DE2047704C3 - - Google Patents

Description

_kef_n J₅₁ rung gegenüber einer Zentrifuge mit einer

Kammer erreicht.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Zentrifugierverfahren so auszubilden, daß die

60 schwere Fraktion, insbesondere Viren, weitgehend

geschont werden. Dabei soll gegebenenfalls die Virusfraktion in leicht löslicher unverhärteter (dickflüssiger oder pastöser) Form gewonnen werden.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Zentri- Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß eine Zentrifugieren einer spezifisch schwerere Partikeln enthal- 65 fuge stufenweise mit ansteigender Drehzahl1 betrieben tenden Flüssigkeit, insbesondere zum schonenden wird, wobei in einer ersten Stufei ±e Trennkammeni Abtrennen von Viren, wobei das Schleudergut in gegeneinander abgeschlossen sind und m den folgenmehreren konzentrisch radial liintereinanderliegen- den Stufen der jeweils inneren Trennkammer die

nach außen benachbarte durch öffnen eines Ventils dem Durchgang zugeleitet und sammelt sich in der

in der Zwischenwand zugeschaltet wird, und daß die Sammelrinne 10. Der Querschnitt des Durchganges

Höchstdrehzahl im ultrazentrifugalen Drehzahlbereich soll möglichst klein sein, z. B. 0,5 mm.

liegt _Λ, _t u ■ ^^er Winkel der Wände 3 zur Rotationsachse 30,

Bei diesem Verfahren sind die Trennwege relativ S insbesondere der Neigungswinkel der der Rotations-

kurz, so daß auch die Zentrifupierzeit, während der fläche zugewandten Oberfläche, beträgt mehr als 0°

das Material schädigenden Kräften ausgesetzt ist, und weniger als 90°, und zwar 20° im gezeigten

kurz gehalten werfen kann. Ausführungsbeispiel.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Er- Durch die Wände 3 wird die Kammer in enge,

findung wird die Höchstdrehzahl so gewählt, daß das io ringförmige Kammern unterteilt Dadurch wird die

gefällte Produkt in dickflüssiger oder pastöser Form Fällungsstrecke senkrecht zur Rotationsachse nach

anfäVt außen verkürzt Diese Fällungsstrecke beträgt z.B.

Zur Durchführung des Verfahrens weist eine Zen- weniger als ein Viertel der gezeigten Querschnitts-

trifuge mit einer vollwandigen Schleudertrommel, länge der Wände 3 (vom Boden der Kammer bis zum

z. B. zum schonenden Abtrennen von Viren aus einer 15 Durchgang gemessen).

Flüssigkeit, mehrere konzentrische, radial hinterein- Im Bereich der Sammelrinne 10 befindet sich ein anderliegendeTrennkammern mit radial außenliegen- Dichtungsring 17 aus elastischem Material, z. B. den Fällu-gs- oder Sammelflächen auf, welche radial Gummi, zwischen dem Rotor 1 und dem Deckel 4. nach außen entleert werfen können, und ist gemäß Der Rotor ist entsprechend ausgespart. Der Ring 17 der Erfindung so ausgebildet, daß die Trennkammem ao besitzt einen elastischen Flansch 18, der sich nach untereinander durch unter der Einwirkung einer be- Überschreitung einer bestimmten Rotationsgeschwinstimmten Zentrifugalkraft radial nach außen selbst- digkeit vom Rand 19 zwischen der Kammer 2 und tätig öffnende Ventile veibunden sind, wobei die der Rinne 10 abhebt und dann den Durchfluß der erforderliche Zentrifugalkraft mit dem radialen Ab- schweren Fraktion in die Rinne 10 gestattet. Beim stand des Ventils von der Trommelachse ansteigt. »5 Abbremsen des Rotors kehrt der Flansch 18 wieder Besonders zweckmäßig ist es, zum Auffangen der in seine ursprüngliche Lage zurück, sperrt somit die abzuscheidenden Teilchen den Ventilen Filterstrei- Rinne 10 gegen die Kammer 24 ab und verhindert fen, z. B. Filtergewebestreifen, zuzuordnen. damit die Vermischung der Fraktion mit der Rest-Imbevorzugten Verfahren wir die Höchstdrehzahl π Flüssigkeit. Die von der schweren Fraktion aus der nach der Formel 30 Rinne 10 verdrängte Luft entweicht durch Lüftungs-

V^ löcher 20.

