DE2115674B2

DE2115674B2 - Vorrichtung zum aufsammeln und anschliessenden zuechten von mikroorganismen

Info

Publication number: DE2115674B2
Application number: DE19712115674
Authority: DE
Inventors: Charles P. Waltham; Rose Robert E. Chelmsford; Rising Donald B. Stow; Mass. Shaufus (V.StA.)
Original assignee: Millipore Corp., Bedford, Mass. (V.StA.)
Priority date: 1970-05-22
Filing date: 1971-03-31
Publication date: 1973-03-22
Also published as: IT943398B; DE2115674A1; GB1344140A; JPS5145671B1; SE389346B; US3741877A; CA956583A; FR2093616A5; DE2115674C3

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zum Aufsammeln und zur anschließenden Züchtung von Mikroorganismen mit einem Filter mit einer zur Zurückhaltung der Mikroorganismen geeigneten Porengröße.

Zur Untersuchung wäßriger Lösungen auf ihren mikrobiologischen Gehalt wird üblicherweise eine bestimmte Menge der zu untersuchenden Flüssigkeit durch ein Membranfilter gesaugt, das die Mikroorganismen auf der Filteroberfläche zurückhält. Dieses Filter wird dann in eine Agar oder eine mit Nährstoffen gesättigte Celluloselage enthaltende Petrischale überführt und die so präparierte Probe etwa Stunden lang oder auch kürzer oder länger inkubiert, bis sich die Mikroorganismen zu genügend großen Kolonien entwickelt haben, so daß sie unter dem Mikroskop sichtbar oder makroskopisch untersucht werden können. Bei entsprechender Einstellung der Nährstoffe und Inkubationsbedingungen können die Organismen nach ihrem Wachstum, ihrer Farbe oder anderen visuell bestimmbaren Eigenschaften identifiziert werden.

Dieses Verfahren erfordert einen gewissen apparativen Aufwand und die strenge Beachtung von Sterilitätsbedingungen, wobei trotzdem das Kontaminationsrisiko recht erheblich ist.

Zur Vereinfachung wurde bereits ein Verfahren entwickelt, bei dem ein in einem Folienbeutel steril verpackter Streifen saugfähigen Papiers mit einem (durch entsprechende Perforation) leicht abtrennbaren Ende für die Probenahme und gleichzeitig für

ίο die Züchtung der Mikroorganismen dient (s. USA.-Patentschrift 2 904474). Für die praktische Durchführung des Verfahrens wird der mit Nährstoffen für Mikroorganismen imprägnierte Streifen unter Benatzung des abtrennbarem Endes aus dem Beutel entnommen, zur Probenahme in die zu prüfende Flüssigkeit getaucht und nach Einsaugen einer bestimmten Flüssigkeitsmenge unter gleichzeitiger Abtrennung des durch die Finger des Benutzers kontaminierten Endes wieder in den Beutel zurückge-

ao bracht, wo die Züchtung bzw. Entwicklung der aufgesammelten Keime stattfindet.

Dieses zwar recht einfache und völlig ortsunabhängige Verfahren erfordert noch eine gewisse Geschicklichkeit vom Benutzer, und die relativ geringe mechanische Festigkeit und recht begrenzte Aufnahmefähigkeit dünner Papiere bilden einen gewissen Mangel dieser Technik.

Gemäß einer Ausführungsvariante wird daher bereits in der genannten USA.-Patentschrift sin beidseits mit einem dünnen Filter bedeckter stärkerer Streifen aus saugfähigem Material vorgesehen, dessen Ränder mit wasserundurchlässigem Material abgedichtet sind.
Es hat sich nun gezeigt, daß auch diese letztgenannte Anordnung noch gewisse Mangel besitzt, die insbesondere daher rühren, daß die zu Beginn im saugfähigen Material enthaltende Luft nicht immer restlos entweicht und sich Lufttaschen bilden können. Daraus ergibt sich zum einen eine Unsicherheit hinsichtlich der quantitativen Auswertung der Ergebnisse und zum anderen ein unvollkommenes Inlösunggehen der im Material enthaltenen Nährstoffe, so daß das Bakterienwachstum beeinträchtigt sein kann.

