DE2042829C - Reagens zur Bestimmung der gamma Glutamyltranspeptidase - Google Patents

Description

Die Gründung betrifft ein Reagens zur Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidase, enthaltend y-Gliitamylp-Nitranilin. Glycylglycin, Puffer und ein oberflächenaktives Mittel.

In zunehmendem Maße wird die Bestimmung der j'-Glutamyltranspeptidase (y-GT) im klinisch-chemischen Labor zur Lrkennung von Leberkrankheiten durchgeführt. Diese Bestimmung erfolgt nach einem bekannten Verfahren nach der Reaktion:

y-Glutamyl-p-Nitranilin ί Glycylglycin -^-
p-Nitranilin : Glutamylglycylglycin.

Die Geschwindigkeit der Freisetzung des gelbgefärbten p-Nitranilins kann optisch verfolgt werden und ist ein Maß für die vorhandene Aktivität an y-GT.

Für eine routinemäßige Anwendung dieses Verfahrens ist die Instabilität und schlechte Löslichkeit des Substrates y-Glutamyl-p-Nitranilin ein schwerer Nachte'l. Diese Verbindung läßt sich nur schwer in Lösung bringen, und Lösungen sind nur sehr kurze Zeit haltbar. Fs war daher erforderlich, Abful'iingen jeweils nur für relativ wenige, innerhalb kurzer Zeil durchzuführende Bestimmungen herzustellen. Fine Aufbewahrung der Reagenslösungen war nicht möglich.

Der Frlindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Reagens zu schaffen, welches die obigen Nachteile nichl aufweist.

Die Frlindung beruht auf der überraschenden Auffindung der Tatsache, daß die kombinierte Anwendung von Polyvinylpyrrolidon zusammen mit einem oberflächenaktivem Mittel die l.öslichkeitseigenschaften und die Beständigkeit von y-Glutamyl-p-Nitranilin entscheidend verbessert.

Das erfindungsgemäße Reagens ?.ur Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidase, enthaltend y-Glulamylp-Nitranilin. Glycylglycin. Puffer und ein oberuächen-

aktives Mittel, ist gekennzeichnet durch einen Gehalt an Polyvinylpyrrolidon. I

In der deutschen Offenlegungsschrift 2 032 270 ist bereits der Vorschlag gemacht worden, ein diagnostisches Reagens für die Bestimmu ig von y-Glutamyi-

•■5 transpeptidase im menschlichen Serum zu verwenden, welches aus einer Kombination von -/-Glutaminsäure-p-nitroanilid, einem oder n-.ehreren amphoteren und nichtionischen oberflächenaktiven Mittel und einer Collidinpufferlösung, Borsäur-pufferlösung,

an 5.5-Diäthylbarbitursäurepufferlösiingoder Ammoniakpufferlösung besteht. Die erlindungsweseiitliche kombination von Polyvinylpyrrolidon mit einem oberflächenaktiven Mittel wird dort weder offenbart noch beansprucht.

Als oberflächenaktive Mittel können im erfindungsgemäßen Reagens solche verwendet werden, weiche keinen hemmenden oder inaktivierenden Eintluü auf lie y-Glutamyltranspeptidase ausüben. Als besonders geeignet erwiesen sich die Oxypolyäthoxyalkane, insbesondere ein Oxypolyäthoxydodeean.

Das ertindungsgemaße Mittel enthält das --GIutamyl-p-Nitranilin in gefriergetrockneter Form. Dieses kann zusammen mit den übrigen Bestandteilen des Mittels in fester Form vorliegen. Vorzugsweise besteht das erfindungsgemäße Reagens jedoch aus zwei Mischungen, von denen die eine y-Glutamylp-Nitranilm und Glycylglycin in gefriergetrockneter Form enthält und die andere aus einer wäßrigen Lösung besteht, welche der. Puffer, Polyvinylpyrroli-

4" don. das oberflächenaktive Mittel und gegebenenfalls das Azid enthält. Die beiden Mischungen sind je für sich sehr lange haltbar, und durch einfaches Mischen unier gelindem Erwärmen läßt sich rasch eine relativ stabile Lösuiig herstellen, die !,ingere Zeil gebrauchsfähig bleibt.

In der bevorzugten Ausführungsform enthält die wäßrige Lösung

0,05 bis 0.2 M Trispiiffer, pH 7,8 bis 8,2.
20 bis 100 g/l Polyvinylpyrrolidon,
0,75 bis 5 g/l oberflächenaktives Mittel

und gegebenenfalls
0,5 bis 4 g/l Azicl.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht die wäßrige Lösung aus

0.2 M Trispuffer, pH 8,0,
30 g/l Polyvinylpyrrolidon,
I g/l Oxypolyäihoxyalkan und
1 g/l Natriumazid.

Der zweite Bestandteil des erlindungsgemäßen Reage.is, die feste Mischung von y-GIutamyl-p-Nitranilin und Glycylglycin, einhält

1,0 bis 1.25 g y-Ci1111ainyI-p-NitraηiIiη und

5.0 bis 6,2 g Glycylglycin

je liter der flüssigen Reagenskcimponcnte.