- ?z_ lUpml ^D'^e Ri^nne 1° k^{ann aucn} '^m Deckel 4 angebracht

•Siotp ^sem> ^{was m} manchen Fällen die Herausnahme des

Niederschlages erleichtert.

gewählt, wobei S₂₀^ die auf Wasser von 20° C um- 35 Als weitere Möglichkeit zur Verhinderung der gerechnete, in Svedberg-Einheiten anzugebende Sedi- Rückvermischung des Niederschlages mit der Restmentationskonstante der Partikeln ist. flüssigkeit können in der Rinne 10 radiale Querwände

Diese Formel gilt für einen mittleren Kammer- angebracht sein, die so nahe nebeneinander liegen, durchmesser von 17,5 cm. Sie gilt natürlich jeweils daß sie einen ausreichenden Widerstand gegen die für die Komponente mit der kleinsten Sedimentations- 40 Spülwirkung der Restflüssigkeit beim Nachlassen der konstante. Rotorgeschwindigkeit bilden.

Im folgenden wird ein Ausführungsbeispiel der Eine weitere Möglichkeit besteht darin, daß der

Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnung Flansch 18 sich nicht vom Rand 19 abhebt, sondern näher erläutert, die einen axialen Querschnitt durch statt dessen mit einer Anzahl öffnungen versehen ist eine bevorzugte Ausführung des erfindungsgemäßen 45 oder sogar porös oder gar netzartig ausgebildet ist, Ultrazentrifugenrotors darsteilt. wobei die öffnungen bzw. Poren zwar den Nieder-

Wie gezeigt, besitzt der Rotor 1 eine Anzahl ring- schlag durchsickern lassen, gegen die Restflüssigkeit förmiger Kammern 22, 23 und 24, die koaxial ange- aber genügend abschirmen, um die Rückvermischung ordnet sind. Ein Deckel 4 schließt die Kammern ab. zu verhindern.

In der Wandung zwischen je zwei aufeinanderfolgen- 50 In einer anderen Ausführung, die sich ebenfalls den Kammern sind Ventile angeordnet, und zwar bewährt hat, ist in der Rinne 10 ein angerauhter Ring Ventile 25 zwischen den Kammern 22 und 23 und aus massivem Polyamid-Material angebracht. Dieser Ventile 26 zwischen den Kammern 23 und 24. Jedes verhindert eine V» iederaufschwemmung der ausge-Ventil besitzt eine Ventilkugel 27, die durch eine schiedenen Fraktion bei einer Geschwindigkeitsände-Feder 28 in Richtung zum Ventilsitz der Ventilöff- 55 rung des Rotors, insbesondere, wenn der Rotor zum nung 29 gedrückt wird. Die letzte Kammer 24 wird Stillstand gebracht wird. Die angerauhte Oberfläche durch zwei ringförmige, konzentrische und koaxiale des Ringes gestattet das Vorbeifließen des Nieder-Wände 3 unterteilt. Im gezeigten Beispiel wurden Schlages während dpr Trennung. Statt der Anrauhung diese gesondert angefertigt und nachträglich mit können auch Rillen oder feine Profilierungen vorge-Hilfe von nicht gezeigten Abstandsklötzen exakt ein- 60 sehen sein, gebaut. Der Rotor I wird auf eine Achse 30 aufmontiert