Ziel der Erfindung ist daher eine möglichst einfach zu benutzende Anordnung, die eine verläßliche Auswertung der Ergebnisse gestattet.

Die zu diesem Zweck entwickelte erfindungsgemäße Vorrichtung der eingangs genannten Art ist gekennzeichnet durch einen Halter, in dessen Aussparung eine an sich bekannte, durch flächenhafte flüssigkeitsdurchlässige Verbindung des Filters mit einem Nährstoffe für die Mikroorganismen enthaltenden Absorptionskissen oder -polster gebildete Einheit derart festgelegt ist, daß bei einer Probenahme nur die F'ilterseite mit Flüssigkeit in Kontakt kommt, und dessen Aussparung eine öffnung zur Verbindung mit der äußeren Atmosphäre aufweist. Vorzugsweise ist am Halter eine Handhabe und/ oder ein Abdicht- oder Abschlußmittel am Halter für eine Bebrütungskammer, wobei an der Handhabe des Halters dann ein Anschlag angeordnet ist. Vorteilhaft enthält das Absorptionskissen Gelatine oder sind Filter und Kissen durch ein hydrophiles, eine poröse Haftschicht bildendes Haftmittel mer in zerlegte Form.

Das Kissen besteht in bevorzugter Ausführungsform aus Cellulose.

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Von Vorteil ist eine am Umfang der Aussparung wärmeempfindlichen Polymermaterial, wie Polyvorstehende Wand oder Umrahmung mit einem äthylen oder Polypropylen, gefertigt sein.
Schmelzpunkt unter etwa 150° C. Der Halter 4 dient nicht nur zur Festlegung von

Eine flächenhafte Verbindung von Filter und Kis- Kissen und Filter, sondern auch für die bequeme

sen wird beispielsweise mit einem permeablen Leim 5 und leichte Überführung des Filters in eine Inku-

erreicht, wie es in der österreichischen Patentschrift bationskammer und zur Versiegelung bzw. zu einem

252449 für die Verbindung von scheibenförmigen dichten Abschluß darin, ohne daß das Filter selbst

Trägern für einen Farbindikator und für eine auf berührt werden muß. Dabei wird der Halter 4 an

Bakterienbeständigkeit zu prüfende chemische Sub- seinem Ende 9 ergriffen und in die Inkubationskam-

stanz angegeben ist. _{10 me}rl0 überführt, wobei das Ende 11 des Halters

Der Halter ist also mit einem Handgriff versehen, als erstes durch die öffnung 12 in die Inkubationsso daß das Filter während der Probenahme und kammer 10 eingeführt wird. Ein Abdicht- oder AbÜberführung zum Inkubationsraum nicht vom Be- Schlußmittel 13 auf dem Halter 4 wirkt mit der innedienungspersonal berührt zu werden braucht, und ren Oberfläche der öffnung 12 zusammen und bildet zwar ohne daß zusätzliche Hilfsmittel erforderlich 15 einen dichten Abschluß gegenüber der äußeren Atwären. Biosphäre. Ein Anschlag 15 verhindert ein zu weites

Zur Probenahme wird die im Halter fest unter- Vordringen des Halters in die Inkubationskammer gebrachte Einheit aus Filter and Kissen entspre- und garantiert einen ständigen Kontakt zwischen Abchend lange in die zu analysierende Lösung getaucht. dichtmittel 13 und Öffnung 12 während der Inkubadaß die Flüssigkeit durch Kapillarwirkung durch 20 tion. Auf diese Weise wird ein dichter Abschluß das Filter hindurch in das Kissen eintreten bzw. ein- während der gewählten Inkubationsdauer aufrechtgesaugt werden kann. Eine im Halter vorgesehene, erhalten.

mit der Unterseite des Kissens in Verbindung ste- Das Kissen oder Polster 2 wird entweder vor oder

hende öffnung sorgt dafür, daß die Kapillarwirkung nach der Verbindung von Kissen und Filter mit

nicht (durch Rückstau von Luft) behindert wird. Die 25 Nährstoffen imprägniert. Die Nährstoffe sollten be-

