DE2047704A1 - Ultra Zentrifugen Rotor und Verfahren - Google Patents

Description

Dr F ZiirrxtGin sen. - Pr. Π. Aenmann
R.Xoenir^ber,;" - D:;r.T · -:.R. iioizbauer

L-r. ί·. :iiiri-:..ain ;jii.
Patentanwälte
8 München 2, Bräuhaussh-aße 4/111 20Λ770Λ

South African Inventions Devalopment Corporation

Ad niη is tr at ive 3uild iηg

Scientia

Brummeria

i-ratoria

Republic of Sooth Africa.

UHTRA-ZS^TTT^I?U-12W ROTOR IFD

Die vorliegende Srfi"durg betrifft ei^er Ultraze^brifugenrotor u^d ein ültrazsn^rifujierverfahren.

In bel:.-imt3n Verfahren zur Virus-Rei^igu^v\^ bedi-ant man sich häufig der Ultr-i-Zenfcrifugieru>-g bei hohen Rotor-Geschwind i.·Vielten zur B'ällurg der Virusteilchen in korzentrierter Fest'iörperform. Grippe-Virus wird zum Beispiel häufig ei"e ofcun.de oder langer bei 105 000 g zentrifugiert. Dabei hat ma^ bisher das Ausrnass der Beschädigung der Virusteilchan durch solche Behandlung viel zu wenig beachtet.

Bei der Verarbeitu"-: von Virusmaterial mit empfindlichem Aufbau,v/ie ζ.ο. gewisser Vertreter der Arbo-Virusgrurpe führt die Ze^trifugierunc bis zur Festkörper-Bildung und die ^ichträr;lich3 Disrer^iei^ung 3es gebildeten Körpers häufig zn £ο^:'.7ογβγ 3chädigu"^f;en der Viren.

Ii¹ arkh3itskeime, die durch sole'e Beha>"dlurg an Lebonsfähi-keit ei^bfissor, si-^d z. B. "eurotroj. iooho Giäüaie der afrikanisohen P ferdekra^kheit, "Hi^-Valley-I^a-khoit", Gelbfieber und "'Jiessolsbron-Virus . Arbo-Virus kan* dabei leicht mehr als 90/0 sei-or Infoktlvität verlieren. Ka hat sich nun gezeigt, dass der Verlust an Virus-Titer weitgehend und unmittelbar damit zusammenhängt, dass das als Festkörper fconze"triorte Virusinaterial sich schwer dispergierer lässt. Selbst wonn ei^e WiGflerdisporsion obre Zerstörung der Virus-

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teilchen gelingt, bleibt es inimor -och schwer, die kleineren Zusammenballurgen infektiver Teilchen weiter aufzuteilen. Diese Teilchen-Klumpen ergeben leicht Ungenuuig^eiten bei der .Durchführung physiko-chemischer ilessungen an infektiven Substanzen.

Die herkömmliche Fra^vtio"ierung in mehrere Fraktionen z.3. biologischen Materials bedingt ei^e entspreche-d mehrfache Unterbrechung der Ultrazentrifugierung, d.h. abbremsen u'-d offnen des Rotors, herausnehmen der gefällten Fraktion, gegebenenfalls Ausspülen des Rotors, Vorbereitung des Rotors für die nächste Fraktionierung, Schliessen des Rotors und Beschleunigen aus dem Stillstand bis zur Fraktionierungsgeschwindigkeit. Diese Arbeitsweise ist '-■icht nur unbequem, sondern der Zeitaufwand ist ".ber'.aupt unerwünscht, v;en>~ man empfindliches I.Iaterial verarbeitet, ga^z abgesehen vo- :1er erhöhten Gefahr der Verunreinigung.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung ei-es Ultrazencrifugenrotors und Ultrazentrifugierungs-Veri'ahrens zur bequemen und schonenden Ultrazentrifugierung empfindlichen Materials insbesondere von Virusmaterialj insbesondere ermöglicht die Erfindung die wirksame Konzentration empfindlicher Stoffe wie z.B. Virusmat ?rial in diekf lässiger '.Onzertratform an Stelle der herkömmlichen Festkörper. Ferner ermöglicht die Erfindung zwecks weitgehender Schonung des Materials, insbesondere Beschleunigung des R^i-igungs- und Konzentrationsvorganges die Zentrifugierung in auf ο α.η.and erfolgenden co-axialen Fällnn^czonen ohna Unterbrechung der Rotation und öhre Offnurg des Rotors.

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3> ei"ar besonders vorteilhaften Ausbildung der ergibt sich ei'-e weitere Schonung des Materials durch die Ultra-Ze^trifugierung dünger Fluss igkeitsschichten, -wodurch die V.a^aerungsdistanz dor zu fallenden Teilchen bis zur Fällungs oberfläche (Fällurgss trecke) erheblich verringert wird.