Im gezeigten Beispiel bilden die Wände 3 jeweils und besitzt einen sich nach außen hin parabolisch parallele, der Achse zugewandte Flächen, auf denen verjüngenden Querschnitt zur Verringerung der die Fällung stattfindet. Diese der Rotationsachse zu- zentrifugalen Spannungen im Rotor, gewandten Flächen sind zur Rotationsachse geneigt 65 Die Mutter 32 preßt den Rotor 1 auf die Achse 30. und bilden einen engen Durchgang mit dem Dek- Eine Schraube 31 wird von der entgegengesetzten kel 4. Das auf diesen Flächen niedergeschlagene Seite in die Mutter 32 eingeführt und preßt den Dek-Material wird somit unter Zentrifugaleinwirkung kel 4 auf den Rotor 1. Eine Anzahl Dichtungsringe

$3 bewirken die Abdichtung zwischen Deckel und

Rotor.

Am Außenumfang wird der Deckel 4 von acht weiteren Schrauben 35 auf dem Rotor 1 festgeschraubt. Die Spannung der Federn 28 wird mittels der durchbohrten Schrauben 34 eingestellt.

Gehärtete Filterpapierstreifen A und B (gestrichelt) werden an der äußersten Wandfläche der Kammern und 23 ■ · · « A„n~„;_rl.h

,o melt. Die elektronmikroskopische Untersuchung bei OOOfacher Vergrößerung zeigte, daß eine sehr gute Fraktionierung stattgefunden hatte. Die auf Filterpapier A gesammelte Probe bestand im wesentlichen aus zerstörten Zellkernen und faserigem Material, verhältnismäßig groben Teilchen. Der Niederschlag auf Filterpapier B bestand im wesentlichen aus Teilchen mit einem Durchmesser zwischen 0,5 bis · 10 ~⁴ mm. Der Niederschlag im Bereich C der estand hauptsächlich aus Riboso-Durchmesser zwischen 0,2 und

_{sich das} Die Restflüssigkeit aus Bereich D der Sammelrinne

^ und die 10 wurde nicht genau untersucht, enthielt aber offen-

SüssigSΓΪΑ kÄL 22 in die Kammer 23 sichtlich etwas gröbere Teilchen als d,e Restflussig-S SaderuSf ang der Kammer 23 um die Dreh- ,» tat der Kammer 24.
achse größer ist als der der Kammer 22, ergibt sich B e i s ρ i e 1 2

und

und 24 öffnet. Es findet aann mc euugumg«; Trennung in der Kammer 24 im ultrazentrifugalen Drehzahlbereich statt.

Gemäß einer weiteren Ausbildung der Erfindung sind in beiden Kammern 22 und 23 im Bereich A und B, vorzugsweise an Stelle der Filterpapierstreifen Nylonnetze 40 angebracht. Die feinmaschigen Nylonnetze 40 gestatten den Durchgang des Niederschlages, der auf den Wänden A und B hängenbleibt. Beim Beschleunigen oder Abbremsen des Rotors in der Gegenwart von Restflüssigkeit schützt das Nylonnetz den Niederschlag gegen die Spülwirkung der Restfiüssigkeit und verhindert die Rückvermischung. Nachdem der

netze 40 suignuug ~« _

schlag wird von den Wänden A und B mit einer Klinge abgekratzt Dadurch verhindert man eine Verunreinigung der Niederschläge mit Papierfasern.

Beispiel 1 Ein Gemisch von Burnupera cincta und Jasus lalandü in Kochsalzlösung wurde in einer Vorrichtung gemäß der Zeichnung zentrifugiert und hierzu zunächst in die innerste Kammer 22 eingefüllt. Im Laufe der allmählichen Beschleunigung des Rotors wurde die Restflüssigkeit der aus der Kammer 22 zunächst durch Ventil 25 in die Kammer 23 übertragen. Kurz vor Erreichen der maximalen Rotorgeschwindigkeit wurde die Restflüssigkeit aus Kammer 23 durch Ventil 26 in die letzte Kammer 24 geleitet. Nach Beendigung der Fraktionierung in der letzten Kammer wurde der Rotor zum Stillstand gebracht und geöffnet, Niederschläge auf den Filterpapierstreifen A und B der Kammern 22 und 23 sowie aus der Rille 10 im Bereich C wurden gesammelt. Ebenso wurde die Restflüssigkeit aus dem Bereich D in der Rille 10 und aus Bereich £ der Kammer 24 gesam-