Filterporen ermöglichen den Durchtritt der Flüssig- ständig sein, d. h. insbesondere im trockenen Zu-

keit, während die Mikroorganismen auf der Filter- stand nicht gut oxydierbar und nach Vereinigung

oberfläche zurückgehalten werden. Nach Aufsam- mit der durch das Filter zutretenden Flüssigkeit für

mein der mikrobiologischen Probe wird die gesamte das Wachstum der Mikroorganismen auf dem Filter

Anordnung aus der Flüssigkeit entfernt und in eine 30 zur Verfügung stehen. Das flüssige Medium über-

Inkubationskammer gebracht, in welcher sie gegen- nimmt dann die Rolle des Zulieferanten der Nähr-

über der umgebenden Atmosphäre dicht abgeschlos- stoffe zur Filteroberfläche und ermöglicht auf diese

sen gehalten wird. Diese Abdichtung kann durch Weise das Wachstum der Mikroorganismen auf dem

einen am Halter vorgesehenen Vorsprung erreicht Filter. Im Kissen kann irgendein derzeit in einei

werden, der mit einer entsprechenden öffnung der 35 beständigen trockenen Form erhältliches Nährme-

Inkubationskammer dicht zusammenpaßt. dium verwendet werden. Dieses Nährmedium kann

Nachfolgend wird die Erfindung mehr im einzel- auch Indikatorfarben enthalten, die in allgemein be-

nen an Hand eines Beispiels unter Bezugnahme auf kannter Art und Weise wirken. Im allgemeinen wer-

die Zeichnungen beschrieben. Diese zeigen den Hai- den durch diese Farben in den Kolonien infolge des

ter. das Kissen, das Filter und die Inkubationskam- 40 Stoffwechsels der Organismen in wohlbekannter

mer in zerlegbarer Form. Weise Anfärbungen erzeugt. Das Kissen kann auch

Wie man sieht, ist das Filter 1 mit einem Absorp- mit Gelatine imprägniert werden, um die Wandetionskissen oder -polster 2 zu einer Einheit verbun- rung der Nährstoffe während der Probennahme bzw. den. Diese Vereinigung von Filter und Saug- bzw. Aufsammlung der Mikroorganismen zu vermindern. Nährpolster soll jedoch den Durchtritt von Flüssig- 45 Wenn das Filter in die zu analysierende Lösung keit durch die Oberfläche des Filters in das Polster getaucht wird, wandert die Lösung durch Kapillarhinein nicht unterbinden. Die in der Zeichnung dar- wirkung durch das Filter in das Kissen bzw. Sauggestellte Anordnung ist für die Aufnahme von zwei polster hinein. Dabei wird keine andere äußere Kraft getrennten Filter-Kissen-Einheiten eingerichtet. Jede benötigt, um die Abscheidung von Mikroorganismen Filter-Kissen-Einheit paßt dabei in eine Aussparung 3 50 auf der Filteroberfläche zu erreichen, die dort durch im Halter 4. Die beiden Aussparungen haben jeweils van der Waalsche Kräfte zurückgehalten werden,
eine Öffnung 5, die über eine Leitung 6 und eine Die Mittel zur Verbindung von Filter und Kissen Öffnung 7 mit der äußeren Atmosphäre in Verbin- bzw. Saug- oder Nährstoffpolster sollten daher die dung steht. Während der Probenahme, wenn Filter als antreibende Kraft dienende Kapillaiwirkung nicht und Kissen in die wäßrige Lösung eintauchen, tritt 55 wesentlich einschränken. Demgemäß ist das für die nun die Flüssigkeit durch das Filter 1 in das Kissen 2 Verbindung verwendete Haftmittel porös, um den ein, und die Luft im Kissen 2 wird durch die Lösung Durchtritt der Flüssigkeit zu ermöglichen. Weiter ist verdrängt und über die Öffnung 5, die Leitung 6 und es für die Prüfung wäßriger Lösungen erwünscht, die Ausgangsöffnung 7 abgegeben. Filter und Kissen daß das Haftmittel bzw. der Kleber selbst eher hywerden in der Aussparung 3 mittels einer Wand oder 60 drophil als hydrophob ist, was die Kapillarwirkung Umrahmung 8 zurückgehalten, welche die Ausspa- weiter fördert. Ein besonders geeignetes Haftmittel rung 3 umgibt. Nach Einsetzen des Filters in die wird durch Polymerfasern gebildet, die bei relativ Aussparung kann die Wand oder Umrahmung 8 niedrigen Temperaturen angeschmolzen werden köndurch Wärmebehandlung zum Schmelzen gebracht nen. Die Fasern bilden dann eine poröse Schicht, die werden, so daß sie sich über den äußeren Umfang 65 sowohl am Saugpolster als auch am Filter unter Bildes Filters ausbreitet bzw. über diesen übergreift, dung einer zusammenhängenden Einheit haftet. Die und dann abgekühlt werden. Die Wand oder Um- Verbindung kann leicht durch Warmversiegeln von rahmung 8 und der Halter 4 können so aus einem Kissen und Filter unter Druck entweder in einer