Ir sbesodere ermöglicht die Erfindung die Fraktionierung vor- Virusmaterial und dergleichen bei verhältnismässig geringen ßotor-Geschv.i^dic'^r-eiten urd die Fällung der Teilchen auf eirer im Verhältnis zum Fluss igkeitsvolumen grossen Fällungsoberfläche.

Aufgabe der Erfindung ist ferner die Verwendung der Zentri- g fugalreaktion zur Förderung ei^er oder mehrerer der Fraktionen aus einain Rotorbereich in einen anderen Bereich, v/o die Zentripoialbeschleuni^uns h^her ist.

Der erf i^du^gsgemässe Ultraze^trifugenrotor, Vorzugs v/eise sui' absatzviieisen Ze^trifugierung vo^ Flussig)-:oiter ist dadurch ge^e'-nzeichnet, dass er zwei oder rcehr Ivam-rern besitzt, deren Abstand zur Rotationsachse des Rotors zunimnt, sowie einen Durchgang für die Weiterleitung von Flüssigkeit während des Zentrifugierens von-ei^er liamrner zu eir-er weiter von der Achse er tf err tön -.arnmer. "

Gemäss eimern weiteren Kernzeichen der Erfindung besitzt der Ultrazertrifugenrotor mindestens ei^e Fällu^gsflache, die zur Hotaticr-sachse des Rotors geneigt ist und ist der Rotor zur Förderung von gefälltem IJaterial lä^gs der geneigten Oberfläche in Richtung auf einen "^iederschlags-Sammelbereich des Rotors eingerichtet.

Gemäss eimern weiteren Kennzeichen der Erfindung sind mehrere, coaxial, in radialer Richtung zur Rotationsachse gestaffelt angeordnete Fälluⁿgswände i~ Abstä-den voneinander

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vorgesehen, die weniger als ein Viertel dor Länge und

Breite der 7/ard oberflächen betragen. Diese Ausführung eignet sich besonders zur Durchführung-ei*·es erfindungsgemässen Ultrazentrifugierungs-Verfahrens, insbesondere zur Abscheidung von Virusteilchen mit dem Kennzeichen, dass die Ultraze^trifurierung bei einer Zentrifugal-Reaktion von weniger als tausendmal der Erdanziehungskraft stattfindet.

In einer bevorzugten Ausführung cu-r Erfindung ist die äusserste Wand der äussersten Kammer des Rotors zur Rotations-Achse nach aussen hin in Richtung auf eine ^iederschlagssammelrinne geneigt.

Ferner sieht die Erfindung vor, dass in der Wand zwischen zwei von der Drehachse verschieden weit angeordneten Kammern ein Ventil bzw. mehrere Ventile vorgesehen sind, die sich während der Rotation des Rotors, beispielsweise nach Erreichen einer bestimmten Drehzahl, vorzugsweise selbsttätig öffnen lassen. Damit wird bezweckt, dass nach erfolgter Fraktionierung in einer Kammer die Drehzahl erhöht werden kann und die Flüssigkeit zur Abtrennung der nächsten Fraktion in ei^e; weiter aussen liegende Kammer geleitet wird, z.B. vollautomatisch.

Im folgenden soll die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert werden.

Es stellen dar:

Figur 1 einen axialen Querschnitt durch eine bevorzugte Ausführung des erfindungsgemässen Ultrazentrifugen.rotors; Figur 2 einen axialen Querschnitt durch eine weitere bevorzugte Ausführung eines erfindungsgemässen Ultrazentrifugen-Rotors;

Figur 3· ei*-e graphische Darstellung der Konzentrations-&nderung

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gege"¹ Zeit bei dor Durchführung des erfindungsgemässen ¥erfahrens;

Figur 4 eine seha.natischG Darstellung ei^er Serie von Schlier ing Photographien.

C^lemäss Figur 1 wird der Ultrazentrifugen-Rotor zur zentrifugalen Fraktionierung von Flüssigkeiten normalerweise mit der Rotationsachse 15 i" senkrechter Lage verwendet. Er besitzt einen Rotor 1 mit ei~er ringförmigen Kammer 2 als Trennkammer. Die Kammer 2 wird von 2 ringförmigen konzentrischen und coaxialen Y/änden 3 unterteilt. Im gezeigten Beispiel wurden diese gesondert angefertigt und nachträglich mit Hilfe von nicht gezeigten AbstandsklStzen exakt eingebaut. Die Wände 3 besitzen je eine feste Kante ^O und eine freie Karte 51· Der Rotor 1 ist mit eirem mittels Schrauben 5 zwecks Schliessung der Kammer 2 auf die Dichtungsringe 6 und 7 aufschraubbaren Deckel 4 versehen. Der Deckel 4 besitzt selbst drei ringförmige konzentrische 7/ände bzw. Profilierungen 8 zahnförmigen Querschnitts, die im go ze !/"ten Beispiel jeweils gegenüber den Kanten 51 angeordnet sind.