VU1U111CU J,~) Uli, W3 TTUftUW tU UWt »*.M»*UU~~ _ .

einer Umdrehungszahl von 5000 Umdrehungen pro Minute gearbeitet. Die Hämoaglutination des Ausgangsmaterial wir 10 · 2⁴, die des Konzentrats 6 · 10⁵ und die der Restflüssigkeit 1-10*.

Das Ergebnis zeigt deutlich die Vorteile des Dünnschicht-Ultrazentrifugier-Verfahrens. Der Virus wurde quantitativ bei geringer Drehzahl in ein kleines Flüssigkeitsvolumen eingeengt. Die elektro-mikrografische Untersuchung des gereinigten Materials ergab keine Schädigung der Virusteilchen.

Beispiel 3

Wesselsbron-Virus wurde nach der Arbeitsweise von Beispiel 1 und 2 angereichert. Ausgangsvolumen 35 ml; Temperatur 4° C; Zentrifugierdauer 3 Stunden. In der folgenden Tabelle stellt VJV_n das Verhältnis des Konzentratvolumens zum Ausgangsvolumen dar, und »Titer O/C« das Verhältnis der Titer des Ausgangsmaterials und des Konzentrats als negativer Logarithmus; »Resttiter« ist der Resttiter der Mutterflüssigkeit nach der Zentrifugierung. ι TCF war eine Gewebekultur-Flüssigkeit und m ein infizierter Maushirn-Extrakt

40

45

	0,166	Umdre-	Titer O/C	Rest-Titer
Ausgangs material	0,143	lnWgenpro Minute	5,9/6,8	3,8
TCF	0,10	10000	6,5/7,5	4,2
m	0,05	10000	5,6/6,5	3,5
m	0,043	12 500	6,4/7,8	4,5
m	0,043	10000	5,5/7,0	3,8
m	12 500	6,5/8,6	5,1
m	12 500

Die Ausbeute war fast quantitativ. ⁶⁵ Beispiel 4

Der folgende Versuch wurde mit einer Versuchsanordnung gemäß der Zeichnung durchgeführt, und

a> U Ii L

zwar mit einem mittleren Kammcrdiirchmesser der äußeren Kammer von 17,5 cm.

Eine verdünnte Suspension riesiger Haemocyanine aus Burnupera cincta, S_{20 w} = 90, wurde nach erfolgter Vorreinigung in den Kammern 22 und 23 schließlich in der Kammer 24 3 Stunden lang bei 12 000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert; das Ausgangsvolumen betrug 40 ml, und das Protein wurde in einem Volumen von 1 ml in der Sammelrinne 10 gesammelt.

Hieraus lassen sich die Bedingungen zur Konzentration anderer Stoffe bzw. von Viren in der gleichen Zeit errechnen. Um einen Virus mit S_{20 w} = χ in der gleichen Zeit im gleichen Ausmaß zu" konzentrieren, benötigt man eine Umdrehungszahl

= l/— · 12 000 [Upm].

Sioff	89 bis 91 155	Upm
Burnupera cincta. 5 Haemocyanine Poliovirus	550 690	12 500 9 150
Afrikanische-Pferdekrank- heit-Virus	4 860 360
Grippevirus

Da die Sedimentationskonstanten der meisten Viren erheblich höher sind als 90 Svedbergs, lassen sich die für die Konzentration benötigten Rotationsgeschwindigkeiten leicht erreichen.