Platten- oder Walzenpresse oder im Spalt eines Walzsystems erreicht werden. Die dabei angewandte Temperatur sollte nicht so hoch sein, daß die Porösität des Filters abnimmt oder das (gegebenenfalls bereits im Kissen enthaltene) Nährmedium abgebaut wird. Im allgemeinen wird die Warmversiegelung bei einer Temperatur zwischen etwa 100 und 150⁰C vorgenommen.

Die Größe der Filter-Kissen-Einheit und der entsprechenden Aussparung, in welche die Einheit eingepaßt wird, hängt von der ungefähren Menge der Flüssigkeit ab, die zur Aufsammlung geeigneter Mengen an Mikroorganismen durch das Filter »gesaugt« werden soll. Wenn beispielsweise etwa 1 ml Lösung durch das Filter geschickt werden soll, hat die Filtereinheil eine Fläche von etwa 10,3 cm² und eine Dicke von etwa 1,6 mm (im trockenen Zustand).

Um zu gewährleisten, daß die gesamte wäßrige Lösung durch das Filter hindurch in das Kissen eintritt, ist der Umfang des Filters versiegelt bzw. dicht, ao so daß ein sofortiger unmittelbarer Kontakt desselben mit der Lösung verhindert wird. Das kann einfach und schnell dadurch erreicht werden, daß die Wand bzw. Umrahmung der Aussparung, in welche die Filtereinheit eingesetzt wird, erwärmt wird, so daß das umgebende Material schmilzt und eine Versiegelung bildet, die lediglich einen geringen Teil der Filteroberfläche am Umfang abdeckt. Dieses Verfahren zur Versiegelung des Umfangs wird bevorzugt, da die Kunststoffzusammensetzung das Saugpolster nicht benetzt und daher nicht in dieses eindringt.

Als Filtermaterial kann irgendein geeignetes Material, einschließlich von porösen Celluloseestern, wie Cellulosenitrat, Celluloseacetat oder Mischungen derselben, verwendet werden. Diese Filter haben im allgemeinen eine Porengröße zwischen etwa 0,1 und 0,8 μ und sind im Handel erhältlich.

Zu geeigneten Materialien für das Kissen bzw. Saug- oder Nährpolster gehören Cellulose, vorzugsweise Cellulose auf Baumwollbasis oder andere nichttoxische, absorbierende, hydrophile Materialien.

Beim Gebrauch wird die Einheit aus Kissen und Filter an der Handhabe 9 des Halters 4 ergriffen und (ohne daß die Lösung vom Bedienungspersonal berührt wird) für eine genügend lange Zeit in die zu analysierende wäßrige Lösung getaucht, so daß sich das Kissen mit wäßriger Lösung sättigt. Dieser Vorgang erfordert im allgemeinen weniger als 1 Minute, üblicherweise etwa 30 Sekunden. Der Halter mit Filter und Saugpolster wird dann aus der Lösung entfernt und in eine Inkubationskammer gebracht bzw. gesteckt, in der sich auf dem Filter vorhandene Mikroorganismen entwickeln. Ein angemessenes Wachstum für eine visuelle Überprüfung der Kolonien erfolgt üblicherweise innerhalb von 18 Stunden. Vorzugsweise wird die Inkubation in weniger als etwa 48 Stunden beendet, da (ohne Bereitstellung von Feuchtigkeit) das Wasser aus dem Saugpolster verdampft, wodurch der Nährstoffnachschub für das Wachstum der Mikroorganismen unterbrochen wird. Das folgende Beispiel dient zur weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel

