DE2104991C3 - Verfahren zur Herstellung von Pyroglutamylhistidylprolinamid - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von PyroglutamylhistidylprolinamidInfo
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Description
aktiven Ester der Pyroglutaminsäure in einem 1522) in Gegenwart von Triäthylamin mit Dicyclo-
inerten polaren Lösungsmittel gekuppelt wird. hexylcarbodiimid als Kupplungsreagenz und nachfolgende
Entfernung der Schutzgruppe aus dem er-
lo haltenen tert-Buryloxycarbonylhistidylprolinamid
mit Chlorwasserstoffsäure in einem Ätherlösungsmittel unter Bildung von Histidylprolinamidhydrochlorid
hergestellt werden. Das Zwischenprodukt tert.-Butyl-
Der neue erfindungsgemäße synthetische Weg zur oxycarbonylhistidylprolinamid kann leicht durch einHerstellung
von Pyroglutamylhistidylprolinamid führt 15 fache und Standard-Chromatographieverfahren unter
in zwei Stufen zu einer ausgezeichneten Ausbeute an Verwendung einer Silicagelkolonne mit Methanolhochwirksamen
Produkt. Das neue Verfahren ver- Chloroform als Eluiermittel gereinigt werden; die
wendet freies Histigylprolinamid als Ausgangsmate- Reinigung des Zwischenproduktes ist ausreichend,
rial und einen aktiven Ester der Pyroglutaminsäure um das Dipeptid von annehmbarer Qualität für die
als Coreaktionsmittel. 20 Synthese von TRH herzustellen. Als Lösungsmittel
In Veröffentlichungen der jüngsten Zeit wurden für die Spaltung der tert.-Butyloxycarbonylgruppe
Theorien entwickelt, daß die Struktur des Thyreotro- können Äthyläther, Tetrahydrofuran, Äthylacetatpinfrcigabefaktors
oder -hormons (im folgenden ein- dioxan oder ähnliche Äther verwendet werden; gefach
als TRH bezeichnet) der von Pyroglutamylhisti- eignete Säuren für diese Stufe sind Bromwasserstoffdylprolinamid
entspricht. TRH ist ein äußerst wert- 35 säure, Trifluoressigsäure, Ameisensäure und dergleivolles
Arzneimittel und Laboratoriumshilfsmittel, das chen.
insbesondere bei der Analyse der Hypophysefunk- In einer einfachen Kondensationsreaktion wird das
tionen wirksam ist. Histidylprolinamid mit einem aktiven Ester der Pyro-
THR kann halbsynthetisch unter Verwendung des glutaminsäure, wie beispielsweise Trichlorphenylpy-
Tripeptids Glutamylhistidylprolin als Ausgangsma- 30 roglutamat, direkt unter Erzeugung des gewünschten
terial hergestellt werden. Dieses Verfahren ist offen- Tripeptids gekuppelt,
sichtlich kostspielig, da es nur in sehr geringen Men- R . . .
sichtlich kostspielig, da es nur in sehr geringen Men- R . . .
gen aus natürlichen Quellen zur Verfugung steht. ο e 1 s ρ ι e
Beispielsweise beträgt die Ausbeute aus 165 000 a) Eine Lösung aus 1,275 g tert.-Butyloxycar-
Schweine-Hypothalami-Mengen etwa 4,4 mg, was 35 bonylhistidin und 0,831 g Prolinamid-hydrochlorid
eindeutig die Notwendigkeit eines praktisch durch- in 20 ml Dimethylformamid wurde mit 0,7 ml Tri-
führbaren synthetischen Weges darlegt. Auch ist die äthylamin behandelt. Zu der kalten Lösung (° C)
Reinheit des aus natürlichen Quellen extrahierten wurden 1,032 g Dicyclohexyldicarbodiimid zugege-
Produktes hinsichtlich der Anwendung eines Arz- ben. Nach 16 Stunden wurde der gebildete Dicyclo-
neimittels für Schilddrüsenerkrankungen fraglich. 40 hexylharnstoff abfiltriert, und das Filtrat wurde im
Synthetische Methoden, ausgehend von den ein- Vakuum bei 40° C eingedampft. Das restliche öl
zelnen Aminosäuren wurden auch versucht, ließen wuirde in einem kleinen Volumen 5°/oigem Methanol
jedoch viel zu wünschen übrig; beispielsweise erfor- in Chloroform aufgenommen und durch eine mit 20 g
dem die derzeit vorgeschlagenen Methoden viele Silicagel (Korngröße 177 bis 44 μ (70-325 mesh; Akti-
Stufen zum Schutz bestimmter Gruppen innerhalb 45 vität 2-3) in Chloroform gepackte Kolonne, von
der Moleküle, welche an der Reaktion teilnehmen. 20 X 2,5 cm gegeben. Die Kolonne wurde mit Me-