Durch eine zweite Behandlung unter gleichen Bedingungen erreicht man die besten durch differenzielle Ultrazentrifugierung erhältlichen Reinheitsgrade des Virusmaterials.

Durch die große Fällungsoberfläche im Rotor erreicht man eine schnelle Abtrennung der Teilchen. Die gefällten Teilchen brauchen nur die kurze Fällstrecke zwischen den Wänden zu durchwandern und rutschen dann unter Zentrifugalwirkung an der Fällungsoberfläche entlang.

In der folgenden Tabelle werden bevorzugte Rotorgeschwindigkeiten zur Entfernung von 90°/o der Infektivität aus verschiedenen Substanzen angegeben.

Rotationsgeschwindigkeiten zur Abtrennung von 90 bis 99°/» der gewünschten Substanz aus einem Volumen von 35 ml, bei 4° C aus 10⁰/oiger Kochsalzlösung in 2¹,2 Stunden:

Für die obengenannten Umdrehungsgeschwindigkeiten eignet sich ein Rotor aus Polyamid. Die Umdrehungsgeschwindigkeiten zur Entfernung von mindestens 90°/o leichterer Teilchen bzw. Moleküle lassen sich in ähnlicher Weise errechnen. Hierfür werden höhere Zentrifugalkräfte benötigt, und somit muß auch der Rotor aus einem stärkeren Material wie Duraluminium oder Titan hergestellt sein.

Eine weitere Anreicherung und Erhöhung der Ausbeute läßt sich durch Verwendung einer höheren maximalen Drehzahl erreichen. Die Anreicherung von Hämocyanin aus Burnupera cincta wurde bei 15 000 Umdrehungen pro Minute wiederholt. Die Anreicherung wurde durch UV-Absorption bei 28 mii bestimmt.

35 ml Ausgangsmaterial ergaben 1,5 ml Konzentrat, und das Konzentrationsverhältnis war 0,21 :4.70. Die Konzentration in der Restflüssigkeit war 0,05 ⁰Zo.

Es sei besonders darauf hingewiesen, daß sämtliche beschriebenen Beispiele in einem Geschwindigkeitsbereich des Rotors zwschen 4000 und 15 000 Umdrehungen pro Minute durchgeführt wurden, was wesentlich weniger ist als die wesentlich höheren Umdrehungsgeschwindigkeiten handelsüblicher analytischer Zentrifugen, z. B. über 30 000 Umdrehungen pro Minute, die ein Konzentrat in Festkörperform ergeben, das sich nicht ohne Schädigung des Virusmaterials dispergieren läßt.

Die mehrstufige Trennung in einem Arbeitsgang und die Fällung in der letzten Trennstufe bei außergewöhnlich geringen Drehzahlen tragen zur weitgehenden Schonung der Produkte bei.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

409645/1

Claims (1)

1. den Trennkammern behandeh wW unddiejarükeln Patentansprüche:

   1. Verfahren zum Zentrifugieren einer spezi- Patentschrift 13015££££ BS fisch schwerere Partikeln enthaltenden Flüssig- 5 «nde Gut in mehreren ^u^

   keit, insbesondere zum schonenden Abtrennen ^d^ ^komf^nt^f_nd ^k°Snweise ständig miteinan-

   von Viren, wobei das Schleudergut in mehreren einander getrennt «£*£««7_erf^_{ren diem}

   konzentrischen, radial hintereinanderUegenden der räumlich J^J^sS^ Trennung von Flüssig-

   Trennkammem behandelt wird und die Partikeln f^^^^SJSSte bd normalen Zentri-

   sich an den Trennkammeraußenwänden abschei- .. ^^Ιΐεη.^!^^2 Verfahren wird nicht im ultra-

   den, dadurch gekennzeichnet, daß die ^g^en.^^e^^£f_hlbeSch durchgeführt. Die je-

   Zentrifuge stufenweise mit ansteigender Drehzahl *"**£*£££!£ÄSTgSSen leich-

   betrieben wird, wobei in einer ersten Stufe die weiligen m den "™2μΓΪκ3«μι anschließend zu-