Im gezeigten Beispiel bilden die Wände 3 sowie die Wände 3 je- { weils parallfilo der Ach:;e zugewandte Flächen, auf denen die Fällung stattfindet. Diese der Rotationsachse zugewandten Flächen sind zur Rotationsachse geneigt und bilden einen engen Durchgang 9 zwischen den freien Kanten 51 '-^r Wände 3 und den jeweils gegenüberliegenden V/ändon ft. Das auf den Oberflächen niedergeschlagene Material wird somit unter Zentrii'ugaloinwirkung dem Durchgan;;: 9 zugeleitet und sammelt sich in der Sammolrinne 10. Dor Querschnitt des Spaltes 9 soll möglichst klein sein z.B. 0.5 mm.

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Der Winkel der Y/ä>de 3 zur Rotationsichse 15 insbesondere Der Neigungswinkel der der Rotationsachse zugewandten Oberfläche beträgt r.-iehr als 0° und weniger als 90^, vorzugsweise zwischen 10° und 80 , insbesondere zwischen 20° und 70 , und zwar 20 im gezeigten Ausführungsbeispiel.

Durch die V/ände 3 wird die Kammer 9 in enge, ringförmige Kamnern unterteilt. Dadurch v/ird die Fällungsstrecke senkrecht zur Rotationsachse nach aussen verkürzt. Diese Fällungsstrecke beträgt vorzugsweise weniger als ein Viertel der Strecke von der festen V/andkante 50 zur freien 'Yandkante 51 (die andere Dimension der Wandoberfläche in Umfangrichtung ist grosser).

Die erfindungsgemäss verkürzte Fällungsstrecke lässt sich .je η ich Abstand zwischen den 7/änden 3 oder dergleichen nach Bedarf festlegen. Ebenso lässt sich die Förderungsgeschv/indigkeit der an den Fällungsflächen zur Spalte 9 und ftin^e 10 hinwandernden riederschlage je nach dem t'eigurrsvirkel der V/ände 3 und der äusscrsten .'/and der Kammer 2 beeinflussen. Durch eine Vergrösserung des Neigungswinkels v/ird allerdings für einen gegebenen Abstand der Wände voneinander die Fällungsstrecke verlängert. Soll also dar *^Teigungsviinkel für eine bestimmte Anwendung grosser sein, no kann es zweclrnässig sein, den Abstand zwischen den Wänden zu verringern und in äußersten Falle ergibt sich daraus eine Hammer 2, die von ei^or grossen Anzahl dünner, nahe aneinander angeordneter "/ando in! :· to Ilen '.'.'W: zur liotatlonsachsö unterteilt wird.

Vorsn^r. vkjIsg ist dor Abrtu^d der '.-Λ'γήΙο ^ :;iir lohr.o mlndostnn«; ;;o gross und vorzugswoiso erheblich .^rSsum* als die ralialo [iroltu der Kammor ?.

^ l)ov. liot »v 1 wLrd mitteln Bolzen Il auf ^l^on ü iclu» 1 l.'

1 η π η 17 /13 ο η

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..ίο¹ uisrt, uer sei"3rs3its auf die ontriebsac^se ^rler Sentri- xη■.:a /acst.

Zur Verwandlung der Vorrichtung v;ird die zu tro^rende Sas;:8"SXD^ ir die IZanraer 2 ein :?.füllt und der Deckel 4 geschlossen. Dabei omrfieHt es sich, die Kammer 3 bis zur O'-erkunte ner V/a^de 3 zu füllen. V.'ährend des Zentrifugieren v.ir.nt üie ?lvGnig^r:eitsoberflache die von der strichpunktierten Li⁴i ie 13 angedeutete La^e an.

In der Rinne 10 ist ein angerauhter Hing 16 aus massivem Folyntnid Ilaterial angebracht. Dieser verhindert eine ϊ/ieäerauf- ä

sc':ixiemrmri% der rr-s^eschiade^en Fraktion bei ei^er Geschv/i^di^ änderung des Hotors insbesondere, v/enn der Rotor zum Stillstand 3 ο br acht v/ir 1. üie angerauhte Oberfläche des Ringes gestattet das Vorbeifliessen des Niederschlages während der Trennung. Statt der anrauhurs können auch Rillen oder fei^vie I-rofilierungen vorgesehen sein.

ie-näss -^i-ur 2 bositzt der Rotor 1 ei^e anzahl ringförmiger Kammern 22, 23 und 24-, die coaxial angeordnet sind. Dadurch ist der Iiotor im die Drehachse ausgewuchtet. '.Vie i^ Figur 1 ist ei" Deckel 4 vorgesehen. In der 'Vandung zwischen je zwei aufeinander folgenden Kanm-srn sind Ventile angeordnet, und zt/ar Ventile 25 zwischen den Kammern 22 und 23 und Ventile 26 zwischen den Kamnern 23 -i^d 24. Jedas Ventil besitzt eine Ventilkugel 27 unter dem Federdruck ei^er Feder 28 in Richtung zum Ventilsitz der VentilSff»ning 29. Die letzte Kainner 24 entspricht im wesentlichen der lamar 2 gemäss Figur 1, ei^schliesslich der Zwischenwände 3 und der ^iecJerschlag-Samnie!rinne 10.

