur Herstellung eines Glykoproteins gemäß Anspruch " 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die rohe aktive, durch Chromatographie über Sephadex-Gel G 200 erhaltene Fraktion von Humanserumproteinen einer Trennung durch Zonenelektrophorese mit Dichtegradienten unterzieht, man die histaminopexische aktive Fraktion mit einer Präalbuminbeweglichkeit isoliert und sie erneut einer Fraktionierung durch Elektrofokalisierung unterwirft, um die Fraktion abzutrennen, deren isoelektrischer Punkt zwischen 3,9 und 4,1 liegt.

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β_φ) Verfahren zur Herstellung des Glykoproteins gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Serumproteine tierischen Ursprungs einer selektiven Ausfällung durch Phytinsäure unterzieht, man die überstehende Flüssigkeit abtrennt, den trockenen Rückstand der Phytinsäurelösung durch Chromatogrpahie über Sephadex-Gel F 200 fraktioniert, die histaminopexische aktive Fraktion abtrennt, sie erneut durch Zonenelektrophorese mit Dichtegradienten fraktioniert, man dann die isolierte aktive Fraktion einer erneuten Fraktionierung durch Elektrofokalisierung unterzieht und die Fraktion, deren isoelektrischer Punkt zwischen 3,9 und 4,1 liegt, abtrennt.

7.) Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich eine Reinigung durch Diafiltrierung, gefolgt von einer Chromatographie über Carboxymethylcellulosegel, durchführt.

8.) Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich eine Reinigung durch Diafiltrierung, gefolgt von einer Chromatographie über Carboxymethylcellulosegel, durchführt.

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