Nach jeder Reaktionsstufe müssen die Schutzgruppen thanol/Chloroform (Verhältnis 1:19, später 3 :17,
in einem gesonderten Verfahren entfernt werden. bezogen auf das Volumen) eluiert, wobei gesonderte
Eine klassische Methode zur Herstellung des ge- 5 ml Fraktionen des Eluats gesammelt wurden. Die
wünschten Tripeptids bedingt also die Anwendung 50 5%igen Methanolfraktionen wurden zur späteren
von 2 bis 3 »Schutz«-Stufen für Aminosäure-Aus- Bestimmung aufgehoben. Die 15°/oigen Fraktionen
gangsmaterialien, zwei wesentliche Reaktionsstufen wurden durch Dünnschichtchromatographie analy-
und 2 bis 3 Stufen zum Entfernen der Schutzgruppen, siert, und ausgewählte Fraktionen wurden vereinigt
wobei Reinigungsstufen für jedes Zwischenprodukt und unter Erzielung von 1,047 g (58°/o) eines
erforderlich sind. Diese Reinigungen sind besonders 55 schaumigen Feststoffs, der nicht aus einem organi-
lästig und sollten in einem praktischen synthetischen sehen Lösungsmittel kristallisiert werden konnte, ein-
Verfahren auf eine Minimalzahl herabgesetzt werden gedampft. Er wurde als tert.-Butyloxycarbonylhisti-
und sollten so erfolgen, daß sie in einfacher Weise dylprolinamid identifiziert; [a]^3—46° (Konzentra-
und mit geeigneten Materialmengen durchgeführt tion: l°/oig in Wasser),
werden können. 60 b) Eine Lösung aus 0,447 g des Produktes nach
werden können. 60 b) Eine Lösung aus 0,447 g des Produktes nach
Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, ein Syn- Beispiel a) in 4 ml Dioxan wurde mit 12 ml
theseverfahren zur Herstellung von TRH zu liefern, 4-molarer Chlorwasserstoffsäure in Dioxan bei
das in einer einzigen Stufe ohne die Notwendigkeit Raumtemperatur behandelt. Es trennte sich unmittel-
von Schutzgruppen an irgendeinem Reaktionsmittel bar ein weißer Feststoff ab. Nach 30 Minuten wurdurchgeführt
werden kann. 65 den 100 ml Äthyläther zugegeben, das Überstehende
Die Aufgaben der Erfindung werden durch ein dekantiert und das feste Material durch Dekantieren
Verfahren zur Herstellung von Pyroglutamylhistidyl- mit vier weiteren 150 ml Portionen Äther gewaschen,
prolinamid gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, Der feste Rückstand wurde im Vakuum über Phos-
phorpentoxyd und Kaliumhydroxyd getrocknet, an- Verhältnis von 2:1, bezogen auf das Volumen, elu-
schließend in Methanol gelöst, und die Lösung wurde iert, wobei 5 ml Fraktionen getrennt gesammelt wur-
mit einem basischen Ionenaustauschharz in der Hy- den und durch Dünnschichtchromatographie über-
droxyform behandelt Das Lösungsmittel wurde un- prüft wurden.
tei vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand 5 Die geeigneten Fraktionen (festgestellt durch
wurde in einem Exsicator über Phosphorpentoxyd Dünnschichtchromatographie) wurden zusammengegetrocknet.
Dünnschichtchromatographie zeigte, daß geben und zur Trockene eingedampft. Nach dem
der Rückstand eine einzige Verbindung war, und die Trocknen im Vakuum über Phosphorpentoxyd wog
Elementaranalyse ergab, daß die Verbindung das der feste weiße Rückstand 358 mg (78%). Dieses
gewünschte Histidylprolinamid war. Es wurde fest- io Material war homogen, was sich durch Papierchromagestellt,
daß die zwei Aminosäurekomponenten in tographie, Dünnschichtchromatographie und Elektroeinem
MoIrVerhältnis von 1:1 vorlagen. Jedoch phorese zeigte. Massenspektrometrie einer in Metha-Versuche
zur Kristallisation dieses Materials waren nol gelösten Probe zeigte bei 70 eV kein Molekulanicht
erfolgreich. rion an, jedoch wurde bei 50 eV ein Molekularion
c) Eine Lösung aus 1,291 g Pyroglutaminsäure 15 mit m/e 363 ermittelt. Das kernmagnetische Resound
2,633 g Pentachlorphenol in 20 ml Dimethyl- nanzspektrum zeigte das erwartete Muster für Pyroformamid
wurde bei 0° C mit 2,063 g Dicyclohexyl- glutamylhistidylprolinamid.