Es wurde eine Filter-Kissen-Einheit durch Schichtverbindung eines Cellulosefaserpolsters von etwa 1,6 mm Dicke mit einem handelsüblichen Filter einer mittleren Porengröße von etwa 0,45 μ hergestellt. Die Schichtverbindung erfolgte durch Einschaltung von Chemiefasern aus Polyvinylchlorid-Polyacrylnitril-Mischpolymerisaten und Polyesterfasern zwischen Filter und Faserpolster und Warmverbindung zwischen erwärmten Walzen oder Platten. Die erhaltene Einheit wurde auf eine Größe geschnitten, die in die Aussparung eines Polyäthylenhalters der in der Zeichnung dargestellten Form paßte.

Vor der Schichtverbindung wurde das Cellulosepolster mit einem Nährmedium gesättigt, das durch eine wäßrige Lösung folgender Zusammensetzung gebildet wurde:

Soja-Nährbouillon 60 g/l

Hefe-Extrakt 5 g/l

Gekörnte Gelatine 12 g/l

Die Gelatine wurde zugegeben, um die Wanderung des Nährmediums während der Wiederbefeuchtung zu vermindern.

Die Zusammensetzung gemäß Aufstellung wurde zur Auflösung in einem Wasserbad unter Rühren gelind auf 60^c C erhitzt. Die Lösung wurde dann im Autoklav 15 Minuten lang bei 121° C gehalten. Das Saugpolster wurde in die Lösung getaucht und etwa 1 Minute lang damit getränkt und dann wieder daraus entfernt. Der Überschuß wurde abtropfen gelassen und das Saugpolster dann auf einem mit Nylon bedeckten Gerüst 24 Stunden lang bei 28⁰C getrocknet.

Die Filter-Kissen-Einheit wurde in die Aussparung des Halters eingesetzt und dessen Wand durch eine Platte oder Walze zum Aufschmelzen des Polyäthylens erwärmt, das so eine Versiegelung des Umfangs des Saugpolsters bildete.

Die vorstehend beschriebene Anordnung wurde zur Prüfung von Wasser auf Mikroorganisrr.cn verwendet. Dazu wurde sie so in einen 100-ml-Becher gebracht, daß der Flüssigkeitsspiegel der Wasserprobe gerade eben die Filteroberfläche bedeckte. Die Anordnung wurde dann 1 Minute lang in der Flüssigkeit belassen; während dieser Zeit wurden Luftblasen beobachtet, die von der öffnung des Halters ausgehend durch die Flüssigkeit perlten. Die Einheit wurde dann 24 Stunden lang in einer befeuchteten Kammer bei 35° C inkubiert. Nach dieser Inkubationsperiode wurde das Wachstum der Mikroorganismen auf dem Filter untersucht

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Vorrichtung zum Aufsammeln und zur anschließenden Züchtung von Mikroorganismen mit einem Filter mit einer zur Zurückhaltung der Mikroorganismen geeigneten Porengröße, gekennzeichnet durch einen Halter(4), in dessen Aussparung (3) eine an sich bekannte, durch nachenhafte flüssigkeitsdurchlässige Verbindung des Filters (1) mit einem Nährstoffe für die Mikroorganismen enthaltenden Absorptionskissen oder -polster (2) gebildete Einheit derart festgelegt ist, daß bei einer Probenahme nur die Filterseite mit Flüssigkeit in Kontakt kommt, und dessen Aussparung (3) eine Öffnung (5 bis 7) zur Verbindung mit der äußeren Atmosphäre aufweist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Handhabe (9) am Halter (4).

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch ein Abdicht- oder Abschlußmittel (13) am Halter (4) für eine Bebrütungskammer (10).

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch einen Anschlag (15) an der Handhabe (9) des Halters (4).

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Kissen (2) Gelatine enthält.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Filter (1) und Kissen (2) durch ein hydrophiles, eine poröse Haftschicht bildendes Haftmittel miteinander verbunden sind.

7. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Absorptionskissen (2) aus Cellulose besteht.

8. Vorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine am Umfang der Aussparung (3) vorstehende Wand oder Umrahmung (8) mit einem Schmelzpunkt unter etwa 150° C.