   Trennkammern (22, 23, 24) gegeneinander abge- ten und ^'^^TSS^SIbSS^L

   schlossen sind und in den folgenden Stufen der 15 sammenge^^ und jeweus&™ζ B

   jeweils inneren Trennkammer (22 oder 23) die Eine ^m5^^^e _A^S„^_t nS vorgesehen und

   nach außen benachbarte (23 bzw. 24) durch ÖS- üonen in ein*^m ^Ae^n beSten Verfahrens-

   nen eines Ventils (25, 26) in der Zwischenwand auch nicht mogUch. ^Dl^°™_{tochmenj m ver}.

   zugeschaltet wird, und daß die Höchstdrehzahl J«*""*^^S beTverhältnsmäßig

   im ultrazentrifugalen Drehzahlbereich liegt. *» haltaismaßig ^SeJSwTwerten aber dennoch

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- n'«^ln^^ToH«^IIIf^hI<S^^^S kennzeichnet, daß die Höchstdrehzahl so gewählt im

   wird, daß das gefällte Produkt in dickflüssiger

   tSSSTÄ vollwandigen Schleu- „ ^f^

   dertrommel, I B. zum schonenden Abtrennen ^ bewirken.. Bisher

   von Viren aus einer Flüssigkeit, die mehrere kon- einzelkammngcn Vl

   zentrische, radial hintereiranderliegende Trenn- lange ^^SJ^

   kammern mit radial auffliegenden FäUungs- 1 Stunde oder ^lan|er bei.

   oder Sammelflächen aufweist, welche radial nach 30 Dabei kam es häufig «^g,^_nusam!

   außen entleert werfen können, zur Durchführung gefällten z. B. ^ν'~ί"ΐ schwer lös icher Fo™

   des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch mengeballter, verhärteter und schwer losucner form

   gekennzeichnet, daß die Trennkammern (22, 23, anfiel. _ΜΑ*_η aher auch leicht durch das

   24) untereinander durch unter der Einwirkung Schädigungen entet^ene°^ab"^a"^'^e1^ Materiah einer bestimmten Zentrifugalkraft radial nach 35 wiederho te UmfüllenL^nSfcn eines herkSmm außen selbsttätig öffnende Ventile (25, 26) ver- in den einzelnen Verfata^tof^ «nes ^rtcom_m bunden sind, wobei die erforderliche Zentrifugal- liehen mehrstufigen ultrazentnfugalen kraft mit dem radialen Abstand des Ventils von fahlem USA.-Patentschrift 3 326458

   der Trommelachse ansteigt. . weitermn isi^dU!> "^C1 . . Blutköroerchen

   4. Zentrifuge nach Anspruchs, dadurch ge- 40 eine Vorrichtung^zum Reinigenroter B utk orpereben kennzeichnet, daß den Ventilen(25, 26) Filter- bekannt, die auch als ZentnfugearbeUen kann und streifen (A, B) zum Auffangen des in der jewei- die aus mehreren zum Teil ^^™¹ Jg ligen Tr nnkammer (22, 23) abgeschiedenen Par- ^^^J^^

   oder 2, dadurch 45 tSj££Ü^ Behandlung dauernd in der l^n^ml^itannier. gleichen Kammer Diese wird u^nuHkr aus den

   brsr^{17>Scm die HöchstdrehzahU} ss^sssje^Sf^

   nach der bormel anschließe· -r einer weiter außen liegenden Kam-

   *_nnn l/ 90 _riT . 50 mer emk ^! ."den. Die Zentrifuge wird nicht im

   « = 12 000- /_ [Upm] ultrazeni ν ; ;t Drehzahlbereich betneben und

   V ^mW _{auch nicht} ,:_iit steigenden Tourenzahlen. Eine mehr-