Das erlindungsgemaße Reagens ermöglicht die Herstelllina \on gebrauchsfertigen Losungen zur Bestimmung der •/-Glutaimltranspeptidase. die längere Zeil gebrauchsfähig bleiben, im Gegensatz 7U den bisher bekannten Lösungen von y-Glutamvl-p-Nitranilin. die einerseits sehr schwer herstellbar w;>.ren und aus denen diese Verbindung nach der Herstellung nach kurzer Zeit wieder auskristallisierte. Das eriindungsgemälk Reagens schafft damit erstmalig die Möglichkeit, die y-Glulamyltranspeptidase- Bestimmung routinemäßig durchzuführen, hch pie'sweise in automatischen Analysegeräten.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung weiter.

Beispiel

Her_.i;llung des Reagens
a) Lyophilisiertes Substrat

o.84g v-Glutamyl-p-Nitranilin und 33,Sg Glycylglycin werden unter Erwärmen auf 70 bis 80°C in fi I bidestilliertem Wasser gelöst. Hie warme Lösung wird in Portionen zu je 3.0 ml in 20^ kleine Flaschen •abgefüllt, darin eingefroren und in üblicher Weise gefriergetrocknet. Die so erhaltenen Zubereitungen sind mindestens 12 Monate bei Raumtemperatur stabil.

bi HerstfMung der Pufferlösung

1^ι)3.5 g Tris-hydroxymethyl-ami 'amethan. 24Og Polyvinylpyrrolidon. Sg Oxyp ilyiithoxydodecan und N g Natriumazid werden in S 1 bidest^;'!iertem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit verdünnter Salzsaure auf pH 8.0 eingestellt. Die so erhaltene Lösung ist bei Raumtemperatur unbegrenzt haltbar.

c) Aktivitätsbestimmung der -/-Gluiamyltranspeptidase

Das wie unter a) beschrieben hergestellte Lyophilisat wird in 3 ml der nach b) hergestellten Lösung suspendiert und durch kurzes Erwärmen auf etwa 30 bis 40 C vollständig in Lösung gebracht. Dann läßt man die Lösung auf Zimmertemperatur abkühlen. Dem so erhaltenen, gebrauchsfertigen Reagens werden 0.2 ml einer Probelösimg (z. B. Serum) zugesetzt und durch mehrmalige Messung der Extinktion die Freisetzung des gelbgefärbten p-Nitranilins verfolgt, deren Geschwindigkeit ein Maß für die y-Glutamvltranspeptida>eaktivitäi ist.

d) Einfluß von PoIw inv!pyrrolidon (PVP) und O.vpolyäthoxydodecan (OPD) auf die Löslichkeit von y-Glutamyl-p-Nitranilid

!1,4g y-Gliitamyl-p-Nitranilid und 56.4 g Gljcylglvcin wurden unter Erwärmen auf 70 bis S0°C in 10 ! bidestilliertem Wasser gelöst. Die wärme Lösung wurde in Portionen zu je 3,0 ml in kleine Flaschen abgefüllt, eingefroren und gefriergetrocknet.

Mit den so erhaltenen Zubereitungen (Lyophilisate) wurden Lösungsversuche angestellt. Die Lyophilisate wurden bei 50 bis 70 C in 0.2 M Tris-Puffer, dera) keinen Zusatz, b) PVP und OPD in einem bestimmten Konzentrationsverhältnis enthielt, gelöst, die Lösung auf 25 C abgekühlt und die lösungsvermittelnden Eigenschaften von PVP und OPD durch Messung der Trübung (% Lichtdurchlässigkeit) bzw. Beobachtung des «.ristallisationsix-itpunktes festgestellt.

Anfang

Nach 3 Stunden
Nach 6 Stunden'
Nach 24 Stunden
Nach 2 Tagen . . .
Nach 6 Tagen ...

°'„ PVP

0 I 3

»,„ OPD

0 j 1

85°/,
60 °',
50°/,

2ü°;₀

Kristallisation
Kristallisation

84%
85^Ü/_O
84 ⁰Z₀
84 "/„

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Reagens zur Bestimmung der y-Glutamyltranspjpiida.se. enthaltend ;.'-Gluiam> l-p-Nitranilin. Glvcv !glycin. Puller und ein oberflächenaktives Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Polyvinylpyrrolidon.

2. Reagens naeli Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich ein Azid enthält.

-V Reagens nach Anspr ich 1 oder 2. dadurch «kennzeichne!, daß es als oberflächen^-iives Mittel ein O.xypo'yäthoxyalkan enthält.

4. Reagens nach Anspruch 2 oder 3. bestellend aus

A) 0.0? bis 0.2 M Trispiiffer. pH 7,X bis S.2.
20 his iOOg I Polyvin;.!pyrrolidon.

0.75 bis 5 g I oberflächenaktives Mittel.

0.5 bis 4 g I Azid

in Form einer wäßrigen Lösung und

B) einer gefriergetrockneten Mischung von

1 bis 1.25g 1 y-Glutamyl-p-Nitranilin und
5 bis 6.2 g I GKcv !glycin
in vor Gebrauch unvermischbarem Zustand.

5. Reagens nach Anspruch 4. bj'tehend aus

Λ) 0.2 M TnspiifTer. pH S.O.
30s: ι Polyvinylpyrrolidon.

1 g I Oxypolyäihoxyalkan.

1 g I Natnumazid
in Form einer wäßrigen Lösung und

B) 1.13 g y-Glutamyl-p-Niiranilin und
5.6 g Glycylglycin
je I der Lösung A).