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Im Bereich der Sammelrinne 10 befindet sich ein Dichtungsring 17 aus elastischem Material z.B. Gummi zwischen dem Rotor urd dem Deckel 4. Der Rotor ist entsprechend ausgespart. Der Ring 17 besitzt einen elastischen Flansch 18, der sich ^ach Überschreitung eirer bestimmter Rotatior-sgeschwi^digkeit vom Rand zwischen der Kammer 2 und der Rinne 10 abhebt und dann den Durchfluss der schweren Fraktion in die Rinne 10 gestattet. Beim Abbremsen des Rotors kehrt der Flansch IP wieder in. seine ursprüngliche Lage zurück und sperrt somit die Rirne 10 gegen die Kammer 24 ab und verhindert damit die Vermischung der Fraktion mit der Rest-Flüssigkeit. Die von der schweren Fraktion aus der Rinne 10 verdrängte Luft entweicht durch Lüftungslöcher 20.

Die Rirne 10 kann auch im Deckel 4 angebracht sei'-, was in manchen Fällen die Herausnahme des Niederschlages erleichtert

Als weitere Möglichkeit zur Verhinderung der Rückvermischung des Niederschlages mit der Restflüssigkeit können in der Rinne 10 radiale Querwände angebracht sein, die so nahe nebeneinander liegen, dass sie einen ausreichenden Widerstand gegen die SpUlwirkung der Restflüssigkeit beim Nachlassen der Rotorgeschwindigkeit bilden.

Eire weitere Möglichkeit besteht darin, dass der Flansch 18. sich nicht vom Rand 19 abhebt, sordern statt desser mit einer Anzahl Offnungen versehen ist oder sogar porös oder gar netzartig ausgebildet ist, wobei die öffnungen bezw. Porer zwar den Fiederschlag durchsickern lassen, gegen die Restflüssigkeit aber genügend abschirmen, um die Rückvermischung zu verhindern.

Der Rotor 1 wird auf eine Achse 30 aufmontiert und besitzt

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einen sich nach aussen hin parabolisch verjüngende" Querschnitt zur Verringerung der zentrifugalen Spannungen im Rotor.

Die Kutter 30 presst den Rotor 1 auf die Achse 30. Sine Schraube 3I wird von der entgegengesetzten Seite in die Hutter eingeführt und presst den Deckel 4 auf den Rotor 1. Eine Anzahl Dichtungsringe 33 bewirken die Abdichtung zwischen Deckel und Rotor.

Am Aussenumfans wird der Deckel 4 von 8 weiteren Schrauben 35 auf dem Rotor 1 festgeschraubt. Die Spannung der Federn 28 wird mittels der durchbohrten Schrauben 34 eingestellt.

Gehärtete Filterpapierstreifen A und B (gestrichelt) v/erden an der äussersten 7/andf lache der Kammern 22 und 23 angebracht, ehe das zu trennende Gemisch in die innerste Kammer 22 eingeführt wird. Der Rotor wird dann zunächst auf eine Geschwindigkeit gebracht, bei der das erste Ventil 25 noch geschlossen bleibt, und bei der äine erste Trennung stattfindet. Der erste ?^Tiederschlag der am leichtesten abtrennbaren Teilchen wird auf dem Filterpapier-Streifen A ausgeschieden und festgehalten.

Der Rotor v/ird dann beschleunigt, bis sich das Ventil 25 unter Zentrifugalwirkung öffnet und die Restflüssigkeit aus der Kammer 22 in die Tfammer 23 fliesst. Da der Umfang der Kammer 23 um die Drehachse grosser 1st als der der Kammer 22 ergibt sich in der Kammer 23 wiederum eine geringere Schichtdicke der Flüssigkeit und somit eine kürzere Fallungsstrecke. Hierdurch und durch die höhere Geschwindigkeit und die grössere Entfernung zur Rotationsachse werden nun Besbandteile der Flüssigkeit mit wesentlich geringerer Sedimentatlorsgeschwindigkeit niedergeschlagen und

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im Filterpapier B gesammelt. Dann wird die Geschwindigkeit des Rotors noch weiter erhöht, bis sich das Ventil 26 zwischen der Kammer 23 und 24 öffnet. Ss findet danr ei^e weitere Trennung statt in ähnlicher V/eise wie bereits für Figur 1 beschrieben wurde.