carbodiimid behandelt. Nach 16stündigem Rühren Der vorstehende Syntheseweg zur Herstellung von
wurde die Suspension unter Entfernung des gebil- Pyroglutamylhistidylprolinamid kann unter Verwendeten
Dicyclohexylharnstoffs filtriert und das Filtrat 20 dung dei L- oder D-Formen irgendeiner der Komim
Vakuum bei 40° C eingedampft. Der feste Rück- ponenten durchgeführt werden. Nach der bevorzugstand
wurde mit kaltem Äthylacetat behandelt und ten Ausführungsform werden die L-Fcrmen verwenfiltriert,
wobei 2,2 g eines weißen Feststoffs erhalten det, da sie zu dem aktiven TRH-Material führen. Aus
wurde, der bei 180 bis 184° C schmolz. Nach Um- diesem Grund ist das bevorzugte Material der Erfinkristallisation
aus Äthylacetat wurden 2,0 g (54°/o) 35 dung das L-Histidyl-L-prolinamid.
reines Pentachlorphenylproglutamat erhalten, FP196 Die Reaktionsteilnehmer für die Kupplung des bis 1990C, [x]f +21° (Konzentration: 2%ig in Di- Dipeptids mit TRH werden vorzugsweise in einem methylformamid). Mol-Verhältnis von 1:1 verwendet, jedoch ergibt
reines Pentachlorphenylproglutamat erhalten, FP196 Die Reaktionsteilnehmer für die Kupplung des bis 1990C, [x]f +21° (Konzentration: 2%ig in Di- Dipeptids mit TRH werden vorzugsweise in einem methylformamid). Mol-Verhältnis von 1:1 verwendet, jedoch ergibt
Das nach Beispiel b) erhaltene Dipeptid wurde in ein lOO°/oiger Überschuß eines Reaktionsmittels kei-2
ml Dimethylformamid gelöst, und 0,481 g Penta- 30 nen nachteiligen Einfluß. Die Reaktion wird in einem
chlorphenylglutamat wurden zugegeben. Man ließ die inerten polaren Lösungsmittel, beispielsweise Dimeerhaltene
Lösung 16 Stunden stehen. Das Verschwin- thylformamid, Dimethylacetamid, Dioxan, Tetrahyden
des freien Dipeptids wurde durch Dünnschicht- drofuran, Pyridin durchgeführt. Die Reaktion kann
Chromatographie festgestellt. Die Lösung wurde zu bei einer Temperatur von 15 bis 40° C erfolgen und
einem öl konzentriert, das durch Säulenchromato- 35 schreitet in zufriedenstellender Weise bei Raumgraphie
auf einer mit 20 g Silicagel gepackten Ko- temperatur fort, bei der sie nach mehrstündigem Stelonne
von 20 X 2,5 cm gereinigt wurde. Die Probe hen zu Ende geführt wird. Etwas erhöhte Temperawurde
als eine Lösung in Methanol/Chloroform im türen, beispielsweise 35° C, können zur Beschleuni-Verhältnis
1:2, bezogen auf das Volumen, ange- gung der Reaktion verwendet werden, oder es kann
wendet und mit diesem Lösungsmittelsystem in einem 40 zum gleichen Zweck gerührt werden.
Claims (1)
1 2
daß das Dipeptidhistidylprolinamid mit einem aktiven
Patentanspruch: Ester der Pyroglutaminsäure in Gegenwart eines
inerten polaren Lösungsmittels gekuppelt wird. Das
Verfahren r.ir Herstellung von Pyroglutamyl- obige Dipeptidamid kann leicht durch Kupplung von
histidylprolinamid, dadurch gekenn- 5 tert.-Butyloxycarbonylhistidin mit Prolinamidhy-
zeichnet, daß Histidylprolinamid mit einem drochlorid (Chambers et al., J. A. C. S. 77, 1955,
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US870070A | 1970-02-04 | 1970-02-04 | |
| US870070 | 1986-06-03 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2104991A1 DE2104991A1 (de) | 1971-08-26 |
| DE2104991B2 DE2104991B2 (de) | 1976-01-29 |
| DE2104991C3 true DE2104991C3 (de) | 1976-09-09 |
Family
ID=
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