DE2042829B2 - Reagens zur bestimmung der gamma-glutamyltranspetidase - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Reagens zur Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidase, enthaltend y-Glutamylp-Nitranilin, Glycylglycin, Puffer und ein oberflächenaktives Mittel.

In zunehmendem Maße wird die Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidase (y-GT) im klinisch-chemischen Labor zur Erkennung von Leberkrankheiten durchgeführt. Diese Bestimmung erfolgt nach'-'einem bekannten Verfahren nach der Reaktion: ' ·

y-Glutamyl-p-Nitranilin + Glycylglycin =?= ■ , p-Nitranilin -f- Glutamylglycylglycin. '!;■; ,.·-.■ ;

Die Geschwindigkeit der Freisetzung des gelbgefärbten p-Nitranilins kann optisch verfolgt werden und ist ein Maß für die vorhandene Aktivität an y-GT.

Für eine routinemäßige Anwendung dieses Verfahrens ist die Instabilität und schlechte Löslichkeit des Substrates y-Glutamyl-p-Nitranil>n ein schwerer Nachteil. Diese Verbindung läßt sich nur schwer in Lösung bringen, und Lösungen sind nur sehr kurze Zeit haltbar. Es war daher erforderlich, Abfüllungen jeweils nur für relativ wenige, innerhalb kurzer Zeit durchzurührende Bestimmungen herzustellen. Eine Aufbewahrung der Reagenslösungen war nicht möglich.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Reagens zu schaffen, welches die obigen Nachteile nicht aufweist.

Die Erfindung beruht auf der überraschenden Auffindung der Tatsache, daß die kombinierte Anwendung von Polyvinylpyrrolidon zusammen mit einem oberflächenaktivem Mittel die Löslichkeitseigenschaften und die Beständigkeit von y-Glutamyl-p-Nitraniiin entscheidend verbessert.

Das erfindungsgemäße Reagens zur Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidase, enthaltend y-Glutamylp-Nitranilin, Glycylglycin, Puffer und ein oberflächenaktives Mittel, ist gekennzeichnet durch einen Gehalt an Polyvinylpyrrolidon.

In der deutschen Offenlegungsschrift 2 032 270 ist bereits der Vorschlag gemacht worden, ein diagnostisches Reagens für die Bestimmung von y-Glutamyltranspeptidase im menschlichen Serum zu verwenden, welches aus einer Kombination von y-Glutaminsäure-p-nitroanilid, einem oder mehreren amphoteren und nichtionischen oberflächenaktiven Mittel und einer Collidinpufferlösung, Borsäurepufferlösung, 5,5-Diäthylbarbitursäurepufferlösung oder Ammoniakpufferlösung besteht. Die erfindungswesentliche Kombination von Polyvinylpyrrolidon mit einem oberflächenaktiven Mittel wird dort weder offenbart noch beansprucht.

Als oberflächenaktive Mittel können im erfindungsgemäßen Reagens solche verwendet werden, welche keinen hemmenden oder inaktivierenden Einfluß auf die y-Glutamyltranspeptidase ausüben. Als besonders geeignet erwiesen sich die Oxypolyäthoxyalkane, insbesondere ein Oxypolyäthoxyddecan.

Das erfindungsgemäße Mittel enthält das y-Glutamyl-p-Nitranilin in gefriergetrockneter Form. Dieses kann zusammen mit den übrigen Bestandteilen des Mittels in fester Form vorliegen. Vorzugsweise besteht das erfindungsgemäße Reagens jedoch aus zwei Mischungen, von denen die eine y-Gl'_'.amylp-Nitranilin und Glycylglycin in gefriergetrockneter Form enthält und die andere aus einer wäßrigen Lösung besteht, welche den Puffer, Polyvinylpyrrolidon, das oberflächenaktive Mittel und gegebenenfalls das Azid enthält. Die beiden Mischungen sind je für sich sehr lange haltbar, und durch einfaches Mischen unter gelindem Erwärmen läßt sich rasch eine relativ stabile Lösung herstellen, die längere Zeit gebrauchsfähig bleibt.

In der bevorzugten Ausführungsform enthält die wäßrige Lösung

0,05 bis 0,2 M Trispuffer, pH 7,8 bis 8,2,
20 bis 100 g/l Polyvinylpyrrolidon,
0,75 bis 5 g/l oberflächenaktives Mittel

und gegebenenfalls
0,5 bis 4 g/l Azid.

In einer besonders bevorzugten Ausführtingsform besteht die wäßrige Lösung aus

0,2 M Trispuffer, pH 8,0.
30 g/l Polyvinylpyrrolidon,
1 g/l Oxypolyäthoxyalkan und
1 g/l Natriumazid.

Der zweite Bestandteil des crfindungsgemäßen Reagens, die feste Mischung von y-Glutamyl-p-Nitranilin und Glycylglycin, enthält

1,0 bis 1,25 g y-Glutamyl-p-Nitraniiin und

5.0 bis 6,2 g Glycylglycin

je Liter der flüssigen Reagenskomponente.