Gemäss einer weiteren Ausbildung der Erfindung sind in beiden liammern 22 und 23 im Bereich Λ und B, vorzugsweise an Stelle der Filterpapierstreifen ^ylonnetze 40 angebracht. Die feinmaschigen ?^Tylonnetze 40 gestatten den Durchgang des Niederschlages der auf den Wänden A und B hängen bleibt. Beim Beschleunigen oder Abbremsen des Rotors in der Gegenwart von Restflüssig eit schützt das Nylonnetz den Niederschlag gegen die Spülwirkung der Restf lüssig-eeit und verhindert die Rückvermischung. Nachdem der Rotor endgültig zum Stillstand kommt, wird der Deckel 4 abgehoben und v/erden die ™ylonnetze 40 sorgfältig extrahiert. Der übrige Niederschlag wird von den V/änden A und B mit einer Klinge abgekratzt. Dadurch verhindert man ei^e Verunreinigung der Niederschläge mit Papierfasern.

Beispiel 1;

Der folgende Versuch wurde mit einer Versuchsanordnung gemäss Figur 1 durchgeführt, dessen Durchmesser lTj-r Zentimeter betrug.

Eine verdünnte Suspension riesij-er Haemocyanine aus Burnupera cincta, S 20w»90 wurde 3 Stunden lang bei 12 ooo Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, das Ausgangsvolumeη betrug 40 ml und das Protein wurde in einem Volumen von 1 ml in der Sammelrinne 10 gesammelt.

Hieraus lassen sich die Bedingungen zur Konzentrierung anderer Stoffe bzw. von Viren in der gleichen Zeit errechnen. Um oinen Virus mit S20w=x in der gleichen Zeit im gleichen

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^us/iasse zu konzentrieren benötigt man ei^e Umdrehungszahl

u « V 22 ^{x 12} ooo t.p.m.
χ

Da die Fällungskoeffizienten der meisten Virer erheblich höher sind als 90 Svedbergs lassen sich die für die Konzentrat ic- benötigten Rot;tio^sgeschv;i^digkeiten leicht erreichen.

Durch ei^e zweite Behandlung unter gleichen Bedingungen erreicht man die bester durch· die differenzielle Ultrazentrifugierung erhältlichen Reinheitsgrade des Virusmaterials.

Durch die grosse Fällungsoberfläche im Rotor erislcht man eine schreibe Abtrennung der Teilchen. Die gefällten Teilchen brauchen nur die kurze Fällstrecke zwischen den Wäfdep zu durchwandern und rutschen dann unter Zentrifugalwirkung an der Fällungsoberfläche entlang.

^Ti~ach Beendigung der Zen tr legierung wird die liutterf lüssigkeit aus der Kammer 2 sowie dam oberen Teil der Ri^ne 10 entzogen.

Der Fiederjchlag befindet sich unterhalb der ringförmigen, lose in die Ri^re 10 eingelegten Polyamidschnur 16, die bei einer Geschwindigkeitsänderung des Rotors insbesondere am Ende der |

Zentrifugierung eine WiederVermischung des Niederschlages mit der Flüssigkeit verhindert. Diese Schnur wird mit ei^er Pinzette herausgehoben und der Niederschlag lässt sich nun mit einer Pasteur-Pipette entfernen. Das Virusmaterial ist nun etwa 40-fach konzentrieri das Konzentrat wird vorzugsweise wieder verdünnt und unter den gleichen Bedingungen wie vorher zentrifugiert. Der endgültige Reinheitsgrad ist dann sehr hoch. In der folgenden Tabelle werden bevorzugte Rotorgeschwindigkeiten zur Entfernung von 90$ der Infektivität aus verschiedenen Substanzen angegeben.

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894-91	12	500
155	9	150
550	4	360
690	4	360

TABEIiLS 1

Rotationsgeschwindigkeiten zur Abtrennung von 90-99^ der gewünschten Substanz aus einem Volumen von 35 ml, bei 4⁰C aus lC$iger Kochsalzlösung in 2·^- Stunden

Stoff SgOTW U.P.&.

Burnupena cincta,
Haemocyanine

Foliovirus

Afrikanische Fferde-Krankheit-Virus

Grippevirua

Für die ober genannten Umdrehungsgeschwindigkeiten eignet sich ein Rotor aus Polyamid. Die Umdrehungsgeschwindigkeiten zur Entfernung von mindestens 90$ leichteter Teilchen bezw. Moleküle lässt sich in ahnlicher Weise errechnen. Hierfür werden höhere Zentrifugalkräfte benötigt, und somit muss auch der Rotor aus einem stärkeren Material wie Duraluminium oder Titan, hergestellt sein.

Beispiel 2

Wesselsbron-Virus wurde durch Dünnschicht-Ultra-Zentrifugierung in.der Vorrichtung gemäss Figur 1 konzentriert. Ausgangsvolumen 35 ml; Temperatur 4° G; Zentrifugierdauer 3 Stunden. (In Tabelle 2 stellt Vc/Vo das Verhältnis des Korzentratvolumens zum Ausgangsvolumen dar, und "Titer" 0/C das Verhältnis der Titer des Ausgangsmaterials und des Konzentrats als negativer Logarithmus

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von LD 50. ''Resttiter" ist der Resttiter der ..iutterf lüssigkeit nach der Zentrifugierung.