Das erfindungsgemäße Reagens ermöglicht die Herstellung von gebrauchsfertigen Lösungen zur Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidase, die längere Zeit gebrauchsfähig bleiben, im Gegensatz zu den bisher bekannten Lösungen von y-Glutamyl-p-Nitranilin, die einerseits sehr schwer herstellbar waren und aus denen diese Verbindung nach der Herstellung nach kurzer Zeit wieder auskristallisierte. Das erfindungsgemäße Reagens schafft damit erstmalig die Möglichkeit, die y-Glutamyltranspeptidase-Bestimmung routinemäßig durchzuführen, beispielsweise in automatischen Analysegeräten.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung weiter..

Beispiel

Herstellung des Reagens
a) Lyophilisiertes Substrat

6,84 g y-GIutamyl-p-Nitranilin und 33,8 g Glycylglycin werden unter Erwärmen auf 70 bis 80° C in 6 1 bidestilliertem Wasser gelöst. Die warme Lösung wird in Portionen zu je 3,0 ml in 200 kleine Flaschen abgefüllt, darin eingefroren und in üblicher Weise gefriergetrocknet. Die so erhaltenen Zubereitungen sind mindestens 12 Monate bei Raumtemperatur stabil.

b) He-stellung der Pufferlösung

193,5 g Tris-hydroxymethyl-minomethan, 240 g Polyvinylpyrrolidon, 8 g Polyäthoxydodecan und 8 g Natriumazid werden in 8 1 bklesti!^rertem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit verdünnter Salzsäure auf pH 8,0 eingestellt. Die so erhaltene Lösung ist bei Raumtemperatur unbegrenzt haltbar.

c) Aktivitätsbestimmung der y-Glutamyltranspeptidase

Jo

Das wie unter a) beschrieben hergestellte Lyophilisat wird in 3 ml der nach b) hergestellten Lösung suspendiert und durch kurzes Erwärmen auf etwa 30 bis 40°C vollständig in Lösung gebracht. Dann läßt man die Lösung auf Zimmertemperatur abkühlen. Dem so erhaltenen, gebrauchsfertigen Reagens werden 0,2 ml einer Probelösung (z. B. Serum) zugesetzt und durch mehrmalige Messung der Extinktion die Freisetzung des gelbgefärbten p-Nitranilins verfolgt, deren Geschwindigkeit ein Maß für die y-GIutamyltranspeptidaseaktivität ist.

d) Einfluß von Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Oxypolyäthoxydodecan (OPD) auf die Löslichkeit von

y-Glutamyl-p-Nitranilid

11,4 g y-Glutamyl-p-Nitranilid und 56,4 g Glycylglycin wurden unter Erwärmen auf 70 bis 80°C in 101 bidestilliertem Wasser gelöst. Die warme Lösung wurde in Portionen zu je 3,0 ml in kleine Flaschen abgefüllt, eingefroren und gefriergetrocknet.

Mit den so erhaltenen Zubereitungen (Lyophilisate) wurden Lösungsversuche angestellt. Die Lyophilisate wurden bei 50 bis 70° C in 0,2 M Tris-Puffer, der a) keinen Zusatz, b) PVP und OPD in einem bestimmten Konzentrationsverhältnis enthielt, gelöst, die Lösung auf 25° C abgekühlt und die lösungsvermittelnden Eigenschaften von PVP und OPD durch Messung der Trübung (% Lichtdurchlässigkeit) bzw. Beobachtung des Kristallisationszeitpunktes festgestellt.

Anfang

Nach 3 Stunden
Nach 6 Stunden
Nach 24 Stunden
Nach 2 Tagen ..
Nach 6 Tagen ..,

% PVP	0	°/0 OPD	0	3
85%
60%	1
5ΰ%	84%
20%	85%
Kristallisation	84%
Kristallisation	84%
	82%
78%

Claims (5)

Patentanspräche:

1. Reagens zur Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidase, enthaltend y-Glutamyl-p-Nitranilin, Glycylglycin, Puffer und ein oberflächenaktives Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Polyvinylpyrrolidon.

2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich ein Azid enthält.

3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es als oberflächenaktives Mittel ein Oxypolyäthoxyalkan enthält.

4. Reagens nach Anspruch 2 oder 3, bestehend aus

A) 0,05 bis 0,2 M Trispuffer, pH 7,8 bis 8,2, 20 bis 100 g/l Polyvinylpyrrolidon, 0,75 bis 5 g/l oberflächenaktives Mittel, 0,5 bis 4 g/l Azid

in Form einer wäßrigen Lösung und

B) einer gefriergetrockneten Mischung von

1 bis 1,25 g/l y-Glutamyl-p-Nitranilin und 5 bis 6,2 g/l Glycylglycin in vor Gebrauch unvermischbarem Zustand.

5. Reagens nach Anspruch 4, bestehend aus

A) 0,2 M Trispuffer, pH 8,0, 30 g/l Polyvinylpyrrolidon, 1 g/l Oxypolyäthoxyalkan. 1 g/l Natriumazid
in Form einer wäßrigen Lösung und

B) 1,13 g y-Glutamyl-p-Nitranilin und .,ίι::.- ■'■-. 5,6 g Glycylglycin

je 1 der Lösung A).