TGF war eire Gewebekultur-Flüssigkeit und m ein infiziertes Maushirn Extrakt.

Ausgangs material	Vc/Vo	Uiadr.pro Minute	000	T it er	o/c	Rest-Titer
TCF	0,166	10	000	5,9	6,8	3,8
m	0,143	10	500	6,5		4,2
m	0,10	12	000	5,6	6,5	3,5
m	0,05	10	5OO	6,4	7,8	4,5
m	0,043	12	5OO	5,5	7,0	3,8
m	0,043	12	6,5	8,6	5,1

Die Ausbeute war fast quartitativ,

Beispiel 1

Grippe Virus wurde durch Dünrschicht-Ultrazentrifugierung in der Vorrichtung gemäss Figur 1 konzentriert. Zentrifugierdaue* 3 Stunden bei 4°C.Als Ausgangsmaterial wurde Eidotterflüssigkeit verwandt.

Das Ausgangsvolumen war 35 ml, das Konzentrat-Volumen 1,5 ml, es wurde bei einer Umdrehungszahl von 5000 Umdrehungen pro Minute gearbeitet. Die HSmoaglutination des Ausgangsmaterials war 10 χ 2⁴, die des Konzentrats 6 χ Kr und die der Restflüssigkeit 1 χ 10³.

Das Ergebnis zeigt deutlich die Vorteile des Dünnschicht-Ultrazentrifugier-Verfahrers. Der Virus wurde quantitativ bei geringer Drehzahl in ein kleines Flüssigkeitsvolumen eingeengt.

Die elektro-mikrografische Untersuchung des gereinigten Materials

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ergab keine Schädigung der Virusteilchen.

Beispiel 4:

Hämocyanin aus Burnupera cincta wurde korzertriert unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 3, bis auf die Rotorgeschwindigkeit, (15OOO Umdrehurgen pro Minute). Die Anreicherung wurde durch UV Absorption bei 28 m bestimmt. Wie im Beispiel 3 ergaben 35 nil Ausgangsmaterial 1,5- ml Konzentrat und das Konzentrationsverhältnis war, 0,21:4,70. Die Konzentration in der Restflüssigkeit war o,o5.

Beispiel 5;

Die Sedimentations-Geschv/indigkeit wurde untersucht. Hierzu wurde Hämocyanin aus Burnupera cincta bei konstanter Rotorgeschwindigkeit zentrifugiert und die Abnahme der relativen Proteirkonzentration in der Restflüssigkeit durch UV Absorption in Abständen gemessen und in Figur 3 aufgetragen. Der negative Logarithmus der Restkonzentration c gegen Zeit t ergibt ei^e gerade Linie, deren "^Teigung proportional zum Sedimentationskoeffizianten ist. Somit genügt es einen Rotor für eine Substanz mit bekannten Sedimentationskoeffizienten bei einer eirzigen bekannten Rotorgeschv/indigkeit zu standardisieren, danach lassen sich die Sedimentationskoeffizienten anderer Körper bestimmen. Die Richtigkeit dieser Feststellung wurde durch Vergleichsversuch mit einem bekannter Virus bestätigt. Der Durchschnittswert aus zwei Versuchen war I60 Svedbergs. Der mit einer handelsüblichen analytischen Ultra-Zentrifuge bestimmte Wert betrug 155 S.

Beispiel 6t

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Es wurden zwei Proteine mit unterschiedlichen Sedimentations-

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koeff izienten getrennt und zwar zwei Hämocyatidne aus Jasus Lalandiiund aus Burnupera cincta. Ein Gemisch der beiden Froteine v/urde in Kochsalzlösung gelöst und ir einem Rotor gemäss Figur 1 bei 16 000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. In regelmässigen Zeitabständen wurden Proben der Restflüssigkeit entnommen und jeweils unter gleichen Bedingungen in der analytischen Ultrazentrifuge zentrifugiert. Figur 4 zeigt Kopien der Sehliering Photographien dieser Proben. Die Bilder a, b, c, d und e zeigen die Ergebnisse vor der Zentrifugierurg, nach 30 Minuten, nach 4p üainuten, 60 Minuten und 90 Minuten. Es sind zwei Spitzen 37 und 38 zu sehen, von denen die zweite immer kleiner wird und nach 90 Minuten praktisch verschwunden ist.

Der Niederschlag d.h. der Bestandteil der zweiten Spitze wurde nach 90 Minuten der Sammelrinne entnommen, im Verhäliris 1:5 verdünnt und in einer analytischen Ultrazentrifuge zentrifugiert. Bilder f, g, h, und i stellen die Sehliering Photographien ^ach 0, 8, 16 und 24 Minuten bei I6000 Umdrehungen pro Minute dar.

Die Bestandteile des synthetischen Gemisches besassen

die folgenden bekannten Sedimentations-Koeffizienten: (

Jasus lalandliS20 w = 16
Burnupera cincta S 20 w - 89 und 91.

Beispiel 7

Ein Gemisch von Burrupera cincta und Jasus lalandii in Kochsalzlösung v/urde in eirer Vorrichtung gemäss Figur 2 zentrifugiert und hierzu zunächst in die innerste Kammer 22 eingefüllt. Im Laufe der allmählichen Beschleunigung des Rotors wurde die Restflüssigkeit

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der aus der Kammer 22 zunächst durch Ventil 25 in die Kammer 23 übertragen. Kurz vor Erreichen, der maximalen Rotorgeschwindigkeit wurde die Restflüssigkeit aus Kammer 23 durch Ventil 26 in die letzte Kammer 24 geleitet, wach Beendigung der Fraktio- > nierung in der letzten Kammer wurde der Rotor zum Stillstand gebracht und geöffnet, die Niederschläge auf den Filterpapiorstreifen A und B der Kammern 22 und 32 sowie aus der Rille 10 im Bereich C wurden gesammelt. be"so wurde die R^stflüssigkeit aus dem Bereich D ir der Rill? 10 und aus Bereich E der !'aminer 24 gesammelt. Die elektromikroskopische Untersuchung bei 80000 fächer VergrSsseru^f zeigte, dass eine sehr gute Fraktionierung stattgefunden hatt. Die auf Filterpapier A gesammelte Probe bestand im wesentlichen aus zerstörte^ Zeil¹ ernen und faserigem Material , verhält··- isiras ε ig groben Teilchen. Der Niederschlag auf Filternapier B bestand am wesentlichen aus Teilchen mit einem Durchmesser zwischen 0,5 bis

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1 χ 10 mm. Der ATiederschlag im Bereich G der Sammelrinne 10

bestand hauptsächlich aus Ribosomen mit einem Durchmesser zwischen 0,2 und 0,25 x 10~⁴ ma.

Die Restflüssigkeit aus dem Bereich E der Kammer 24 bestand im wesentlichen aus normalen Serumbestandteilen wie Eiweiss und Hämoglobulirenurid dergleichen wesentlich kleinerer Teilchengrösse.

• Die Restf lüssiglceit aus Bereich D der Sammelrinne 10 wurde nicht genau untersucht, enthielt aber offensichtlich etwas gröbere Teilchen als die Restflüssigkeit der Kammer 24.

Es sei besorders darauf hingewiesen, dass sämtliche beschriebenen Beispiele in einem Geschwindigkeitsbereich des Rotors zwischen 4000 und 13 ooo Umdrehungen pro Minute durchgeführt wurden, was wesentlich weniger ist, als die wesentlich höheren Umdrehurgs-

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geschwindigkeiten handelsüblicher analytischer Zentrifugen, z.B.

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über 30 000 Umdrehur-ger pro Minute, die ein Korzentrat ir Fest-IrSrperform ergeben, das sich rieht ohne Sch53Lgurg des Virusmaterials dispergieren lässt.

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Claims (1)

1 ^lcrazentrifugen-Rotor gekennzeichnet durch zwei oder mehr

in verschiedene^ abständen zur Rotationsachse (15) des Rotors (1) angebrachte iCa.nrnerr (2, 3, 10 ) bzw. (22, 23, 24, 20) und durchgängen (9, 25, 26, 2) zur Weiterleitung mindestens ei^er Fraktion während des Zentrifugierens aus ei^er Kammer in eine andere weiter, von der Rotationsachse entfernte Kam.ier.

2. Rotor gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere der Xammern(2, 10, 22, 23, 24) ringförmig um die Achse angeordnet sind.

3. Rotor gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er für die absatzweise Ultrazentrifugierung eingerichtet ist,

4. Rotor gemäss einem oder mehreren Ansprüchen 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet, dass sich zwischen mindestens zwei der Kammern eine Fällungswand(3, B) befindet, deren der Achse zugewandte Seite eine zur Achse (15) geneigte Fällungsoberflache bildet und dass ei^e Durchgangsspalte (9) für eine gefällte Fraktion längs der freien Kante (51) dar Wand gebildet wird, die sich in dem Bereich der Oberfläche befindet, die am weitesten von der Achse (15) entfernt liegt.

5· Rotor gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der

Winkel der Oberflächa zur Rotationsachse zwischen 10 Grad und 70 Grad beträgt.

6. Rotor gemäss Anspruch 4 oder 5j dadurch gekennzeichnet,

dass mehrere der Fällungswände (3) in radialen Abständen zueinander vorgesehen sind.

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7. Rotor gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die freien kanten (51) sämtlicher iVände im wesentlichen in einer Ebene senkrecht zur Rotationsachse (15) des Rotors liegen.

8. Ultra-Zentrifuge gemäss Anspruch 6 oder 7> dadurch gekennzeichnet, dass mehrere dar geneigten Fällungsoberflächen und parallel zueinander sind.

">. Rotor genäss eifern oder mehrere« der Ansprüche 1 bis <°>,

dadurch gekennzeichnet, dass die äusserste Eegrenzungsflache der am weitesten von der Achse entfernten Trennkammer (2) •3ur Achse gezeigt ist und nach ausser hin in einer Sammelrinne bzw. Aussparung (10) e«aet.

13. Rotor gemäss einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9>

dadurch gekennzeichnet, dass als Durchgang für die Restflüssigkeit zwischen zwei liamnerp· ein Durchgang mit einer Ventileinrichtung (25) 26) vorgesehen ist und dass sich die Ventileinrichtung viährerd der Rotation des Rotors öffnen lässt.

11. Rotor .ς 3 mass Anspruch 10, dadurch ge^venrzeiehnet, dass die

Ven-tileinrichtung unter Federdruck steht und der Faderdruck die Zentrifugalreaktion vor aus be stimmt, bei v/elcher das Ventil sich selbsttätig Mf«et.

12. Rotor genäss eimern oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass eine die Rückvermischung verhindernde Abschirmeinrichtung zwischen dem Samme!bereich für die gefällte Fraktion und dem Bereich der Restflüssigkeit vorgesehen ist.

13. Rotor gemäss Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass als Abschirmeinrichtung im Samrne !bereich für die gefällte Fraktion

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ein für die gefällte Fraktion durchlässiges ^TTetz (40) oder dergleichen angebracht ist.

14. Rotor genäss Anspruch ? u^d 12, dadurch gekennzeichnet, dass im Bereich dor Samine !rinne (10) für die gefällte Fraction ■ eine Abschirmeinrichtung (16 oder 18) vorgesehen ist.

15. Ultrasertrifugenrotor für die absatzweise Ultrazenfrifugierurg flüssiger Materials, mit einer Fällungoberflache für die gefällte Fraktion, dadurch gekern_2Gich^et, das:· dJe !''alliv-gsoberflache (3) zur Rotor-Drehachse (15) geneigt ist und ei^e Gleitfläche für das gefällte I-Iaterial aus eimern näher zur Achse liegenden Bereich in einem weiter von der .icase entfernten Fraktions-Sanmelbereich bildet.

Id. Kotor gemäss eimern oder mehreren der Ansprüche 1 bis

15, dadurch gekennzeichnet, dass die in radialer Richtung gemessene Breite der -Lammern weniger als ein Fünftel der übrigen Dimensionen der Hammer beträgt.

17. Ultrazentrifugierverfahren, dadurch gekennzeichnet, dass

das ultrazentrifuge ort G ,.'.aterial v/ährend der Ultr-.sentrifugierung mittels der Zertrifugalrea-ctior aus ainem Fällung bereich i" ei^e^ weiter von der Rotation :ichse o'-t^o lächenbereich befördert v;ird.

IP. Verfahre'- ^eüäss a."spruch 1'", ]..: 'vc'i r^-^^^ichro

lacf. -;?fälltoc ' ^Tater idl mittels ientr i.fugalro i^r:tio- über eine atiT-c ichst; :-- - :i. ·!: > :0 ällu- ,sf l'lc'is f;l°it-jn :■>'' .<z:y^ v;ird.

ι "?. Vorf..;h.ro^r> ,rsm'ir.s .j-t r;icr I'⁷ 1¹^cI 1°, Jadm-ch gekennzeichnet, riss ;9f"lltes Ilaterial uleichzoiti..! an* neareren in

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~ ">. 7erf ..Γ.ΓΘ" ^emass Anspruch Π, dadurch geke

•1 ..ss das --iltrazenorifuyierte Material ei'ie Virus-Suspension ist i.-^d ά·3ΐ· 7-^:.rus als flüssiges Konzentrat gewonnen wird.

M. Verfahren 3amass einem oder mehreren der

λ? bio 20, dadurch ^3ko^n₂οlehnet, dass die Restf lÜssi.-keit η ich=>inander verschiedenen Fällun-jsf lachen bzw. Fällungs-.'iachenbsreichen zugeführt wird, die immer weiter vor der achse entfernt liefen.

22. Ultruzer.trifufjierverfahren zur absatzweisen Fällung

ν)n Virusteilchen aus einer Flüssigkeits-Snspersion, dadurch _i'kenn20ich.net, dass die Fällung gleichzeitig oder nacheinander -!..if rr.ghrsren Fallu^^soberflachen in Berührung mit der Flüssig-⁷T-It und mit unterschiedlichen Abständen zur Rotationsachse durch- :y=führt wird, wobei die Füllungsstreoke kürzer ist als ein Viertel dor übrigen Dimensionen ^der jeweiligen Fällung3oberflächen und '] iss die zentripedale Beschleunigung auf weniger als das tausendfache eier iitandard-Erdanzlehungsbeschleunigung «irgestellt wird.

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